Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
تحديد طريقة عمل المواد الكيميائية الحيوية النشطة هي التي تهم مجموعة واسعة من الأكاديمية، والمستحضرات الدوائية، والعلماء الصناعي. خميرة الخباز، أو في مهدها الخميرة، هو حقيقي النواة نموذج الذي مجموعة كاملة من ~ 6،000 المسوخ حذف الجينات وhypomorphic الجين ضروري تتوفر تجاريا المسوخ. هذه المجموعات من المسوخ يمكن استخدامها للكشف عن منهجية التفاعلات الكيميائية الجينات، أي الجينات اللازمة لتحمل مادة كيميائية. هذه المعلومات، بدوره، تقارير عن الوضع المحتمل لعمل المجمع. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في مهدها الخميرة. ونحن لشرح طريقة استخدام وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU)، والتي لديها آلية واضحة المعالم للعمل. نتائجنا تظهر أن TRAMP النووي RNA وهناك حاجة exosome وإصلاح الحمض النووي الانزيمات لانتشار في وجود 5-FU، وهو ما يتسق مع م السابقicroarray النهج الترميز شريط الكيميائية الوراثية على أساس ومعرفة أن 5-FU يؤثر سلبا على كل من RNA والحمض النووي الأيض. كما وصف بروتوكولات المصادقة المطلوب من هذه الشاشات عالية الإنتاجية.
وقد مكنت الأدوات والموارد المتاحة في الكائن الحي نموذج خميرة الخباز الوراثية واسعة النطاق علم الجينوم وظيفية الدراسات التي توفر مجتمعة نظرة جديدة في كيفية عمل الجينات كشبكات للوفاء بمتطلبات النظم البيولوجية. وكان حجر الزاوية في هذه الأدوات إنشاء تعاونية من مجموعة كاملة من الجينات الحذف غير الضرورية من جميع الأطر القراءة المفتوحة في الخميرة 1،2. ومن الملاحظات اللافتة التي فقط ~ 20٪ من جينات الخميرة ويلزم للبقاء عندما نمت كما haploids تحت ظروف المختبر القياسية. هذا يسلط الضوء على قدرة خلية لالعازلة ضد الاضطرابات الجينومية من خلال الاستفادة من المسارات البيولوجية البديلة. المسوخ الوراثية التي هي قابلة للتطبيق بشكل فردي، ولكن قاتلة في الجمع، وإشارة مسارات بيولوجية موازية متصلة أو متقاربة وتشكيل شبكات التفاعل الجينية التي تصف الوظيفة البيولوجية. مع تطور الشركة المصرية للاتصالات الشرطيةالأليلات mperature الحساسة وhypomorphic من الجينات الأساسية التكنولوجيا لم تقتصر على دراسة الجينات غير الضرورية 3،4. وقد تم تطبيق هذا المفهوم على نطاق الجينوم انتاج منحازة خريطة التفاعل الجيني توضح كيف تتجمع الجينات المسؤولة عن العمليات الخلوية المتشابهة معا 5.
الاضطرابات الكيميائية للشبكات الوراثية الجينات الحذف تقليد (الشكل 1) 6. الاستعلام عن المركبات النمو المثبطة ضد مجموعة عالية الكثافة من سلالات الحذف لفرط الحساسية يحدد لمحة التفاعل الكيميائي الوراثية، أي قائمة من الجينات المطلوبة لتحمل الإجهاد الكيميائية. مثل التفاعلات الوراثية، وقد أظهرت شاشات واسعة النطاق من المكتبات الكيميائية التي المركبات مع وضع مماثل من كتلة العمل معا 7. ولذلك، من خلال إنشاء الملف الشخصى التفاعل الكيميائي الوراثية من مركب يمكن الاستدلال على طريقة عمل عن طريق مقارنتها مع لارجنرال الكتريك نطاق التفاعل الجيني الوراثي والكيميائي الاصطناعية مجموعات البيانات 8،9.
وقد أجريت شاشات الكيميائية الوراثية على نطاق واسع، حيث يتم استجواب العشرات من المركبات، من خلال فحوصات المنافسة الباركود. في هذا النهج، ويزرع جمع المجمعة من سلالات الحذف بشكل جماعي لعدة أجيال في حجم صغير وسائل الإعلام التي تحتوي على مادة كيميائية. لأن كل متحولة الحذف المرافئ الباركود وراثية فريدة من نوعها، يتم تعقب الجدوى / نمو المسوخ الفردية داخل بركة من سلالات الحذف من قبل ميكروأري أو عالية الإنتاجية تسلسل 10.
استنتاج اللياقة البدنية من خلال رصد حجم مستعمرة من المسوخ العريض جسديا نمت على أجار الصلبة التي تحتوي على مركب النشطة بيولوجيا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد التفاعلات الكيميائية الوراثية 11،12. ويوفر هذا النهج بديلا فعالا من حيث التكلفة لفحص القائم على المنافسة ومناسب تماما لمعايرة مكتبات صغيرة من المواد الكيميائية.المبين هنا هو منهجية بسيطة لإنتاج قائمة من التفاعلات الكيميائية الوراثية في S. الخباز أن لا تعتمد على التلاعب الجزيئية علم الأحياء أو البنية التحتية. ويتطلب سوى جمع الخميرة الحذف، جهاز التدبيس الروبوتية أو اليدوي، ومتاحة بحرية برنامج تحليل الصور.
المبين هنا هو نهج لتوليد ملامح التفاعل الكيميائي الوراثية. وطريقة بسيطة: من خلال مقارنة أحجام مستعمرة من كل سلالة في مجموعات الحذف الجين شاملة في وجود وعدم وجود مادة كيميائية، ويتم تحديد جميع الجينات اللازمة لتحمل إهانة الكيميائية. ويمكن بعد ذلك استخدام تحليل تخصيب …
The authors have nothing to disclose.
ويدعم البحوث في المختبر CJN من المنح التي تعمل من NSERC، المعهد الكندي للسرطان جمعية أبحاث (CCSRI)، والثدي المؤسسة الكندية للسرطان (فرع BC-يوكون).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
Alternative Pinning Tools: | |||
Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |