Aquí, la monitorización en tiempo real del metabolismo de las células tumorales, combinada con un modelo de metástasis de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo in vivo, se utiliza para evaluar nuevos objetivos/agentes anticancerígenos por su capacidad para sensibilizar las células tumorales a los quimioterapéuticos que dañan el ADN.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización
En este artículo
Resumen
Resumen
Debido al alto nivel de heterogeneidad y las mutaciones inherentes en los cánceres humanos, las terapias con agentes individuales, o regímenes de combinación que se dirigen a la misma vía, son propensos a fallar. Se debe poner énfasis en la inhibición de las vías que son responsables de la resistencia intrínseca y / o de adaptación a la terapia. Un campo activo de investigación es el desarrollo y prueba de los inhibidores de reparación del ADN que promueven la acción de, y prevenir la resistencia a, comúnmente utilizado la quimioterapia y la radioterapia. Se utilizó un nuevo protocolo para evaluar la eficacia de la inhibición de BRCA2 como un medio para sensibilizar a las células tumorales al medicamento cisplatino que daña el ADN. Metabolismo de la célula tumoral (la acidificación y la respiración) se monitorizó en tiempo real por un período de 72 horas para delinear la efectividad del tratamiento en un minuto a minuto. En combinación, se realizó una evaluación de la frecuencia metastásica utilizando una membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM) modelo de la extravasación y la invasión. Esteprotocolo aborda algunas de las debilidades de los comúnmente utilizados in vitro y métodos in vivo para evaluar los regímenes de terapia del cáncer novedosas. Se puede utilizar además de los métodos comunes tales como ensayos de proliferación celular, ensayos de muerte celular, y estudios in vivo de xenoinjertos murinos en, discriminar más estrechamente entre los objetivos de candidatos y agentes, y seleccionar sólo los candidatos más prometedores para el desarrollo futuro.
Introducción
Resistencia al objetivo y / o el tratamiento del cáncer citotóxica es un problema clínico importante que puede conducir al fracaso del tratamiento, recaída adquirida, y el aumento de la mortalidad del paciente 1. Dado el alto nivel de heterogeneidad en la mayoría de los tumores, es una certeza matemática que un tumor del número de células suficientemente alto contendrá un subconjunto de células resistentes a las terapias simples o combinadas dirigidas a las vías moleculares en que dichas células dependen para su supervivencia 2,3. Tales células tumorales pueden ser seleccionados positivamente para durante el tratamiento, dando lugar a recurrenci....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: El siguiente protocolo fue diseñado para su uso con células adherentes. Se requieren modificaciones para aplicar el método a las células no adherentes cultivadas en suspensión. Los experimentos CAM descritos en el protocolo están diseñados para su uso con las células que expresan un marcador fluorescente (por ejemplo, GFP, RFP, etc.). Nueve días embriones de pollo de edad se requieren en el día 2 del protocolo experimental para los experimentos CAM.
1. Preparación y transfección de células tumorales con oligonucleótidos antisentido (ASO)
- Aspirar medio de T75 frasco (s) que contiene células de interés, la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Resultados y cifras adaptadas con permiso de trabajo publicado 22.
BRCA2 inhibición induce una disminución en la respiración en las células tumorales tratadas con cisplatino
Las células del cáncer de pulmón humano A549 tratados con BRCA2 de metas ASO y cisplatino exhibido una disminución temprana e irreversible en la respiración, en comparación con las células que recibieron el control de ASO y cisplatino solo; después de 24 h de tratamiento c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Debido al coste inherente y el riesgo asociado con los ensayos clínicos, hay una necesidad de desarrollar una mejor y más rigurosa metodología de prueba pre-clínica para evaluar adecuadamente los regímenes de tratamiento contra el cáncer novedosas. Las técnicas actuales de uso común todas las debilidades de exposición que pueden limitar su capacidad para discriminar entre objetivos / agentes terapéuticos potencialmente prometedoras, y aquellos que pueden ser menos eficaces. Hemos elaborado un protocolo para evaluar nuev.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido posible gracias a las subvenciones a JK de los Centros de Excelencia de Ontario y el Fondo de Investigación de Ontario.
Nos gustaría dar las gracias a Siddika Pardhan y el Dr. Peter Ferguson para la asistencia técnica durante el rodaje.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células A549 | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| Película AeraSeal | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Oligodesoxinucleótidos antisentido | Avecia | BRCA2 secuencia diana: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscopio | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips Bionas | GmbH y Micronas GmbH | BIS8001D | |
| sistema Bionas Discovery 2500 | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatino | Sigma Aldrich 479306 | ||
| Huevos de gallina fertilizados De | origen local | ||
| Suero fetal bovino | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Tecnologías de la Vida | 12566014 http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html | |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Tripsina (0,25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
Referencias
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
