Aquí, presentamos un protocolo para la infusión cerebral estereotáxica directa de beta-amiloide. Esta metodología proporciona un modelo de ratón alternativo in vivo para abordar los efectos a corto plazo de la beta-amiloide en las neuronas cerebrales.
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Artículo de método
Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la población que envejece. Una característica clave neuropatológico de la enfermedad es la sobre-producción de beta-amiloide y la deposición de placas de amiloide-beta en regiones del cerebro de los individuos afectados. A lo largo de los años los científicos han generado numerosos modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer que intentan replicar la patología amiloide-beta. Por desgracia, los modelos de ratón solamente imitan selectivamente las características de la enfermedad. La muerte neuronal, un efecto prominente en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, se carece notablemente en estos ratones. Por lo tanto, nosotros y otros han empleado un método de infundir directamente especies oligoméricas solubles de beta-amiloide - formas de beta-amiloide que se han demostrado para ser más tóxico para las neuronas - estereotáxicamente en el cerebro. En este informe utilizamos machos C57BL / 6J para documentar esta técnica quirúrgica de aumento de los niveles de amiloide-beta en una región del cerebro seleccione. Losobjetivo de infusión es el giro dentado del hipocampo, porque esta estructura cerebro, junto con el cerebro anterior basal que está conectada por el circuito colinérgica, representa una de las áreas de degeneración en la enfermedad. Los resultados de la elevación de la beta-amiloide en el giro dentado mediante infusión estereotáxico revelan aumentos en la pérdida de neuronas en el giro dentado dentro de 1 semana, mientras que hay un incremento concomitante en la muerte celular y la pérdida de neuronas colinérgicas en el miembro vertical de la banda diagonal de Broca del cerebro anterior basal. Estos efectos se observan hasta 2 semanas. Nuestros datos sugieren que el actual modelo de infusión de amiloide-beta ofrece un modelo de ratón alternativa para hacer frente a la muerte de neuronas región específica en una base a corto plazo. La ventaja de este modelo es que el amiloide-beta puede ser elevado en una forma espacial y temporal.
Introducción
Depósitos de placa amiloide, que se componen de beta-amiloide (Aß 1-42), son una característica clave de la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Numerosos estudios han demostrado que los niveles elevados o tóxicos de oligomérica recombinante Aß 1-42 suscitar la muerte neuronal, distrofia sináptica, la pérdida y disfunción; así como los déficit de aprendizaje y memoria 1-4. Las regiones del cerebro afectadas incluyen el hipocampo, la corteza y las estructuras subcorticales tales como el cerebro anterior basal y el 5,6 amígdala. Hasta la fecha, hay varios modelos de ratones transgénicos que intentan simular la Aß
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Protocolo
Nota: Para todos los experimentos con animales, institucional y directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos.
1. Preparar instrumentos quirúrgicos y soluciones para la cirugía
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable.
- Preparar etanol al 70% por dilución de 200 a prueba de etanol absoluto con el grado molecular de agua desionizada destilada estéril.
- Coloque la aguja G 29 a la jeringa Hamilton. Limpie el interior de Hamilton jeringa y la aguja mediante la elaboración y el agua nanopura expulsión repetidamente durante 1 min. Repita este procedim....
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Resultados
El presente método de preparación humana recombinante oligomérica 1-42 produce especies oligoméricas solubles que consiste en monómeros, dímeros, trímeros, y tetrámeros (Figura 1A). Estos especies de bajo peso molecular 1-42, pero no las fibrillas y placas, se ha demostrado en numerosos entornos para ser más tóxico para las neuronas 1,4,9,17-19. Para determinar si es o no oligómeros Aß 1-42 induce la muerte de las neuronas en el cerebro del ratón Aß 1-42<.......
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Discusión
Para lograr un éxito Aß 1-42 inyección experimentador o cirujano debe: 1) utilizar una técnica aséptica; 2) identificar correctamente la región del cerebro de intereses con coordenadas precisas; 3) ser capaz de asegurar adecuadamente el ratón en el marco estereotáxico con el cerebro nivelado en el eje AP y ML; 4) tener la capacidad de operar el micromanipulador con precisión; 5) garantizar la atención postoperatoria adecuada. Si se siguen estos pasos clave del ratón debe sobrevivir a la cirugía sin infección .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares conceder NS081333 (a CMT), Asociación de Alzheimer subvención NIRG-10-171721 y el Instituto Nacional de Salud Mental de subvención MH096702 (a UH), y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento financiados Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Centro de la Universidad de Columbia subvención piloto AG008702 (a YYJ y JB).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ketamina HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg de ketamina por 1 kg de animal |
| Xilacina (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | no disponible | 10 mg de xilacina por 1 kg de animal |
| Buprenex (0,3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0,1 mg de buprenex por 1 kg de animal |
| Aβ 1-42 | David Teplow/UCLA | no disponible | 100 μ M; Este amiloide se utilizó en el artículo |
| Aβ 1-42 | Bachem | H-1368 | Se puede utilizar en lugar de amiloide del laboratorio Teplow |
| Aβ 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Se puede utilizar en lugar de amiloide del laboratorio Teplow |
| Scrambled A y beta; 1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Se puede utilizar como péptido de control para comparar A y beta; 1-42 |
| Anticuerpo NU4 (anticuerpo oligomérico amiloide) | Regalo de William Klein/Northwestern U. | no disponible | 1:2,000 dilución |
| Anticuerpo oligomérico anti-amiloide (Conejo policlonal) | EMD Millipore | AB9234 | Puede usarse en lugar de Nu4; necesita ser probado por el usuario final |
| Anticuerpo 6E10 (ratón monoclonal) (anticuerpo amiloide) | Biolegend | sig-39320 | dilución 1:1,000 |
| Anticuerpo ChAT (cabra policlonal) | Millipore | AB144P | dilución 1:100 |
| DeadEnd Sistema fluorométrico TUNEL | Promega | G3250 | Siga las instrucciones del fabricante para use |
| el reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI | Invitrogen | P36935 | Úselo cuando cubra portaobjetos deslizantes |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | no disponible | Solución al 2% |
| Etanol absoluto (200 grados) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Para hacer etanol al 70% para higienizar y desinfectar |
| Novex 10-20% Gel de tricina | Life Technologies EC6625BOX | Para separar A y beta; 1-42 | |
| Novex Tricine SDS Tampón de funcionamiento (10X) | Life Technologies | LC1675 | Para ejecutar geles de tricina al 10-20% |
| Tampón de transferencia de tris-glicina Novex (25X) | Life Technologies | LC3675 | Para transferir geles de tricina al 10-20% SuperSignal |
| Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | Para mejorar A y beta; señal 1-42; siga el protocolo del fabricante |
| Protran BA79 Membrana de transferencia de nitrocelulosa, 0.1 μ m | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | Para transferir 10-20% de tricina geles |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Aparatus de electroforesis para correr 10-20% de tricina geles |
| GenTeal Lubricante Eye Gel | Novartis | no disponible | Para mantener los ojos del ratón húmedos durante la cirugía; se puede encontrar en las farmacias locales |
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| Refresh Gotas Oftálmicas Lubricantes Optivas | Allergan | no disponible | Para mantener los ojos del ratón húmedos durante la cirugía; se puede encontrar en las farmacias locales; Se puede usar en lugar de GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | para higienizar y desinfectar |
| espátula redonda / cónica | VWR | 82027-490 | Para abrir la boca |
| de los animales Bulldog Serrefines Clamps (Dims. Jaw 9X1,6 mm; Longitud 28 mm) | Herramientas de ciencia fina | 18050-28 | Opcional; Para mantener la piel del cuero cabelludo separada durante la inyección |
| Tijeras finas rectas (filo de corte de 25 mm; Longitud 11,5 cm) | Herramientas de ciencia fina | 14060-11 | Para cortar cuero cabelludo |
| #3 Mango de bisturí | Herramientas de ciencia fina | 10003-12 | |
| #11 Cuchilla quirúrgica Herramientas de | ciencia fina | 10011-00 | Para hacer incisión en el cuero cabelludo |
| Pinza de patrón estándar para estudiantes (punta dims. 2.5x1.5 mm; Longitud 11,5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | Para mantener el cuero cabelludo cerrado durante la sutura |
| Trimmer Combo Kit Kent | Scientific | CL9990-1201 | Para afeitar el pelo |
| T/Bomba Recirculador de agua tibia | Kent Scientific | TP-700 | Para calentar animales durante la cirugía |
| Almohadilla de minería de guerra reutilizable (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | Para conectarlo al recirculador de agua tibia T/Pump para calentar al animal durante la cirugía |
| Micro Taladro Inalámbrico | Stoelting | 58610 | Utilice rebabas de acero de 0,8 mm para perforar agujeros en el cráneo |
| Instrumento estereotáxico estándar de laboratorio con ratón y Adaptador para ratas neonatales | Stoelting | 51615 | |
| solo para ratón Stoelting de instrumentos estereotáxicos | 51730 | Puede usar esto en lugar de Stoelting Cat. #51615 | |
| Inyector estereotáxico por excelencia | Stoelting | 53311 | |
| Esterilizador de perlas de vidrio seco | Stoelting | 50287 | Para esterilizar instrumentos de acero inoxidable |
| Paño quirúrgico estéril (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Jeringa Hamilton 50 ml, Modelo 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | Para inyección cerebral; use diferentes jeringas para diferentes soluciones |
| Aguja 29 G, cubo pequeño RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | Para acoplar a la jeringa Hamilton para inyección cerebral |
| 1 ml BD Jeringas de tuberculina | VWR BD309659 | Para administrar anestesia y solución salina | |
| Aguja de 30 g (0,5") | VWR | BD305106 | Para administrar anestesia y solución salina |
| Báscula electrónica portátil de la serie CS (Ohaus) | VWR | 65500-202 | Para pesar animales para determinar la dosis de anestesia |
| Placa calefactora (placa superior Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | Para calentar animales después de la cirugía |
| Sofsilk Sutura de seda C-1 Corte 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | Para el cierre de heridas |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Opcional: para ayudar en el cierre de heridas; Úselo con sutura. |
| Aplicadores estériles de eje de madera con punta de algodón | Fisher scientific | 22-029-488 | Para la limpieza y el secado de heridas |
| quirúrgicas Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | Para la recogida de secciones cerebrales |
| VWR Micro Cover Glass 24 x 50 mm | VWR | 48393241 | Para el montaje de portaobjetos de microscopio |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μ m | Fisher Scientific | 194-2520 | Para esterilizar solución salina |
| Marcadores cutáneos estériles de doble punta de Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | Para marcar coordenadas en el cráneo |
Referencias
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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Reimpresiones y permisos
