Protocol
1. Forberedelse Materialer
- Forbered 10 mM HEPES-buffer. Justere pH til 7,0 ved stuetemperatur, og der tilsættes NaCl til 0,9%.
- Forbered 5% alginat-opløsning og 10 mM EDTA-opløsning ved at blande HEPES-bufret saltvand fremstillet i 1.1. Justere pH til 7,0 ved stuetemperatur.
- Autoklaver reagenserne (1.1, 1.2) i 20 minutter ved 121 ° C.
- Forbered gelatineovertrukne 60 mm skåle belagt med 1,2-2,0 × 10 6 mus embryonisk fibroblast (MEF) celler, der behandles som feeder-celler ved inkubering i DMEM indeholdende 10% ES-kvalificerede FBS og 10 ug / ml mitomycin C i 90 - 120 min.
- Opretholde mus induceret pluripotente stamceller (IPS) celler på skålen med feeder-celler i nærvær af 5 ml DMEM høj glucose indeholdende 20% af ES-kvalificeret FBS, 50 uM 2-mercaptoethanol, non-essentielle aminosyrer, og antibiotika ( 100 enheder / ml penicillin G natrium, 100 ug / ml streptomycinsulfat og 250 ng / ml amphotericin B).
- Seed 4 × 10 5 iPS celler på en gelatine-coatede 60 mm skål og inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre dyrkningsmediet hver dag under inkubation. Efter 3 - 4 dages dyrkning Trypsinisér cellerne i 1 min med 500 pi 0,05% trypsin indeholdende 0,02% EDTA ved 37 ° C og 5% CO2. Efter dette, løsnes cellerne ved at trykke dyrkningsskålen ti gange.
- Tilføj 2,5 ml DMEM med 10% af ES-kvalificerede FBS og antibiotika (efter dissociation mus iPS celler i enkelte celler ved pipettering med 1.000 pi mikropipette tre gange) centrifuge cellesuspension ved 160 × g i 3 min og fjern supernatanten og tælle cellerne . Efter celletælling, reseed de indsamlede celler på et gelatineovertrukket skål og inkuberes i 30 min for at isolere iPS celler fra MEF celler. Efter optælling af cellerne (normalt 1-3 × 10 6 celler / skål kan indsamles), reseed 4 × 10 5 iPS celler påfadet.
2. Cell Indkapsling i Alginat Hydrogel Kapsler
- Opsamle cellerne ved den samme procedure som beskrevet i 1.5 og 1.6. Efter centrifugering ved 160 x g i 3 min, vask IPS cellepelleten med HEPES saltvand tre gange. Efter re-suspension af cellerne i HEPES-bufret saltvand, filtreres cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter for at fjerne store aggregater, der ellers kunne tilstoppe dysen.
- Bland 2 ml cellesuspension i HEPES-bufret saltvand og 3 ml 5% Alg-Na-opløsning. Endelig 5 ml cellesuspension indenfor 3% Alg-Na opløsning opnås. Celledensitet er ønskeligt mere end 10 6 celler / ml.
- Efter opsamling af cellesuspensionen i en 5 ml sprøjte, installere en koaksial dyse (figur 1A, B) på sprøjten og sætte dem på sprøjtepumpe. Emit N2 gasstrøm (lavere end 1L / min) gennem den ydre nål koaksial dyse ogudvise cellesuspensionen gennem den indre dyse.
- Indsamle dråber i 250 ml 0,5% CaCl2-opløsning og vent 10 - 20 min for gelering under omrøring ved 60-90 opm.
3. Behandling af Alginat Kapsler (valgfrit)
- Inkuber Alg-Ca-kapsler i 0,05% (vægt / volumen) poly-L-lysin (PLL) opløsning i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter vask af kapsler med HEPES-bufret saltvand, inkuberes dem i DMEM indeholdende 10% FBS for at neutralisere den elektriske ladning på deres overflade. Udnytte dem som coatede kapsler (figur 1C).
- Inkubér kapslerne i HEPES-bufret saltvand indeholdende 10 mM EDTA i 5 minutter. EDTA-behandlede kapsler anvendes som hule kapsler (figur 1C).
4. Kultur og indsamle Celler i alginat Kapsler
- Inkubere de indkapslede celler ved 75 rpm under omrystning ved 37 ° C og 5% CO2i 10 dage.
- Indsamle og inkuberes kapslerne i 10 mM EDTA ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 minutter. Indsamle celler fra alginat kapsler uden PLL behandling ved centrifugering ved 1000 x g i 3 min.
- Hvis alginatkapsler behandles med PLL, bryde Alg-PLL membran ved pipettering op og ned omkring ti gange med en nål fastgjort til en sprøjte og centrifugeres den ved 1.000 - 5.000 x g i 5 min. Nål diameter skal være lavere end kapselstørrelse og 25 G (260 um) nåle anvendes i dette forsøg (600 um)
- Efter centrifugering indsamle cellepelleten strengt fra brudte Alg-PLL membraner, hvis du ønsker at indsamle mRNA prøver fra celler. Resterende Alg-PLL membraner eventuelt forebygge mRNA oprensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved protokol 2.5, det udelukkede alginatopløsningen danner en sfærisk form umiddelbart efter uddrivning (figur 2A - H). Hvis suspensionen uddrives med en N2-strøm er lavere end 1L / min, størrelsen af dråberne er ensartet (figur 2I). Men hvis N2-strøm er højere end 1L / min, dråben nedbryder (figur 2G, hvid med pil), og størrelsen af dråberne bliver heterogen (Figur 2J). På denne baggrund er det vanskeligt at fremstille små dråber mindre end 500 um ved anvendelse af denne metode.
I geldannende proces (protokol 2,4), smådråber Alg-Na dannet kugleform Alg-Ca kapsler i CaCl2-opløsning, hvis koncentration af Alg-Na (mere end 3%) er tilstrækkelig (figur 3E-H, K, I). Men lav koncentration af Alg-Na (lavere end 3%) bevirker ikke-sfæriske og ikke-glat form af kapsler (figur 3A-D, I), somhar et problem i belægningsproces. Selv om Alg-Na-koncentration ikke er nok, kan sfæriske kapsler dannes ved at øge CaCl2 fusion (figur 3J). Imidlertid omkring 50 mM CaCl2 er egnet til indkapsling, fordi for høj koncentration af CaCl2 formindsker cellulær vækst og levedygtighed (data ikke vist). Efter slippe ind CaCl2-opløsning, eventuelt kan du vente et par minutter for geldannende, men vi anbefaler, optagning kapsler fra CaCl2 løsning, fordi alt for længe inkubation i CaCl2 tider påvirker cellevækst. Nogle gange du får ikke-sfæriske formede kapsler, selvom koncentrationerne er nok. Det er sandsynligvis fordi vask cellulære pellet er ikke nok, før opblandes celler i Alg-Na-løsning. Resterende reagenser, såsom serum muligvis forhindre geldannelse.
Indkapslede celler kan vokse i kapslerne men cellulær lækage (pile i figur4A) kan forekomme i kapsler uden Alg-PLL-coating (figur 4A). I tilfælde af muse iPS celler, cellerne danner skiveformede aggregater i hver Alg-Ca kapslen (figur 4B), hvorimod cellerne klumper sig sammen og danner enkelte sfæriske aggregater i hver hule kapsel (figur 4C). Initial celledensitet påvirker ikke størrelsen af aggregater i kapsler men lav celledensitet (10 5 celler / ml-gel) bevirker den manglende vokse op (data ikke vist). Således 10 6 celler / ml-gel er ønskeligt at indkapsle.
I indsamling celler fra kapsler, kan Alg-Ca hydrogel opløses med alginat lyase eller chelaterende reagenser, selv om Alg-PLL-coating er vanskeligt at opløse med enzymer eller kemikalier. ALG-PLL bør derfor fysisk brudt med pipettering, f.eks. Broken membraner kan adskilles fra cellerne ved centrifugering.
Figur 1. Billeder af Indkapsling System og kapsler. (A) Et billede af indkapslingen for Alg-Ca indkapsling på en ren bænk. (B) Skematisk billede af en koaksial dyse til indkapsling. (C) De tre forskellige typer af kapsler opnået i denne rapport. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Effekt af N2 Flow på morfologien af Kapsler Kontinuerlig billeder (A - H). Og udseende (I, J) i dråbedannelse på 3% Alg-Na-opløsning fra en koaksial dyse i N2flow på 1 l / min (A - D, I) og 2 l / min (E - H, J). Kontinuerlig billeder blev taget til fange af hi-speed kamera. Hydrogel kapsler dannet i 0,5% CaCl2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Virkning af Alg-Na og CaCl2 Koncentration på morfologien af Kapsler Kontinuerlig billeder (A - H). Og udseende (I - L) Alg-Na dråber svømmer gelering i CaCl2-opløsning. I kontinuerlige billeder, dråber have forskellig koncentration af Alg-Na, 2% (A - D) og 3% (E - H), er geldannende i 50 mM CaCl2-opløsning. Kontinuerlig billeder fanget af hispeed kamera. Udseende billeder viser den morfologiske forskel på Alg-Ca-kapsler dannet ved forskellige koncentrationer af Alg-Na, 2% (L, J) og 3% (K, L), og CaCl2, 50 mM (L, K) og 500 mM (J, L). Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 4. Morfologi af indkapslet Mouse iPS celleaggregater i kapslerne Micrograph billeder af iPS celle-aggregater dyrket i 4, 6, 8 og 10 dage (1 - 4 henholdsvis) i tre forskellige typer af kapsler: (A) nøgne, ( B) belagt, og (C) hule kapsler. Klikher for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indkapsling kultur kan sammenlignes med direkte kulturer suspension. Suspensionskultur er en enklere metode til at opnå store mængder af pluripotente stamceller end indkapslingsmetoder. Imidlertid kontrollere aggregering af celler i suspensionskultur er stadig udfordrende. I indkapsling fremgangsmåde cellulær aggregering begrænset i kapsler og kan derfor velkontrolleret. En tidligere publikation viste, at indkapslede celler dannede aggregater af ensartet størrelse, hvorimod store celleklumper dukkede op i en fri-suspension kultur 7. Desuden en tidligere rapport viste, at en stærk agitation forårsager celledød i direkte suspensionskulturer af PS celler; hvilket nødvendiggør en begrænset omrøringshastighed. I modsætning hertil indkapsling er i stand til at beskytte celler fra forskydningsspænding selv under suspension betingelser. Indkapsling metode tillader derfor en grad af fleksibilitet i de driftsbetingelser, når voksende celler i suspension.
ove_content "> Indkapsling er et nyttigt værktøj til både stamcelleforskning samt modifikation af massen produktionsprocessen. Indkapslingen af stamceller er nyttig i forskning stamcellen niche, herunder den ekstracellulære matrix og vækstfaktorer. Nogle forskere har påvist, at indkapslingen af muse-ES-celler i VEGF-konjugeret agarose hydrogeler fremmet differentiering af celler i blodstamceller 8.Denne artikel viser, hvordan at indkapsle muse iPS celler i størrelse-kontrollerede Alg-Ca kapsler nemt ved hjælp af koaksial dyse og N2-strøm. Selv om der er nogle indkapslingsprocessen med forskellige værktøjer såsom peristaltisk pumpe 9 og elektrisk spænding 10, indkapslingen ved hjælp af N2-strøm er en enklere og mere sikker metode end andre metoder. Desuden er denne fremgangsmåde er i stand til at danne mindre (ca. større end 600 um) kapsler end metoden med peristaltiske pumpe(Ca. større end 3 mm). Store kapsler tage længere tid for gelering fuldstændigt og lang tid inkubering i CaCl2 muligvis påvirker cellulære egenskaber. Desuden store kapsler også eventuelt have et problem med masseoverførsel af næringsstof eller affald såsom glucose og oxygen. Dermed på størrelsen af kapsler dannet ved N2-strøm (600 -1.000 um) er ideel størrelse til cellekultur inde.
Denne metode er ikke egnet til fremstilling af små kapsler og styre størrelsen præcist. På grund af fordelingen af dråberne, denne metode er ikke egnet til at forberede kapsler mindre end 500 um. Desuden er det kun visuel observation kan bestemme størrelsen af kapsler, hvorfor det er svært at kontrollere størrelsen af kapsler ved denne fremgangsmåde. I dette tilfælde, brug af mikrofluidenheder muligvis kan løse disse problemer 11. Dog sker nogle gange tilstopning i microdevice fordi Alg-Na geler umiddelbart efter et møde CaCl2 solution.
Selvom alginat er ikke egnet til kemisk modifikation grund af dens høje viskositet, det er i stand til at danne hybrid kapsler med hydrogel, der ligesom PEG, er også vanskelig at anvende til indkapsling. En tidligere publikation viste, at indkapslingen af muse iPS celler i en RGD peptid-konjugeret PEG-Alg hybrid hydrogel kapsel forbedret cellevækst 12. Uden kemisk modifikation, ville indkapslingen af celler i lige hydrogel kapsler forventes at modificere stamceller niche ved at tilbageholde udskilte faktorer. Faktisk tidligere forskning vist, at de udskilte vækstfaktorer, tilbageholdt i en microbioreactor, var effektive til at kontrollere stamceller skæbne 13,14.
Indsamling af celler fra kapsler er stadig et uløst problem vedrørende anvendelsen af indkapslingen metode til masseproduktion af pluripotente stamceller. En tidligere rapport har vist, at denne PLL belægning er nødvendig for at kEEP mus iPS celler inde 7. Hvis Alg-Ca hydrogel kapsler er godt overtrukket med en polykation såsom PLL (protokol 3,1-3,2), vil det være vanskeligt at nedbryde kapslerne ved enten enzym eller chelaterende reagenser. I dette tilfælde er en mekanisk metode, såsom pipettering af nålen kræves (protokol 4.3). De opsamlede celler kan isoleres fra brudte membraner ved centrifugering større end 5000 × g, skønt centrifugering muligvis påvirke cellernes levedygtighed grund af den høje G-kraft. Således er en teknik til forsigtigt at fjerne snavs fra celler såvel som at bryde kapslerne er vigtig i udviklingen indkapslingsteknologi. Selv om nogle yderligere udvikling er påkrævet for at anvende denne metode til masseproduktion af celler, indkapsling er en lovende teknik til både masseproduktion og stamcelleforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
