Protocol
1. Förbereda Material
- Förbered 10 mM HEPES-buffert. Justera pH till 7,0 vid RT och tillsätt NaCl till 0,9%.
- Bered 5% alginat lösning och 10 mM EDTA-lösning genom att blanda HEPES saltlösning framställd i 1.1. Justera pH till 7,0 vid RT.
- Autoklavera reagensen (1,1, 1,2) under 20 min vid 121 ° C.
- Förbered gelatinbelagda 60 mm skålar varvad med 1,2-2,0 x 10 6 mus embryonala fibroblaster (MEF) celler, som behandlas som matarceller genom inkubation i DMEM innehållande 10% ES-kvalificerade FBS och 10 mikrogram / ml mitomycin C under 90 - 120 min.
- Bibehåll mus inducerad pluripotenta skaft (iPS) cellerna på skålen med matarceller i närvaro av 5 ml DMEM med hög glukoshalt som innehöll 20% av ES-kvalificerad FBS, 50 pM av 2-merkaptoetanol, icke-essentiella aminosyror, och antibiotika ( 100 enheter / ml av penicillin G-natrium, 100 | ig / ml streptomycinsulfat och 250 ng / ml av amphotericin B).
- Seed 4 x 10 5 iPS-celler på en gelatinbelagd 60 mm skål och inkubera dem vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra odlingsmediet varje dag under inkuberingen. Efter 3-4 dagars odling, trypsinize cellerna under 1 min med 500 ul av 0,05% trypsin innehållande 0,02% EDTA vid 37 ° C och 5% CO2. Efter att lösgöra celler genom att trycka på odlingsskål tio gånger.
- Lägg 2,5 ml DMEM med 10% av ES-kvalificerade FBS och antibiotika (efter dissociation mus iPS celler till enstaka celler genom pipettering med 1000 pl mikropipett tre gånger) centrifugera cellsuspensionen vid 160 x g under 3 min och avlägsna supernatanten och räkna cellerna . Efter cellräkning, reseed de uppsamlade cellerna på en gelatinbelagd skålen och inkubera under 30 min för att isolera iPS-celler från MEF celler. Efter att ha räknat av cellerna (vanligtvis 1 - 3 × 10 6 celler / skål kan samlas), reseed 4 × 10 5 iPS-celler påskålen.
2. Cell Inkapsling i Alginat Hydrogeler Kapslar
- Samla cellerna genom samma förfarande som beskrivits i 1.5 och 1.6. Efter centrifugering vid 160 x g under 3 minuter, tvätta iPS cellpelleten med HEPES saltlösning tre gånger. Efter förnyad suspendering av cellerna i HEPES-buffrad saltlösning, filtrera cellsuspensionen genom en 40 | im cellfilter för att avlägsna stora aggregat, som annars skulle kunna sätta igen munstycket.
- Blanda 2 ml cellsuspension inom HEPES-buffrad saltlösning och 3 ml av 5% Alg-Na-lösning. Slutligen 5 ml cellsuspension inom 3% Alg-Na-lösning erhålles. Celldensiteten är företrädesvis mer än 10 6 celler / ml.
- Efter uppsamling av cellsuspensionen i en 5 ml spruta, installera en koaxial munstycke (Figur 1A, B) på sprutan och ställ dem på sprutpump. Emit N 2 gasflöde (lägre än 1 liter / minut) genom den yttre nålen av koaxiella munstycket ochutvisa cellsuspensionen genom det inre munstycket.
- Samla dropparna till 250 ml av 0,5% CaCl2-lösning och vänta 10-20 minuter för gelning under omröring vid 60-90 varv per minut.
3. Behandling av alginat kapslar (tillval)
- Inkubera Alg-Ca kapslar i 0,05% (vikt / volym) poly-L-lysin (PLL) lösning under 5 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter tvättning av kapslar med HEPES-buffrad saltlösning, inkubera dem i DMEM innehållande 10% FBS för att neutralisera den elektriska laddningen på sin yta. Utnyttja dem som överdragna kapslar (Figur 1C).
- Inkubera kapslarna i HEPES-buffrad saltlösning innehållande 10 mM EDTA under 5 minuter. De EDTA-behandlade kapslar används som ihåliga kapslar (Figur 1C).
4. Kultur och samla upp celler i alginat Kapslar
- Inkubera de inkapslade cellerna vid 75 varv per minut med skakning vid 37 ° C och 5% CO2i 10 dagar.
- Samla och inkubera kapslarna i 10 mM EDTA vid 37 ° C och 5% CO2 under 10 minuter. Samla cellerna från alginat kapslarna utan PLL-behandling genom centrifugering vid 1000 x g under 3 minuter.
- Om alginat kapslar behandlas med PLL, bryta Alg-PLL membranet genom att pipettera upp och ner ett tiotal gånger med en nål fäst vid en spruta och centrifugera det vid 1000 - 5000 x g under 5 min. Nåldiameter bör vara lägre än kapselstorlek och 25 G (260 ^ m) nålar används i detta experiment (600 ^ m)
- Efter centrifugering, samla cellpelleten strikt från trasiga Alg-PLL membran om du vill samla mRNA prover från celler. Återstående Alg-PLL membran eventuellt förhindra mRNA-rening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid protokoll 2,5, bildar den utvisade alginatlösningen en sfärisk form omedelbart efter utdrivning (Figur 2A - H). Om suspensionen utvisas med en flödeshastighet N 2 lägre än 1 liter / minut, storleken på dropparna är enhetliga (fig 2i). Om emellertid N 2 flödet är högre än 1 liter / minut, bryter droppen ned (figur 2G, vit pil) och storleken på de små dropparna blir heterogen (figur 2J). Med tanke på detta är det svårt att framställa droppar mindre än 500 ^ m med användning av denna metod.
I gelningsprocessen (protokoll 2,4), droppar Alg-Na bildas sfärisk form Alg-Ca kapslar i CaCl2 lösning om koncentrationen av Alg-Na (mer än 3%) är tillräckligt (figur 3E-H, K, I). Emellertid låg koncentration av Alg-Na (lägre än 3%) orsakar icke-sfäriska och icke-jämn form av kapslar (Figur 3A-D, I), somhar ett problem i beläggningsprocessen. Även om Alg-Na koncentrationen är inte tillräckligt, kan sfäriska kapslar bildas genom att öka CaCl2 koncentration (Figur 3J). Men runt 50 mM CaCl 2 är lämplig för inkapsling eftersom alltför hög koncentration av CaCl2 minskar cellulär tillväxt och viabilitet (data ej visade). Efter att ha fallit i CaCl2-lösning, eventuellt kan du vänta ett par minuter för gelning men vi rekommenderar att plocka upp kapslar från CaCl2 lösning eftersom alltför lång inkubation i CaCl2 påverkar ibland celltillväxt. Ibland får du icke-sfäriska formade kapslar, även om halterna är tillräckligt. Detta beror förmodligen på att tvätta cell pellets är inte tillräckligt innan det blandas celler i Alg-Na-lösning. Kvarvarande reagens såsom serum eventuellt förhindra gelning.
Inkapslade celler kan växa i kapslarna men cellulära läckage (pil i figur4A) kan förekomma i kapslar utan Alg-PLL-beläggning (Figur 4A). I fallet med mus iPS-celler, cellerna bildar skivformade aggregat i varje Alg-Ca kapsel (Figur 4B), medan cellerna klumpar ihop sig och bildar enkla sfäriska aggregat i varje ihålig kapsel (Figur 4C). Initiala celldensiteten påverkar inte storleken på aggregat i kapslar men låg celldensitet (10 5 celler / ml gel) orsakar misslyckandet att växa upp (data ej visade). Således är det önskvärt att kapsla in 10 6 celler / ml-gel.
I samla celler från kapslar, kan Alg-Ca hydrogel lösas med alginat lyas eller kelatbildande reagens, även om Alg-PLL-beläggning är svårt att lösa med enzymer eller kemikalier. Alg-PLL bör därför fysikaliskt brytas med pipettering, till exempel. Trasiga membran kan skiljas från cellerna genom centrifugering.
Figur 1. Bilder från inkapslingssystem och kapslar. (A) En bild av inkapslingssystem för Alg-Ca inkapsling på en ren bänk. (B) Schematisk bild av en koaxiell munstycke för inkapsling. (C) De tre olika typer av kapslar som erhållits i denna rapport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Effekt av N 2 Flöde på morfologin av de Kapslar Kontinuerliga bilder (A - H). Och utseende (I, J) för droppbildning av 3% Alg-Na-lösning från en koaxiell munstycke i N 2flöda vid en l / min (A - D, I) och 2 l / min (E - H, J). Kontinuerliga bilder fångades av hi-hastighetskamera. Hydrogel kapslar bildas i 0,5% CaCl2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekt av Alg-Na och CaCl2 Koncentration på morfologi av kapslarna Kontinuerliga bilder (A - H). Och utseende (I - L) Alg-Na droppar gelbildande i CaCl2-lösning. Vid kontinuerliga bilder, droppar med olika koncentration av Alg-Na, 2% (A - D) och 3% (E - H), är gelning i 50 mM CaCl2-lösning. Kontinuerliga bilderna tas med hi-växlad kamera. Utseende bilder visar den morfologiska skillnaden av Alg-Ca kapslar bildade av olika koncentrationer av Alg-Na, 2% (L, J) och 3% (K, L), och CaCl2, 50 mM (L, K) och 500 mM (J, L). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 4. morfologi av inkapslat mus iPS cellaggregat i kapslarna micrograph bilder av iPS cellaggregat odlade för 4, 6, 8 och 10 dagar (1 - 4 respektive) i tre olika typer av kapslar: (A) nakna, ( B) överdragna, och (C) ihåliga kapslar. Klickahär för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkapslings kultur kan jämföras med direkta suspensionskulturer. Suspensionsodling är en enklare metod för att erhålla stora mängder av pluripotenta stamceller än inkapslingsmetoder. Men att styra aggregering av celler i suspensionskultur är fortfarande utmanande. I inkapslingsmetod, är cellulär aggregering begränsad i kapslar och kan därför vara väl kontrollerad. En tidigare publikation visade att inkapslade celler bildas aggregat av enhetlig storlek, medan stora cellklumpar dök upp i ett fritt suspensionsodling 7. Dessutom visade en tidigare rapport att en stark agitation orsakar celldöd i direkta suspensionskulturer av PS-celler; vilket nödvändiggör en begränsad omrörningshastigheten. I motsats härtill är inkapsling i stånd att skydda celler från skjuvspänning även under suspensionsförhållanden. Inkapslings Metoden möjliggör därför en viss flexibilitet i driftsförhållandena vid odling av celler i suspension.
ove_content "> Inkapsling är ett användbart verktyg för både stamcellsforskning samt modifiering av mass produktionsprocessen. Inkapslingen av stamceller är användbar i forska stamcellsnischen, inklusive extracellulära matrix och tillväxtfaktorer. Vissa forskare har visat att inkapsling av mus ES-celler i VEGF-konjugerade agaros hydrogeler främjat differentiering av celler i blod stamceller 8.Den här artikeln visar hur du kapsla mus iPS-celler i storleks kontrollerade Alg-Ca kapslar enkelt genom att använda koaxial munstycke och N2-flöde. Även om det finns vissa inkapslingsprocessen med olika verktyg, såsom peristaltisk pump 9 och elektrisk spänning 10, är inkapslingen genom användning av N 2 flöde en enklare och säkrare metod än andra metoder. Vidare är denna metod kan bilda mindre (ungefär större än 600 | im) kapslar än metoden med peristaltisk pump(Ungefär större än 3 mm). Stora kapslar tar längre tid för gelning fullständigt och länge inkubation i CaCl2 påverkar möjligen cellulära egenskaper. Vidare stora kapslar också eventuellt ha ett problem med massöverföring av näringsämne eller avfall, såsom glukos och syre. Därför storleken av kapslar som bildas av N2-flöde (600 -1000 um) är perfekt storlek för att cellodling inuti.
Denna metod är inte lämplig för att framställa små kapslar och kontrollera storleken exakt. På grund av fördelningen av dropparna, är denna metod inte är lämplig för framställning av kapslar mindre än 500 pm. Dessutom, det är endast visuell observation kan bestämma storleken på kapslarna därmed svårt att styra storleken på kapslarna med denna metod. I detta fall, användning av mikrofluidiska anordningar eventuellt kan lösa dessa problem 11. Men förekommer ibland igensättning i mikroanordning eftersom Alg-Na geler omedelbart efter mötet CaCl2 solutJon.
Även om alginat är inte lämplig för kemisk modifiering på grund av dess höga viskositet, är det möjligt att bilda hybrid kapslar med hydrogel, som i likhet med PEG, är också svåra att använda för inkapsling. En tidigare publikation visade att inkapslingen av mus iPS-celler i en RGD-peptid-konjugerad PEG-Alg hybrid hydrogel kapsel förbättrad celltillväxt 12. Utan kemisk modifiering, förväntas inkapsling av celler i bara hydrogel kapslar att modifiera stamceller nisch genom att behålla utsöndrade faktorer. Faktum är att tidigare forskning visat att de utsöndrade tillväxtfaktorer, kvar i en microbioreactor, var effektiva för att kontrollera stamcells öde 13,14.
Insamlingen av celler från kapslar är fortfarande en olöst fråga om tillämpningen av inkapslingsmetoden till massproduktion av pluripotenta stamceller. En tidigare rapport visade att det PLL-beläggning är nödvändig för att kEEP mus iPS-celler inuti 7. Om Alg-Ca hydrogel kapslar är väl belagd med en polykatjon såsom PLL (protokoll 3,1-3,2), kommer det att bli svårt att bryta ned kapslarna genom antingen enzym eller kelatbildande reagens. I detta fall är en mekanisk metod såsom pipettering av nålen krävs (protokoll 4,3). De uppsamlade cellerna kan isoleras från trasiga membranen vid centrifugering som är större än 5000 x g, även om centrifugering kan eventuellt påverka cellviabiliteten grund av den höga G-krafter. Således är det viktigt att utveckla inkapslingsteknik en teknik för att försiktigt avlägsna skräp från celler samt bryter kapslarna. Även om vissa vidareutveckling krävs för att tillämpa denna metod för massproduktion av celler, är inkapsling en lovande teknik för både massproduktion och stamcellsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
