Protocol
1. Подготовка материалов
- Подготовьте 10 мм HEPES буфера. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре и добавляют NaCl до 0,9%.
- Готовят 5% раствора альгината и раствора 10 мМ ЭДТА, смешивая HEPES-буферный солевой раствор, приготовленный в 1,1. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре.
- Автоклав реагенты (1.1, 1.2) в течение 20 мин при 121 ° С.
- Подготовьте желатин покрытием 60 мм блюда, покрытые 1,2 - 2,0 × 10 6 мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клеток, которые рассматриваются как фидерных клеток путем инкубации в течение DMEM, содержащей 10% ES-высококвалифицированных FBS и 10 мкг / мл митомицина С в течение 90 - 120 мин.
- Поддерживать мыши индуцированной плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток на блюдо с питающими клетками в присутствии 5 мл DMEM высокий уровень глюкозы, содержащей 20% ES-квалифицированным FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, несущественные аминокислоты, и антибиотиков ( 100 ед / мл пенициллина G натрия, 100 мкг / мл стрептомицина сульфата и 250 нг / мл amphoteriCIN Б).
- Семя 4 х 10 5 клеток плюрипотентных на желатин покрытием 60 мм блюдо и инкубировать их при 37 ° С и 5% CO 2. Изменить культуральной среде каждый день во время инкубации. Через 3 - 4 дней культивирования клеток Trypsinize в течение 1 мин с 500 мкл 0,05% трипсина, содержащий 0,02% ЭДТА при 37 ° С и 5% СО 2. После этого отделить клетки нажав культуре блюдо десять раза.
- Добавить 2,5 мл DMEM с 10% ES-квалифицированный ФБС и антибиотики (следующие плюрипотентных клеток мыши диссоциации в отдельных клеток с помощью пипетки с 1000 мкл микропипетки три раза) центрифуги клеточной суспензии при 160 × г в течение 3 мин и удалить супернатант, и подсчет клеток , После подсчета клеток, повторное заполнение собранных клеток на желатин покрытием блюдо и инкубировать в течение 30 мин, чтобы изолировать клетки плюрипотентных из MEF клеток. После подсчета клеток (обычно 1 - 3 × 10 6 клеток / блюдо могут быть собраны) повторное заполнение 4 × 10 5 плюрипотентных клеток отблюдо.
2. Сотовый инкапсуляции в альгината гидрогеля капсул
- Сбор клеток по той же методике, описанной в 1.5 и 1.6. После центрифугирования при 160 × г в течение 3 мин, промыть осадок клеток IPS с HEPES-буферным раствором трижды. После повторного суспендирования клеток в HEPES-буферным раствором, фильтр клеточной суспензии через 40 мкм ячейки фильтра, чтобы удалить крупные агрегаты, которые в противном случае могут засорить сопло.
- Смешайте 2 мл клеточной суспензии в течение HEPES-буферным раствором и 3 мл 5% -ного раствора Na-Alg. Наконец 5 мл суспензии клеток в пределах 3% -ным раствором Alg-Na получают. Плотность клеток желательно более 10 6 клеток / мл.
- После сбора клеток суспензии в 5 мл шприц, установить коаксиальный сопло (рис 1а, б) на шприц и установите их на шприцевой насос. Испустите N 2 поток газа (ниже, чем 1 л / мин) через внешнюю иглу коаксиального сопла иизгнать клеточной суспензии через внутреннее сопло.
- Сбор капель в 250 мл 0,5% -ного раствора CaCl 2 и ждать 10 - 20 мин для образования геля при перемешивании при 60-90 оборотов в минуту.
3. Лечение альгината капсул (по желанию)
- Инкубируйте Alg-CA капсулы в 0,05% (вес / объем) поли-L-лизин (PLL) раствор в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
- После промывки капсулы с HEPES-буферным раствором, инкубируют их в среде DMEM, содержащей 10% FBS с целью нейтрализации электрического заряда на их поверхности. Используйте их как капсул, покрытых (рис 1в).
- Инкубируйте капсулы в HEPES-буферным раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА в течение 5 мин. В обработанной ЭДТА капсул используются как полые капсулы (рис 1c).
4. Культура и сбора клеток в альгината капсул
- Инкубируйте инкапсулированные клетки при 75 оборотах в минуту при встряхивании при 37 ° С и 5% CO 2на 10 дней.
- Сбор и инкубировать капсулы в 10 мМ ЭДТА при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 10 мин. Собирают клетки из альгинатных капсул без обработки ФАПЧ центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин.
- Если альгината капсулы обрабатывают с PLL, сломать мембрану Alg-PLL с помощью пипетки вверх и вниз около десяти раз с иглой со шприцем и центрифуги это при 1000 - 5000 × г в течение 5 мин. Диаметр иглы должен быть ниже, чем размер капсулы и 25 г игл (260 мкм) использовали в этом эксперименте (600 мкм)
- После центрифугирования собирают осадок клеток строго с разбитыми мембран Alg-PLL, если вы хотите, чтобы собрать образцы мРНК из клеток. Остальные Alg-PLL мембраны, возможно, предотвратить очистку мРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В протоколе 2.5 исключен альгинат решение образует сферическую форму сразу после изгнания (рис 2A - H). Если суспензию исключили со скоростью потока N 2 ниже, чем 1 л / мин, размер капель равномерна (рис 2I). Тем не менее, если поток Н 2 выше 1 л / мин, капли ломается (рис 2G, белый стрелками) и размер капель будет гетерогенную (рис 2J). Учитывая это, трудно приготовить капли меньшего размера, чем 500 мкм с использованием этого метода.
В процессе гелеобразования (протокол 2.4), Alg-на капельки образуются сферические формы Alg-Ca капсулы в CaCl 2 решения, если концентрация Alg-Na (более 3%) достаточно (рис 3E-H, K, I). Однако низкая концентрация Alg-Na (ниже, чем 3%) вызывает несферическими и негладкой форма капсул (3А-D, I), котораяесть проблемы в процессе нанесения покрытия. Даже если концентрация Alg-Na недостаточно, сферические капсулы могут быть сформированы за счет увеличения концентрации CaCl 2 (рис 3J). Тем не менее, около 50 мМ CaCl 2 является подходящим для инкапсуляции, потому что слишком высокая концентрация CaCl 2 уменьшается клеточный рост и жизнеспособность (данные не показаны). После падения в CaCl 2 решения, возможно вы можете ждать в течение нескольких минут для желирующих но мы рекомендуем поднимая капсулы с CaCl 2 решения, потому что слишком долго инкубирование в CaCl 2 иногда влияет клеточный рост. Иногда вы получаете не сферические капсулы фасонных даже если концентрации достаточно. Это, вероятно, потому, что мытье сотовой осадок недостаточно, прежде чем ресуспендированием клетки в растворе Alg-Na. Остаточные реагенты, такие как сыворотки, возможно, предотвратить гелеобразование.
Капсула может расти в капсулах, но утечки сотовой (стрелками на рис4A) может происходить в капсулах без Alg-PLL покрытием (4А). В случае мышиных плюрипотентных клеток, клеток образуют дискообразные агрегатов в каждой Alg-Ca капсулы (фиг.4В), тогда как клетки слипаются и образуют одиночные сферические агрегаты в каждой капсуле полого (фиг.4С). Исходная плотность клеток не влияет на размер агрегатов в капсулах, но низкой плотности клеток (10 5 клеток / мл, гель) вызывает отказ расти (данные не показаны). Таким образом, 10 6 клеток / мл-гель желательно для инкапсуляции.
При сборе клеток из капсул, Alg-Са гидрогель может быть расторгнут с альгината лиазы или хелатных реагентов, хотя покрытие Alg-PLL трудно развести ферментов или химических веществ. Alg-ФАПЧ, следовательно, должны быть физически сломана с пипеткой, например. Сломанные мембраны могут быть отделены от клеток путем центрифугирования.
Рисунок 1. Изображения инкапсуляции системы и капсул. (A) образ инкапсуляции системы Alg-Ca инкапсуляции на чистом столе. (Б) Схематическое изображение коаксиальной насадкой для инкапсуляции. (C) три различных типа капсул, полученных в этом отчет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Влияние N 2 потока на морфологию капсул Непрерывные образы (A - H). И внешний вид (I, J) образования капель 3% раствора Alg-Na из коаксиального сопла в N 2течь на 1 л / мин (- D, I) и 2 л / мин (Е - Н, J). Непрерывные образы были захвачены привет-камеры скорости. Гидрогеля капсулы образуются в 0,5% CaCl 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Влияние Alg-Na и CaCl 2 Концентрация на морфологию капсул Непрерывные образы (- Н). И появление (я - л) Alg-Na капельки гелеобразования в CaCl 2 решения. В непрерывных изображений, капель, имеющих различную концентрацию Alg-Na, 2% (- D) и 3% (E - H), которые желирующий в 50 мМ CaCl 2 раствора. Непрерывные образы захвачены привет-Радар. Внешний вид изображения показывают морфологическое различие Alg-Са капсул, образованных различными концентрациями Alg-Na, 2% (L, J) и 3% (K, L), и CaCl 2, 50 мМ (L, K) и 500 мм (J, L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
. Рисунок 4. Морфология инкапсулированных мышь плюрипотентных клеточных агрегатов в капсулах микрофотографии изображения плюрипотентных клеток-агрегатов культивировали в течение 4, 6, 8 и 10 дней (1 - 4) соответственно в трех различных типов капсул: (а) голых, ( Б) с покрытием, и (С) полые капсулы. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инкапсуляция культура может быть по сравнению с прямыми суспензионных культур. Суспензионной культуре является более простой способ получения больших количеств плюрипотентных стволовых клеток, чем способов инкапсулирования. Тем не менее, управление агрегацию клеток в суспензионной культуре по-прежнему сложным. В методе инкапсуляции, клеточной агрегации ограничен в капсулы и может, следовательно, быть хорошо контролируется. Предыдущая публикация показала, что инкапсулированные клетки образуются агрегаты одинакового размера, в то время как крупные клеточные скопления появились в свободной подвески культуры 7. Кроме того, ранее отчет показал, что сильный агитация вызывает клеточную смерть в прямых подвески культур PS клеток; Таким образом, требуя ограниченной скорости перемешивания. В противоположность этому, инкапсуляции способен защищать клетки от напряжения сдвига даже в условиях подвески. Метод инкапсуляции, следовательно, позволяет уровень гибкости в условиях эксплуатации при выращивании клеток в суспензии.
ove_content "> Инкапсуляция является полезным инструментом как для исследования стволовых клеток, а также модификации массового производства. инкапсуляции стволовых клеток является полезным в исследовании стволовых клеток, в том числе нишу внеклеточного матрикса и факторов роста. Некоторые исследователи показали, что инкапсуляция ЭС клеток мыши в VEGF-конъюгированные агарозных гидрогелей способствует дифференциации клеток в клетки-предшественники в крови 8.Эта статья показывает, как объединить плюрипотентных клеток в мышь размера управлением Alg-Са капсулы легко с помощью коаксиального сопла и N 2 потока. Хотя есть некоторые инкапсуляции процесс с различными инструментами, такими, как перистальтического насоса 9 и электрического напряжения 10, инкапсуляции, используя N 2 потока проще и безопаснее, чем метод другими методами. Кроме того, этот метод способен образовывать меньше (примерно больше, чем 600 мкм) Капсулы, чем метод с перистальтического насоса(Приблизительно более 3 мм). Большие капсулы занять больше времени для гелеобразования полностью и долгое время инкубации в CaCl 2, возможно, влияет на клеточные характеристики. Кроме того, большие капсулы также, возможно, имеют проблему массопереноса питательных веществ или отходов, таких как глюкоза и кислород. Поэтому размер капсул, образованных N 2 потока (600 -1000 мкм) идеально подходит для размер культуре клеток внутри.
Этот способ не подходит для приготовления небольших капсул и точно контролировать размер. Из-за распада капель этот способ не подходит для приготовления капсул меньше, чем 500 мкм. Кроме того, только визуальное наблюдение может определить размер капсул, таким образом, трудно контролировать размер капсул с помощью этого метода. В этом случае использование микрожидкостных устройств, возможно, может решить эти проблемы 11. Тем не менее, иногда засорение происходит в микроустройство потому Alg-на гели сразу после встречи CaCl 2 Solutионная.
Несмотря на то, альгинат не подходит для химической модификации из-за его высокой вязкости, оно способно образовывать гибридные капсулы с гидрогелем, который, как и ПЭГ, также трудно использовать для инкапсуляции. Предыдущая публикация показала, что герметизация мыши плюрипотентных клеток в RGD пептида, конъюгированного ПЭГ-Alg гибрид гидрогеля капсулы улучшить клеточный рост 12. Без химической модификации, инкапсуляция клеток в только что гидрогелевые капсулы можно было бы ожидать, чтобы изменить ниши стволовых клеток, сохраняя секретируемые факторы. В самом деле, предыдущие исследования показали, что секретируемые факторы роста, введенным в microbioreactor, были эффективны в борьбе стволовых клеток судьбу 13,14.
Коллекция клеток из капсул по-прежнему нерешенным вопросом относительно применения метода инкапсуляции для массового производства плюрипотентных стволовых клеток. Предыдущий доклад показал, что, что PLL покрытие необходимо KЕЭП мыши плюрипотентных клеток внутри 7. Если Alg-Ca-гидрогелевые капсулы хорошо покрыты поликатиона таких как PLL (протокол 3.1 - 3.2), то это будет трудно сломать капсул либо фермента или хелатных реагентов. В этом случае механический способ, такой как пипетки иглой требуется (протокол 4.3). Собранные клетки могут быть выделены из неполных мембран при центрифугировании более чем 5000 х г, хотя, возможно, центрифугирование может влиять на жизнеспособность клеток из-за высокой G-силы. Таким образом, методика плавно удаления мусора из клеток, а также нарушение капсулы играет важную роль в развитии технологии инкапсуляции. Хотя некоторые дальнейшее развитие требуется применять этот метод для массового производства клеток, инкапсуляция перспективный метод как массового производства и исследования стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
