Protocol
1. की तैयारी सामग्री
- 10 मिमी HEPES बफर तैयार करें। आरटी पर 7.0 पीएच को समायोजित करें और 0.9% करने के लिए NaCl जोड़ें।
- 1.1 में तैयार HEPES के बफर खारा मिश्रण से 5% alginate समाधान और 10 मिमी EDTA समाधान तैयार है। आरटी पर 7.0 पीएच को समायोजित करें।
- 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अभिकर्मकों (1.1, 1.2) आटोक्लेव।
- DMEM के 10% ते योग्य FBS और 90 के लिए mitomycin सी के 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त भीतर ऊष्मायन से फीडर कोशिकाओं के रूप में इलाज कर रहे हैं, जो 2.0 × 10 6 माउस भ्रूण fibroblast (MEF) कोशिकाओं, - 1.2 के साथ स्तरित जिलेटिन में लिपटे 60 मिमी व्यंजन तैयार - 120 मिनट।
- (ते योग्य FBS की 20%, 2-mercaptoethanol, गैर आवश्यक अमीनो एसिड, और एंटीबायोटिक दवाओं के 50 माइक्रोन से युक्त 5 मिलीलीटर DMEM उच्च ग्लूकोज की उपस्थिति में फीडर कोशिकाओं के साथ पकवान पर कोशिकाओं (आईपीएस) माउस प्रेरित स्टेम बनाए रखें पेनिसिलिन ग्राम सोडियम, स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के 100 माइक्रोग्राम / एमएल की 100 इकाइयों / एमएल, और amphoteri के 250 एनजी / एमएलCIN बी)।
- बीज 4 × 10 5 आईपीएस एक जिलेटिन में लिपटे 60 मिमी पकवान पर कोशिकाओं और सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं और 5%। ऊष्मायन के दौरान संस्कृति के माध्यम से हर दिन बदलते हैं। 3 के बाद - संस्कृति के 4 दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% trypsin 0.02% EDTA युक्त के 500 μl के साथ 1 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं trypsinize। उसके बाद, संस्कृति डिश दस बार दोहन से कोशिकाओं को अलग।
- 3 मिनट के लिए 160 × जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र (तीन बार 1,000 μl micropipette के साथ pipetting द्वारा एकल कक्षों में हदबंदी माउस आईपीएस कोशिकाओं के बाद) FBS और एंटीबायोटिक दवाओं ते योग्य का 10% के साथ DMEM के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला हटाने और कोशिकाओं की गिनती । सेल गिनती के बाद, एक जिलेटिन लेपित पकवान पर एकत्र कोशिकाओं reseed और MEF कोशिकाओं से आईपीएस कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए 30 मिनट के लिए सेते हैं। कोशिकाओं की गिनती के बाद (आमतौर पर 1 - 3 × 10 6 कोशिकाओं / पकवान एकत्र किया जा सकता है), पर 4 × 10 5 आईपीएस कोशिकाओं reseedपकवान।
Alginate Hydrogel कैप्सूल में 2. सेल encapsulation
- 1.5 और 1.6 में वर्णित एक ही प्रक्रिया से कोशिकाओं को इकट्ठा। 3 मिनट के लिए 160 × छ पर centrifugation के बाद तीन बार HEPES के बफर खारा के साथ आईपीएस सेल गोली धो लें। HEPES के बफर खारा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के बाद, अन्यथा नोक रोकना सकता है जो बड़े समुच्चय, को दूर करने के क्रम में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर।
- HEPES के बफर खारा भीतर सेल निलंबन के 2 मिलीग्राम और 5% Alg ना समाधान के 3 मिलीलीटर मिलाएं। अंत में 3% Alg ना समाधान के भीतर सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर प्राप्त की है। सेल घनत्व desirably 10 से अधिक 6 कोशिकाओं / एमएल है।
- 5 मिलीलीटर सिरिंज में सेल निलंबन इकट्ठा करने के बाद, सिरिंज पर एक सह-अक्षीय नोक (चित्रा 1 ए, बी) को स्थापित करने और सिरिंज पंप पर उन्हें सेट। फेंकना एन 2 गैस के प्रवाह (कम 1L / मिनट से अधिक) के सह-अक्षीय नोक के बाहरी सुई के माध्यम से औरभीतरी नोजल के माध्यम से सेल निलंबन निष्कासित।
- 0.5% 2 CaCl समाधान की 250 मिलीलीटर में बूंदों लीजिए और 10 प्रतीक्षा - 60-90 rpm पर सरगर्मी जबकि जमाना के लिए 20 मिनट।
Alginate कैप्सूल 3. उपचार (वैकल्पिक)
- 0.05% में Alg-CA कैप्सूल सेते पाली एल लाइसिन (पीएलएल) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए समाधान और 5% (w / v) सीओ 2।
- HEPES के बफर खारा के साथ कैप्सूल धोने के बाद, DMEM उनकी सतह पर बिजली के प्रभारी को बेअसर करने के क्रम में 10% FBS युक्त में उन्हें सेते हैं। लेपित कैप्सूल (चित्रा 1C) के रूप में उन्हें का उपयोग।
- 5 मिनट के लिए 10 मिमी EDTA युक्त HEPES के बफर खारा में कैप्सूल सेते हैं। EDTA के इलाज कैप्सूल खोखले कैप्सूल (चित्रा 1C) के रूप में उपयोग किया जाता है।
Alginate कैप्सूल में 4. संस्कृति और लीजिए प्रकोष्ठों
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 झटकों के साथ 75 rpm पर समझाया कोशिकाओं को सेते10 दिनों के लिए।
- लीजिए और 10 मिनट के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिमी EDTA में कैप्सूल सेते हैं और 5%। 3 मिनट के लिए 1,000 × छ पर centrifugation द्वारा पीएलएल इलाज के बिना alginate कैप्सूल से कोशिकाओं को इकट्ठा।
- 5 मिनट के लिए 5,000 × छ - alginate कैप्सूल PLL के साथ व्यवहार कर रहे हैं, ऊपर और नीचे pipetting दस बार 1000 के आसपास पर एक सिरिंज और सेंट्रीफ्यूज से जुड़ी यह एक सुई के साथ द्वारा Alg-पीएलएल झिल्ली टूट गया। सुई व्यास कैप्सूल के आकार और 25 जी (260 माइक्रोन) सुइयों इस प्रयोग में इस्तेमाल कर रहे हैं की तुलना में कम होना चाहिए (600 माइक्रोन)
- आप कोशिकाओं से mRNA के नमूने एकत्र करने के लिए चाहते हैं, तो बाद centrifugation, टूटी Alg-पीएलएल झिल्ली से सख्ती से सेल गोली इकट्ठा। शेष Alg-पीएलएल झिल्ली संभवतः mRNA के शोधन को रोकने के।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रोटोकॉल 2.5, निष्कासित कर दिया alginate समाधान निष्कासन के बाद तुरंत एक गोलाकार आकृति (- एच 2A चित्रा) रूपों। निलंबन 1L / मिनट से कम 2 एन प्रवाह की दर के साथ निष्कासित कर दिया गया है, तो बूंदों का आकार एक समान (चित्रा 2I) है। एन 2 प्रवाह 1L / मिनट से अधिक है, तो हालांकि, छोटी बूंद (चित्रा 2 जी, सफेद arrowed) टूट जाती है और बूंदों के आकार विषम (चित्रा 2J) हो जाता है। यह देखते हुए, यह इस पद्धति का उपयोग 500 माइक्रोन से छोटी बूंदों को तैयार करने के लिए मुश्किल है।
Alg-ना (3% से अधिक) की एकाग्रता के लिए पर्याप्त (चित्रा 3E-एच, कश्मीर, मैं) है, तो बीच बढ़िया तालमेल प्रक्रिया (प्रोटोकॉल 2.4) में, Alg ना 2 CaCl समाधान में गोलाकार आकृति Alg-CA कैप्सूल का गठन बूंदों। Alg-ना (कम से कम 3%) की हालांकि कम एकाग्रता, गैर गोलाकार और कैप्सूल के गैर-चिकनी आकार (चित्रा 3-डी, मैं) का कारण बनता है जोकोटिंग की प्रक्रिया में एक समस्या है। Alg ना एकाग्रता के लिए पर्याप्त नहीं है यहां तक कि अगर, गोलाकार कैप्सूल 2 CaCl एकाग्रता (चित्रा 3J) में वृद्धि से गठित किया जा सकता है। 2 CaCl की बहुत अधिक एकाग्रता सेलुलर विकास और व्यवहार्यता (नहीं दिखाया डेटा) कम हो जाती है क्योंकि हालांकि, लगभग 50 2 CaCl मिमी encapsulation के लिए उपयुक्त है। 2 CaCl समाधान में छोड़ने के बाद, वैकल्पिक रूप से आप बीच बढ़िया तालमेल के लिए कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा कर सकते हैं लेकिन 2 CaCl में भी लंबे समय से ऊष्मायन कभी कभी सेलुलर विकास को प्रभावित करता है क्योंकि हम 2 CaCl समाधान से कैप्सूल उठा सलाह देते हैं। कभी-कभी आप सांद्रता पर्याप्त हैं, भले ही गैर गोलाकार आकार कैप्सूल प्राप्त करते हैं। इस सेलुलर गोली धोने Alg ना समाधान में कोशिकाओं resuspending से पहले पर्याप्त नहीं है, शायद इसलिए क्योंकि है। इस तरह के सीरम के रूप में अवशिष्ट अभिकर्मकों संभवतः बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के।
समझाया कोशिकाओं कैप्सूल लेकिन सेलुलर रिसाव में विकसित कर सकते हैं (चित्रा में arrowed-4 ए) Alg-पीएलएल कोटिंग (चित्रा -4 ए) के बिना कैप्सूल में हो सकता है। कोशिकाओं को एक साथ पेड़ों का झुरमुट और प्रत्येक खोखले कैप्सूल (चित्रा 4C) में एक गोलाकार समुच्चय फार्म जबकि माउस आईपीएस कोशिकाओं के मामले में, सेल, प्रत्येक Alg-CA कैप्सूल (चित्रा 4 बी) में डिस्क के आकार का समुच्चय के रूप में। प्रारंभिक सेल घनत्व कैप्सूल लेकिन कम सेल घनत्व (10 5 कोशिकाओं / एमएल-जेल) में समुच्चय के आकार को प्रभावित (नहीं दिखाया डेटा) को विकसित करने के लिए विफलता का कारण बनता नहीं है। इस प्रकार, 10 6 कोशिकाओं / एमएल जेल encapsulate करने के लिए वांछनीय है।
कैप्सूल से कोशिकाओं को इकट्ठा करने में, Alg-CA हाइड्रोजेल Alg-पीएलएल कोटिंग एंजाइम या रसायनों के साथ भंग करने के लिए मुश्किल है, हालांकि alginate lyase या chelating अभिकर्मकों के साथ भंग किया जा सकता है। Alg-पीएलएल इसलिए शारीरिक रूप से उदाहरण के लिए, pipetting के साथ टूट जाना चाहिए। टूटी हुई झिल्ली centrifugation द्वारा कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है।
इनकैप्सुलेशन सिस्टम और कैप्सूल की चित्रा 1. छवियां। (ए) एक साफ बेंच पर Alg-CA encapsulation के लिए encapsulation प्रणाली की एक छवि। (बी) encapsulation के लिए एक सह-अक्षीय नोक के योजनाबद्ध छवि। (सी) इस रिपोर्ट में प्राप्त कैप्सूल के तीन अलग अलग प्रकार के। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एन 2 में एक सह-अक्षीय नोक से और 3% Alg ना समाधान की छोटी बूंद गठन की उपस्थिति (मैं, जम्मू) - चित्रा 2 कैप्सूल की आकृति विज्ञान पर 2 एन फ्लो का प्रभाव निरंतर छवियों (एच ए)।1 एल / मिनट प्रवाह (एक - डी, मैं) और 2 एल / मिनट (ई - एच, जे)। सतत छवियों हाई स्पीड कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया गया। Hydrogel कैप्सूल 2 CaCl 0.5% में बनते हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Alg ना चित्रा 3. प्रभाव और 2 CaCl एकाग्रता कैप्सूल की आकृति विज्ञान पर सतत छवियों (ए - एच)। और उपस्थिति - Alg ना की (मैं एल) 2 CaCl समाधान में बीच बढ़िया तालमेल बूंदों। - एच (ई) 50 मिमी 2 CaCl समाधान में बीच बढ़िया तालमेल कर रहे हैं - (डी ए) और 3% निरंतर छवियों में, Alg-ना, 2% के विभिन्न एकाग्रता होने बूँदों। सतत छवियों हाय द्वारा कब्जा कर रहे हैं-स्पीड कैमरा। सूरत छवियों Alg-ना, 2% (एल, जे) और 3% (कश्मीर, एल), और 2 CaCl, 50 मिमी (एल, कश्मीर) और 500 मिमी के विभिन्न सांद्रता द्वारा गठित Alg-CA कैप्सूल की रूपात्मक अंतर दिखाने (जम्मू, एल)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) नग्न, (:। कैप्सूल के तीन अलग अलग प्रकार में - (क्रमशः 4 1) 4, 6, 8 और 10 दिनों के लिए सभ्य आईपीएस सेल-समुच्चय के चित्रा 4. कैप्सूल में आकृति विज्ञान समझाया का माउस आईपीएस सेल समुच्चय सूक्ष्मछवि छवियों बी) में लिपटे, और (सी) खोखले कैप्सूल। क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इनकैप्सुलेशन संस्कृति प्रत्यक्ष निलंबन संस्कृतियों के साथ तुलना की जा सकती। निलंबन संस्कृति encapsulation के तरीकों की तुलना में स्टेम सेल की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक सरल तरीका है। हालांकि, निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं के एकत्रीकरण को नियंत्रित करने में अभी भी चुनौतीपूर्ण है। Encapsulation के विधि में, सेलुलर एकत्रीकरण कैप्सूल में सीमित है और इसलिए अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। पिछले एक प्रकाशन बड़े सेल clumps एक मुक्त निलंबन संस्कृति 7 में दिखाई दिया, जबकि समझाया कोशिकाओं, समान आकार के समुच्चय का गठन दिखाया। इसके अलावा, एक पहले रिपोर्ट मजबूत आंदोलन पुनश्च कोशिकाओं के प्रत्यक्ष निलंबन संस्कृतियों में सेलुलर मौत का कारण बनता है कि प्रदर्शन किया; इस प्रकार एक सीमित आंदोलन दर की जरूरत महसूस। इसके विपरीत, encapsulation के भी निलंबन की शर्तों के तहत कतरनी तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने में सक्षम है। निलंबन में कोशिकाओं से बढ़ रही है जब encapsulation के विधि इसलिए परिचालन की स्थिति में लचीलेपन का एक स्तर की अनुमति देता है।
"ove_content> इनकैप्सुलेशन बड़े पैमाने पर उत्पादन की प्रक्रिया के संशोधन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्टेम सेल शोध दोनों के लिए एक उपयोगी उपकरण है। स्टेम कोशिकाओं के encapsulation बाह्य मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों सहित स्टेम सेल आला शोध में उपयोगी है। कुछ शोधकर्ताओं ने दिखा दिया है कि वीईजीएफ़ संयुग्मित agarose हाइड्रोजेल में माउस ES कोशिकाओं के encapsulation रक्त मूल कोशिकाओं 8 में कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा दिया।यह लेख आसानी से सह-अक्षीय नोक और एन 2 प्रवाह का उपयोग करके आकार नियंत्रित Alg-CA कैप्सूल में माउस आईपीएस कोशिकाओं encapsulate करने के लिए कैसे पता चलता है। इस तरह के क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप 9 और बिजली के वोल्टेज के रूप में 10 विभिन्न उपकरणों के साथ कुछ encapsulation प्रक्रिया कर रहे हैं, एन 2 प्रवाह का उपयोग करके encapsulation के अन्य तरीकों की तुलना में एक सरल और सुरक्षित तरीका है। इसके अलावा, इस विधि (लगभग बड़ा माइक्रोन 600 से अधिक) क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ विधि से कैप्सूल छोटे फार्म करने में सक्षम है(लगभग बड़े से कम 3 मिमी)। बड़े कैप्सूल पूरी तरह से बीच बढ़िया तालमेल के लिए लंबे समय लेने के लिए और 2 CaCl में लंबे समय ऊष्मायन संभवतः सेलुलर विशेषताओं को प्रभावित करता है। इसके अलावा, बड़े कैप्सूल भी संभवतः ऐसे ग्लूकोज और ऑक्सीजन के रूप में पोषक तत्व या कचरे के बड़े पैमाने पर स्थानांतरण की एक समस्या है। इसलिए एन 2 प्रवाह (600 -1000 माइक्रोन) द्वारा गठित कैप्सूल के आकार के अंदर सेल संस्कृति के लिए आदर्श आकार है।
यह विधि छोटे कैप्सूल को तैयार करने और ठीक आकार को नियंत्रित करने के लिए उपयुक्त नहीं है। क्योंकि बूंदों के टूटने की वजह से, इस विधि 500 माइक्रोन की तुलना में छोटे कैप्सूल तैयार करने के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, कैप्सूल के आकार का निर्धारण कर सकते हैं केवल दृश्य अवलोकन, इस प्रकार यह इस विधि द्वारा कैप्सूल के आकार को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इस मामले में, microfluidic उपकरणों के उपयोग संभवतः इन समस्याओं को हल कर सकते हैं 11। Alg ना जैल 2 CaCl solut बैठक के तुरंत बाद हालांकि, क्योंकि कभी कभी clogging के microdevice में होता हैआयन।
Alginate क्योंकि इसकी उच्च चिपचिपाहट की रासायनिक संशोधन के लिए उपयुक्त नहीं है, यद्यपि यह खूंटी की तरह, encapsulation के लिए उपयोग करने के लिए भी मुश्किल है, जो हाइड्रोजेल साथ संकर कैप्सूल, बनाने में सक्षम है। पिछले एक प्रकाशन एक RGD पेप्टाइड संयुग्मित खूंटी Alg संकर हाइड्रोजेल कैप्सूल में माउस आईपीएस कोशिकाओं के encapsulation सेलुलर विकास 12 से सुधार दिखाया। रासायनिक संशोधन के बिना, बस हाइड्रोजेल कैप्सूल में कोशिकाओं के encapsulation स्रावित कारकों बनाए रखने के द्वारा स्टेम सेल आला संशोधित करने के लिए उम्मीद होगी। दरअसल, पिछले अनुसंधान एक microbioreactor में बनाए रखा secreted वृद्धि कारकों, स्टेम सेल भाग्य 13,14 को नियंत्रित करने में प्रभावी रहे थे कि प्रदर्शन किया।
कैप्सूल से कोशिकाओं के संग्रह अभी भी स्टेम सेल का बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए encapsulation के विधि के आवेदन के बारे में एक अनसुलझे मुद्दा है। पिछले एक रिपोर्ट है कि पीएलएल कोटिंग कश्मीर के लिए जरूरी है कि पता चला है कि7 अंदर eep माउस आईपीएस कोशिकाओं। Alg-CA हाइड्रोजेल कैप्सूल को अच्छी तरह से पीएलएल (प्रोटोकॉल 3.1-3.2) के रूप में एक polycation के साथ लेपित रहे हैं, यह या तो एंजाइम या chelating अभिकर्मकों से कैप्सूल को तोड़ने के लिए मुश्किल हो जाएगा। इस मामले में, सुई द्वारा pipetting के रूप में एक ऐसी यांत्रिक विधि (प्रोटोकॉल 4.3) की आवश्यकता है। centrifugation के संभवतः सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है, हालांकि एकत्र कोशिकाओं की वजह से उच्च जी बल के लिए 5000 × छ से अधिक से अधिक centrifugation पर टूट झिल्ली से अलग किया जा सकता है। इस प्रकार, धीरे कोशिकाओं से मलबे को हटाने के साथ ही कैप्सूल को तोड़ने की एक तकनीक encapsulation प्रौद्योगिकी के विकास में महत्वपूर्ण है। कुछ आगे विकास कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए इस पद्धति को लागू करने के लिए आवश्यक है, encapsulation के दोनों बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक आशाजनक तकनीक है और स्टेम सेल शोध।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse embryo fibroblast | Cell Biolabs | SNL 76/7 | |
| Mouse induced pluripotent stem cell | RIKEN Bio resorce centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM high-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES qualified FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacterial Antibiotics | GIBCO | 15240 | |
| Nonessential Amino Acid | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsin/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G needle | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Sodium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pump | AS ONE | ||
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
References
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
