Silencios de<em> BRCA2</em> Para identificar las funciones biológicas novedosas BRCA2 reguladas en células humanas cultivadas
Summary
Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Abstract
El silenciamiento de la proteína BRCA2 supresor de tumores y su detección por análisis bioquímicos convencionales representan un gran desafío técnico debido al gran tamaño de la proteína BRCA2 humano (aproximadamente 390 kDa). Se presenta modificaciones de transfección y inmunotransferencia protocolos estándar siRNA para silenciar BRCA2 humano y detectar la proteína BRCA2 endógeno, respectivamente, en las líneas de células epiteliales humanas. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de transfección siRNA ay dos rondas posteriores de siRNA transfección dentro del mismo experimento. El uso de estas y otras modificaciones en el protocolo estándar logramos consistentemente más de 70% silenciamiento del gen BRCA2 humano a juzgar por el análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-BRCA2. Además, la desnaturalización de los lisados de células a 55 ° C en lugar de la convencional 70-100 ° C y otras optimizaciones técnicas del procedimiento de inmunotransferencia permite la detección de la proteína BRCA2 intacta incluso when muy bajas cantidades de material de partida están disponibles o cuando los niveles de expresión de proteínas BRCA2 son muy bajos. Silenciamiento eficiente de BRCA2 en las células humanas ofrece una valiosa estrategia para interrumpir la función de BRCA2 en células con BRCA2 intacto, incluyendo las células tumorales, para examinar nuevas vías moleculares y las funciones celulares que pueden ser afectados por mutaciones BRCA2 patógenos en los tumores. La adaptación de este protocolo para el silenciamiento y el análisis de otros "grandes" como proteínas BRCA2 eficiente debe ser fácilmente alcanzable.
Introduction
El gen BRCA2 (cáncer de mama susceptibilidad gen-2) codifica para una proteína supresora de tumores que juega un papel crucial en la reparación de ADN de doble filamento se rompe mediante la regulación de la función de la enzima recombinasa Rad51 1. BRCA2 también ha sido implicado en la modulación de la transcripción y en el control del ciclo celular 2. Mutaciones de la línea germinal en el gen BRCA2 inducen una susceptibilidad autosómica dominante a cáncer de mama y de ovario en mujeres y el cáncer de próstata en hombres, así como predisposición a otros tipos de cáncer 3,4. Sin embargo, a pesar del aumento en el riesgo de desarrollar cáncer, mutaciones BRCA2 que suprimen o reducen la función BRCA2 pueden hacer que las células cancerosas sean más vulnerables a los agentes quimioterapéuticos que causan daño en el ADN de 5-7. Cánceres esporádicos presentan una baja tasa de mutaciones BRCA2 (<3%) a pesar de los niveles reducidos de la proteína BRCA2 han sido detectados en algunos tipos de cáncer, lo que sugiere que la proteína BRCA2se puede perder durante la tumorigénesis en cánceres esporádicos a través de mecanismos no mutacional dependientes 7,8. Por lo tanto, es importante para entender completamente las funciones de BRCA2 en el contexto de la biología del cáncer, así como en otros entornos biológicos.
Una poderosa herramienta utilizada para identificar nuevas funciones de un gen en células de mamífero es silenciar su expresión. Como un ejemplo, silenciamiento de la expresión de BRCA2 en una variedad de células epiteliales normales ha conducido recientemente a la identificación de una nueva función de BRCA2 como regulador de la resistencia a la anoikis, un paso importante durante la adquisición de la capacidad invasiva de células de cáncer metastásico y 9. El silenciamiento génico puede conseguirse mediante la introducción en las células ya sea de interferencia (SI) de ARN pequeño o corto horquilla (sh) moléculas de ARN dirigidas a la gen específico. La alta potencia de siRNA y su facilidad de uso lo convierten en la herramienta preferente para silenciar a los experimentos encaminados a la obtención de nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos críticos unnd para identificar nuevas dianas terapéuticas. Sin embargo, desmontables eficiente de la expresión génica puede no ser fácilmente alcanzable para todos los genes y puede ser muy variable dependiendo del tipo de célula. Debido a una disminución en los niveles de proteína intracelular es el fenotipo más relevante bajo investigación, es crucial para cuantificar el silenciamiento de genes por análisis de inmunotransferencia del producto del gen. Con este sentido, la proteína BRCA2 presenta otro desafío: ser una proteína grande (aproximadamente 390 kDa), existen dificultades técnicas para el análisis bioquímico convencional, incluyendo inmunotransferencia.
Presentamos aquí un protocolo optimizado para silenciamiento eficiente de BRCA2 en líneas de células epiteliales humanas y para la detección rápida y exitosa de la proteína BRCA2 desmontables por inmunotransferencia análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a que las mutaciones en la línea germinal del gen BRCA2 plomo a un mayor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer femenino y masculino de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, y el melanoma 3,4, una serie de estudios se han realizado para entender la función biológica de la proteína BRCA2. La mayoría de estos estudios son principalmente basados en genética debido a dificultades técnicas en el análisis de una proteína gigante como BR…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
Materials
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
Referencias
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