Summary

동시<em> 생체</em두 망막의> 기능 테스트로<em> 생체</em> 전위도 시스템

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

전위도 (ERG)은 빛에 의해 트리거 망막의 전기 활동을 기록 할 수있는 잘 확립 된 기법이다. ERG 신호는 망막의 세포 외 공간 저항에 흐르는 전류에 의한 방사 전압 변화 (감광체 바이폴라 셀의 축 방향)에 의해 주로 생성된다. 제 ERG 신호 은점 (1)의 표면으로부터 그렌에 의해 1865 년에 기록되었다. Einthoven 유쾌한 1908 2 B-, A-라는 세 가지 파도에 빛의 발병 ERG 응답, 및 C 파 지금 쌍극 세포, 감광체 주로 활동을 반영하는 것으로 알려져 있으며, 색소 상피를 분리 세포, 각각 3-8. 에르그 지역 (미소 전극과 (생체) 고립 그대로 망막에 걸쳐, 고립 된 눈 준비 (9)에서, 마취 동물 또는 (생체 내) 인간의 눈에서 3,10-15 또는에서 특정 망막 층을 기록 할 수 있습니다ERG) 4,16. 이들 중에서, 생체 ERG 현재 망막 기능을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 또한 진단 목적으로 이용 될 수 있거나 또는 동물이나 환자의 망막 질환의 진행을 따라 비 침습적 방법이다. 그러나 생체 내 에르그 녹음은 종종 안구 생리 소음 (예, 호흡과 심장 활동)에 의해 오염, 여러 중복 구성 요소와 복잡한 신호를 생성한다.

로컬 ERG는 망막의 특정 층에 걸쳐 신호를 기록하기 위해 사용될 수 있지만, 가장 침습적이고 다른 ERG 기록 구성과 비교하여 낮은 신호대 잡음비 (SNR)를 갖는다. 지역 망막 전위도 기술적으로 요구하고 고가의 장비 (예를 들어, 현미경과 미세 조작기)가 필요합니다. 그대로 고립 된 망막에서 Transretinal ERG (생체 ERG)는 안정적이고 HIG을 허용 생체 내 및 지역 에르그 방법 사이의 타협을 제공합니다동물이나 인간 (17)의 손상 망막에서 시간 SNR 녹음. 최근에,이 방법은 포유 동물, 영장류 및 인간 망막 18-20에 막대와 콘 감광체 기능을 연구하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 또한, 인해 생체 망막 색소 상피 세포의 부재로, ERG 신호의 포지티브 형 C 파 성분을 제거하고 눈에 띄는 네거티브 느린 PIII 성분은 생체 녹화 드러난다. 느린 PIII 성분은 망막 21-23에서 뮐러 아교 세포의 활성에서 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, 생체 외 ERG 방법도 그대로 망막 뮐러 세포를 연구하기 위해 사용될 수있다. 여러 연구는 또한 생체 ERG 레코딩은 망막 (24) 주위되는 약물의 농도를 측정하고, 약 25 ~ 27의 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용될 수 보여 주었다.

생체 시스템의 여러 상업이 가능하며,반드시 광범위한 전기 생리학 배경이없는 많은 실험실에서 사용. 대조적으로, 체외 장치 (17)는 최근까지 극소수 실험실은이 강력한 기술을 활용되는 결과로서 사용할 수 없었다. 그것은 망막의 생리와 병리에 대한 우리의 지식을 향상하고, 질병을 눈부신에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 더 많은 실험실에 생체 에르그 녹음을 사용할 수 있도록하는 것이 도움이 될 것입니다. 우리는 여기에 간단하고 저렴한 생체 ERG 장치 (17)을 설명하고는 일단이 상기 조작 패널 및 원뿔 – 매개 신호를 기록하는 몇몇 시판 생체 ERG 시스템과 조합하여 사용될 수있는 방법을 보여준다 (A- 및 B- 파)와 함수 그대로 야생형 마우스 망막에서 뮐러 세포 (PIII을 느리게).

Protocol

모든 실험 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라했고, 워싱턴 대학의 기관 동물 연구위원회에 의해 승인되었다. 1. 관류 및 시편 홀더 설정 실험의 날에 신선한 망막 관류에 대한 솔루션을 준비합니다. 증류수 및 탈 이온수를 사용합니다. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용합니다. 미디어와의 NaHCO3 1.9 G : '에임스 1 병 (1ℓ) 솔루?…

Representative Results

우리는 암순응 야생형에서 플래시 응답을 기록 실험 프로토콜 표준 관류 다른 해결책 (도 2)를 사용하여 상술 한도 1에 도시를 수행하여 (WT) C57BL / 6 마우스의 망막. 응답 파형과 반응 속도뿐만 아니라로드 광 수용체의 민감도는 에임스 '와 로크의 미디어 (그림 2A와 B)에서 유사 나타났다. 한편, HEPES 완충 링거액 (NO 중탄산염 또는 5 % CO 95분의 2 %의 O <…

Discussion

우리는 여기서 생체 ERG 어댑터와 함께 생체 ERG 시스템 구성 요소를 사용하여 두 개의 격리 된 마우스의 망막 동시에 고품질 생체 ERG 녹화를 얻기위한 중요한 단계를 보여준다. 본 연구에서 우리는 동일한 용액 (어느 에임스 ', 로크 또는 링거)과 동물 모두에서 망막 관류하지만 약물 테스트를 위해 상이한 솔루션 각 망막 관류하는 것도 가능하다. 고품질…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH 보조금 EY019312과 EY021126 (VJK), 워싱턴 대학 안과학 교실 및 Visual 과학에 EY002687에 의해 지원되었다, 연구에 의해 실명을 방지 할 수 있습니다.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

Referencias

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Citar este artículo
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

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