Summary

Eşzamanlı<em> Ex vivo</emİki retina> Fonksiyonel Test tarafından<em> In vivo</em> Elektroretinogram Sistemi

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

Elektroretinogram (ERG) ışıkla tetiklenir retina elektriksel aktivitesi kaydetmek için kullanılabilen bir köklü bir tekniktir. ERG sinyal retinanın rezistif dışı uzayda akan radyal akımların neden olduğu gerilim değişiklikleri (fotoreseptör ve bipolar hücrelerin ekseni boyunca) ağırlıklı olarak üretilir. İlk ERG sinyali bir balık gözü 1 yüzeyinden Holmgren, 1865 kaydedilmiştir. Einthoven ve Jolly 1908 2 b-, a- denilen üç farklı dalgaların içine ışık başlangıcından ERG yanıtı, ve c-dalgalar, şimdi bipolar hücreler ON fotoreseptör esas aktivitesini yansıttığı bilinmektedir ve pigment epiteli bölünmüş Hücreler sırasıyla 3-8. ERG, yerel (mikroelektrotla (ex vivo) izole sağlam retina arasında, izole edilmiş bir göz Hazırlama 9'da elde edilen, anestezi uygulanmış hayvanlar ya da (in vivo) insan gözüyle 3,10-15 ya arasında belirli bir retina katmanları kaydedilebilirERG) 4,16. Bunlardan in vivo ERG şu anda retina fonksiyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu teşhis amaçlı kullanılabilir veya hayvanlarda veya hastalarda retina hastalıklarının ilerlemesini takip etmek invaziv olmayan bir tekniktir. Ancak, in vivo ERG kayıtları genellikle ekstraoküler fizyolojik gürültü (örneğin, solunum ve kalp aktivitesi) ile kirlenmiş, birkaç örtüşen bileşenleri ile karmaşık bir sinyal üretmek.

Yerel ERG retina spesifik katmanlar arasında sinyalini kaydetmek için kullanılabilir, ancak, en invaziv ve diğer ERG kayıt konfigürasyonları ile karşılaştırıldığında düşük bir sinyal-gürültü oranı (SNR) sahip olmasıdır. Yerel ERG ayrıca teknik olarak ve pahalı donanımları (örn mikroskop ve mikromanipülatörler) gerektirir. Sağlam, izole retina gelen Transretinal ERG (ex vivo ERG) istikrarlı ve HIG izin in vivo ve yerel ERG yöntemleri arasında bir uzlaşma sunuyorhayvanlar ya da insanlar 17 sağlam retina h SNR kayıtları. Son zamanlarda, bu yöntem, memeli primat ve insan retina 18-20 çubuk ve koni fotoreseptör fonksiyonunu incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo olarak, retina pigment epiteli olmaması, ERG sinyalinin pozitif Cı dalga bileşeni çıkarılır ve önemli bir negatif yavaş PIII bileşeni ex vivo kayıtları ortaya çıkar. Yavaş PIII bileşeni retina 21-23 Müller glia hücrelerinin aktivitesi kaynaklı gösterilmiştir. Bu nedenle, ex vivo olarak ERG yöntemi de sağlam retinada Müller hücreleri incelemek için kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda da bu ex vivo ERG kayıtları retina 24 civarında farmakolojik ajanların konsantrasyonu ölçmek ve uyuşturucu 25-27 güvenliğini ve etkinliğini test etmek için kullanılan olabilir göstermiştir.

In vivo sistemlerde birden fazla ticari mevcuttur vemutlaka geniş elektrofizyoloji altyapıya sahip olmayan birçok laboratuvarlarında kullanılan. Buna karşılık, ex vivo cihazlar son zamanlarda 17 kadar ve sadece çok az laboratuarlar anda bu güçlü tekniği yararlanarak bir sonucu olarak mevcut olmamıştır. Bu retina fizyolojisi ve patolojisi hakkında bilgimizi ilerletmek ve hastalıkları kör için yeni tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla laboratuvarlara ex vivo ERG kayıtları kullanılabilir hale getirmek için yararlı olacaktır. Burada, bir basit ve uygun fiyatlı bir ex vivo ERG aygıtı 17 göstermektedir ve bu çubuk ve koni aracılı sinyal kaydetmek için çeşitli ticari olarak temin edilebilir, in vivo ERG sistemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir göstermek (a- ve b-dalgası) ve fonksiyonu görmemiş vahşi tip fare retinaları Müller hücrelerinin (PIII yavaş).

Protocol

Tüm deneysel protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Washington Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Perfüzyon ve Numune Tutucu Kurma Deney gününde taze retina perfüzyonu için çözelti hazırlayın. Distile ve deiyonize su kullanın. Aşağıdaki üç çözümlerden birini kullanın. , Medya ve NaHCO 3 1.9 g 'Ames 1 şişe (1 L) çözeltisi' A…

Representative Results

Bu koyu adapte yabani tip flaş yanıtları kaydedildi deney protokolleri farklı standart perfüzyon için solüsyonlar (Şekil 2) ile, yukarıda tarif edilen ve Şekil 1 'de gösterilen izleyerek (WT), C57BL / 6 fare retinaları. tepki dalga ve kinetik yanı sıra çubuk fotoreseptör duyarlılığı Ames "ve Locke'un medya (Şekil 2A ve B) benzer çıktı. Öte yandan, HEPES-tamponlu Ringer çözeltisi (Resim bikarbonat ya da% 5 CO …

Discussion

Biz burada bir ex vivo ERG adaptörü ile birlikte in vivo ERG sistem bileşenlerini kullanarak iki izole fare retina aynı anda yüksek kaliteli ex vivo ERG kayıtları elde etmek için kritik adımlar göstermektedir. Bu çalışmada, aynı solüsyonu (ya Ames ', Locke ya da Ringer) ile hayvandan her iki retina perfüze ama uyuşturucu test amaçlı, farklı bir çözüm örneğin her retina serpmek de mümkündür. yüksek kaliteli veri elde etmek için en öneml…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe EY019312 ve EY021126 (VJK), Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Görsel Bilimler EY002687 tarafından desteklenen ve Araştırma tarafından Körlük Önlemek için.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

Referencias

  1. Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Play Video

Citar este artículo
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

View Video