Introduction
临床相关，模拟白内障手术，这里所描述的体外上皮伤口愈合模型的开发是为了提供调查，在响应于损伤调节修复上皮组织的机制的一种工具。在创建该模型旨在为关键特征包括1）提供条件精密地复制在体内响应于伤人在培养设置，2）缓和调制修复的调控元件，以及3）能力图像的修复过程中，其整体，在实际时间。我们面临的挑战，因此，是在细胞的天然微环境创造一种文化模式，即有可能学习和操作，上皮创面修复。这种创伤修复模型的有效性开辟了新的可能性，标识来自调节修复过程基质蛋白，细胞因子和趋化因子的内源性信号提示。另外，该模型是理想的研究如何一Ñ 上皮能够移动作为集体片重新epithelialize伤口区域2,3，和用于确定在伤口边缘起作用的引导受伤上皮4的集体迁移间充质领袖细胞的谱系。这种模式还提供了一个用以标识疗法，可以有效的促进伤口愈合，防止异常创面修复5的平台。
目前已经有许多可用的创伤修复模式，无论是在文化和体内 ，它提供了当今大多数所谓对伤口修复过程。在动物损伤模型，如角膜6-12和皮肤13-17，有研究的组织的响应伤人的所有修复介质是可以参与的过程中，包括来自所述的上下文中，机会血管和神经系统。但是，也有限制操纵experi体内的精神的条件下，它是目前无法进行体内修复反应的成像研究，随时间连续。与此相反，大多数体外伤口修复培养模型，如划痕，可以很容易地操纵和随后随着时间的推移，但缺乏研究伤口愈合中的体内组织的环境背景。虽然体外模型提供了细胞的微环境加上调节修复的分子调节的过程中的任何时间点的能力范围内不断研究损伤修复过程中随着时间的优势，很少有车型适合这些参数。
这里描述的方法，以产生高度可重复的离体上皮的伤口愈合是再现上皮组织的响应于生理伤人培养物。使用鸡胚镜头作为组织源， 体外 MOCķ白内障手术被执行。该透镜是一种理想的组织用于这些研究，因为它是自包含在一个厚的基底膜胶囊，无血管，没有神经支配，且没有任何相关联的基质18,19。在人类疾病，白内障手术涉及视力丧失，由于透镜的混浊，并且包括除去晶状体纤维细胞块，其包含大量的透镜组成。白内障手术后视力是通过人工眼内透镜的插入恢复。在白内障手术过程中，通过除去纤维细胞，诱导在相邻透镜上皮，这是为了响应通过再上皮晶状体囊的后部区域已被占用的纤维细胞的损伤的反应。在白内障手术中，因为在大多数伤口修复反应，还有，有时会发生的异常纤维化结果向伤口愈合反应，与肌纤维母细胞的出现，这在透镜被称为后验Capsu相关联乐混浊20-22。为了产生白内障手术伤口愈合的模型，一个白内障手术的过程是模仿从鸡胚眼中除去产生生理损伤镜头。显微手术切除晶状体纤维细胞导致的晶状体上皮细胞包围着一个非常一致的圆形伤口面积。该细胞群保持牢固地附着在透镜基底膜胶囊和由外科手术过程中受伤。上皮细胞迁移到内源性基底膜的裸露面积愈合伤口的带动下，在维修过程中被称为领导者细胞1波形丰富的间充质细胞群。用该模型的上皮损伤的响应可容易地可视化并随后随时间在细胞的微环境的上下文中。细胞是易于接触到的表达或活化有望发挥在伤口修复中的作用的分子的修饰。日的一项强大功能是模型是分离和研究在伤口愈合的框架迁移特异性改变的能力。准备大量老年匹配体外伤口愈合培养物用于研究的能力是该模型的另一优点。因此，这个模型系统提供了一个独特的机会，梳理出创面修复机制和试验治疗为他们的伤口愈合过程中的作用。预计在体外模拟白内障手术模式，具有广泛的适用性，为研究损伤修复机制的重要资源。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
下面的协议符合托马斯·杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会的指导方针，并与ARVO声明为动物的视觉研究使用。
1.安装镜头，并准备于离体培养伤口
- 将3座100 25mm培养皿在无菌的层流罩。填充两个的中途用Tris /葡萄糖缓冲培养皿（TD缓冲器; 140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，0.7毫的Na 2 PO 4，5mM的D-葡萄糖，8.25毫摩尔Tris碱，pH值至7.4，用HCl）在RT ，留下第三空。预暖培养基（媒体199补充有1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）至37℃。
注意：标准伤口愈合的培养基是无血清，如发生在体内 ;然而，在伤口修复培养可以成功地在确定的培养基条件包括血清或其他因素生长。 - 沃取出胚胎ðAY从孵化器15白来航鸡鸡蛋（37.7℃，温和的摇摆举行）
- 放置在层流罩和清洁外壳用70％的乙醇从洗瓶选择蛋。进行在层流罩下面在无菌条件下所有的程序，用无菌溶液和仪器。
- 裂纹蛋和地点的内容为空百毫米培养皿。使用标准镊子和剪刀精胚斩首。将鸡胚头中含有的TD缓冲培养皿并适当处理的胚胎的其余部分。任选保持于TD缓冲鸡胚磁头的短时间内，不超过15分钟。
- 将鸡胚头部上的培养皿盖。采用高精度镊子，随着从眼及其连接玻璃体以下顺序取下镜片。捏眼睛后部与镊子创建一个小的开口在眼睛的后部。
- 然后，把握玻璃体W¯¯第i镊子轻轻用力拉玻璃体与滚动运动，附着在透镜玻璃体将从眼移位。地方镜头/玻璃体中含有TD缓冲区剩余的培养皿。让镜头留在TD缓冲的时间不能超过30分钟。
- 移动透镜到一个新的培养皿盖子在解剖显微镜下。从这点上执行在解剖显微镜下的所有步骤。以高精度镊子小心刷掉任何睫状体（色素细胞），这些使用镊子的边缘，同时小心不要损坏晶状体组织脱落与透镜。
注意：卸下睫状体确保那些不是内源的透镜的细胞类型不包括在伤口修复培养。 - 通过从与后晶状体囊关联夹断玻璃体分开玻璃体以高精度镊子镜头。
- 采用高精度镊子镜头转移到小降TD的缓冲液（约200微升）在一个35mm的组织培养皿。
2.执行模拟白内障手术
- 定向在TD缓冲在35mm培养皿与透镜的朝上的前方面的下降的透镜。
注意：该透镜的前部很容易被致密环在该注意到的晶状体上皮的前部和赤道区域之间的边界的组织的存在识别。与此相反，存在于所述晶状体囊到的晶状体纤维细胞附着的后部不存在标记。 - 使用两个高精度镊子作一小切口（大约850μm）的前晶状体囊中，粗基底膜围绕晶状体组织，和其相关联的前晶状体上皮的中心，通过抓住与一个钳组织中的每个手轻轻揪着相反方向。
- 取出纤维细胞块，它构成了大部分的晶状体组织，dislod的从附件晋它的晶状体上皮和水力洗脱（经典白内障手术使用的方法，仿照图1A）周围的晶状体囊。
- 填充1ml注射器用27.5ģ针尖与300微升的TD缓冲液中。插入针头尖端插入在晶状体前囊制成的切口，和大约一半到透镜。
- 轻踏注射器注入TD缓冲区进入晶状体纤维细胞团。注入微升50至200 TD，且绝不超过300微升。观察纤维细胞团从上皮和晶状体囊放松自己。
- 采用高精度镊子，通过前切口部位取下镜头松动的纤维细胞团。
注：此过程留下晶状体后基底膜囊到纤维细胞已附着在剥蚀细胞，和一个受伤的晶状体上皮只是毗邻这个网站。
3. Preparin克受伤的镜头体外培养
- 平坦化透镜囊袋而导致的上述的培养皿的白内障手术，细胞面朝上，通过使5削减囊袋的前方面。
- 通过在透镜的赤道切割垂直于原始切口部位。弄平晶状体囊所得五“护翼”与培养皿胶囊侧附上皮下来，细胞侧朝上。注意体外受伤的镜头，现在需要一个明星或花形的形状（ 见图1B）。
- 为了保证胶囊的菜，请用钳子轻轻向下在每个点的明星。这将使一个小凹部，外植体的五个最外的技巧，并导致持续附着到培养皿中。
注意：可以在此过程中损坏的胶囊，因此它以固定胶囊的菜接近的FLA的前端是重要ps的越好，以及使最少量的固定点的作为可能的（一般两，最多三个每瓣）。 - 从35毫米培养皿中取出的TD缓冲器，并将其与1.5预热介质毫升替换。覆盖35mm的培养皿与其盖并置于培养箱（37℃，5％CO 2）。
4.分离中央迁移区（CMZ），在那里再上皮后囊的创面的发生，从原始附件晶状体上皮细胞的区（OAZ），定量分析。
注：细胞开始响应损伤立即移动到CMZ区域。通过在培养一天足够的细胞迁移横跨CMZ分子和生化分析，继CMZ和OAZ通过显微解剖23分离。该协议涉及除去一个翼片（OAZ）中的从胶囊的受伤区域中的时间。
- 观察德玛尔阳离子，在解剖显微镜下清晰可见，在OAZ和CMZ之间（ 见图2A）。使用两个高精度镊子，两手抓，钳子在OAZ / CMZ线，一条仅仅相邻的其它的边缘，上线的两侧（参见图2A，B，箭头）。
- 用一只手/在CMZ一边一个镊子继续守住伤员文化，同时用另一只手/镊子，轻轻一拉沿着OAZ / CMZ线OAZ。该CMZ容易分开沿着这条线的OAZ。沿围绕整个文化这条线继续下去，直到两个地区是完全分开的。
- 研究分离OAZ和CMZ分数进行分子分析，例如RNA测序24或生化分析，如蛋白印迹或免疫共沉淀23,25。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
离体模型创建研究伤口愈合过程中的细胞的天然微环境
调查涉及细胞的微环境原生内调节上皮伤口愈合机制，创建了一个临床相关的体外模拟白内障手术模式。这个模型是从晶状体组织提供了许多优点，由于其内在特性创建：1）透镜是一个自包含的器官由粗基底膜称为晶状体囊包围; 2）它是无血管，3）没有神经支配和4）免费相关基质。因此，检查了修复过程仅限于细胞是先天的透镜适当。为了创建这个模型中，透镜从胚胎（E）的第15天的小鸡胚胎（ 图1A）除去。一个小切口，在晶状体前囊和其相关联的晶状体上皮细胞，通过该透镜纤维细胞块被移除通过水力洗脱，创建一个生理相关伤人（ 图1A）的经典白内障的过程。的晶状体上皮，这是目前作为沿前细胞和晶状体囊的赤道方面围绕纤维细胞块，连同其内源性的波形蛋白富含间充质修复细胞祖细胞1群的连续单层，在留在透镜提取纤维细胞（ 图1A）。在除去纤维细胞团，五切口的在晶状体囊的前方面和上皮扁平细胞面朝上，面向平台。此过程使受伤的上皮细胞的各种微观的方法，包括时间推移显微镜（ 视频1）响应的成像。在晶状体前囊这些附加切口创建伤员透镜的星形植与由岑除去纤维细胞块创建的圆形伤口之三植（ 图1B）。白内障手术后的组织的扁平化，伤员上皮位于星，它被称为原始附件区（OAZ）的点（ 图1A，B）。
该从其附着部位的晶状体后囊切除纤维细胞团创建了一个高度重复性的伤口面积的基底膜，用受伤的上皮细胞所包围 （ 图1B中的C）。的透镜赤道上皮的暴露边缘，只是相邻于被附着在纤维细胞，是伤口的前缘。紧接损伤，波形蛋白富含间充质修复细胞亚群被激活，并迁移至上皮1的伤口边缘。的晶状体上皮，与这些间充质修复细胞在它们的前缘，快速移动到内源性b的无细胞区asement膜囊，中央迁移区（CMZ），开始愈合的伤口。晶状体上皮细胞移动的统称，作为片材，进为首的间充质领袖电池1，其延伸突起沿着基底和指导伤口愈合过程的CMZ（F igure 1D，视频1）。伤口愈合的进展，覆盖伤口（67％）1天在培养物（ 图1C）的一个显著区域，并且通常内培养3天（ 图1B中的C）完成。
一个明显的物理区别可以在OAZ和CMZ区域之间进行早1天，这是界定为这两个区域（ 图2A，箭头）之间的折痕或皱纹。这种现象提供了思路由在分离这些区域在伤口愈合过程中的任何点。用细尖镊子，文化可以是微观解剖SEPAR吃了OAZ和CMZ地区，以分析这些不同的区域（ 图2B）之间的差异的分子。这是已经被用于标识与伤口修复有关的迁移特异性改变一个功能强大的方法。在此之前，人们发现，有伤口愈合过程5中的增加粘着斑激酶（FAK）的活化在体外伤员培养物。 FAK在细胞迁移26-29行之有效的作用。的能力，以丰富的OAZ与CMZ现在使得能够检查这种增加的FAK的激活是否是特定于迁移特定CMZ区域。对于这项研究中，OAZ和CMZ区域上分离天1 - 3（整个伤口愈合过程）和在FAK的激活（FAK pY397）生物化学变化进行分析。结果表明，增加的FAK活化与迁移特定CMZ区域（ 图2C）相关联。该这里描述的体外模型系统提供了在其调查参与协调创伤修复过程中的分子节目的独特和宝贵的机会。
图1.创建一个体外模型，其中，研究细胞的天然微环境中的伤口愈合过程中响应于生理伤人。白内障模拟手术上E15小鸡镜片进行的。晶状体纤维细胞块（白色）是通过在所述前囊由水力洗脱的切口移除。这个过程留下上皮细胞（绿色），该保持牢固附着到晶状体囊和小区裸露基底膜（BM）到其上的细胞会迁移到愈合伤口（A）中 。五切口向上皮变平，并创建一个星形体外崇拜 URE（B）。残留的晶状体上皮细胞，填补了星点被称为原始附件区（OAZ）（A，B）。裸露的BM到其上的细胞将迁移被称为中央迁移区（CMZ）（A，B）。立即响应于损伤，细胞开始移动到CMZ区域上的小区裸露的BM（B）中 。开放性伤口面积进行定量随时间（C）中。伤口愈合通常通过D3中培养（B，C）完成。在（B，C）T0表示伤人的时候，D1-3表示1-3天。内的CMZ，细胞的两个群体可以区分，晶状体上皮细胞和间充质领导细胞定位于伤口边缘，沿着基材（D）延伸的突出部。这个数字是从Menko 等 23重印。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图2.分离OAZ和CMZ区域以识别与伤口愈合相关的迁移特异性改变，通过每日1次，OAZ和CMZ区可以从彼此区分由一个折缝（箭头），它可以用来作为指导以分离这些区域（A）。在此折痕，细尖镊子可以用于夹住OAZ / CMZ线的边缘。文化可以沿着这条线让OAZ和CMZ区（B）的隔离分开。显微解剖的OAZ和CMZ每天，从（D1）的第1天 - 第3天（D3）进行，以确定是否发生在创伤修复的区域中的FAK的激活迁移特异性改变。从各区域的用裂解液Western印迹分析或者FAK激活（pFAK Y39检查7）或总FAK表达（C）。而观察到在总FAK水平的变化不大，在增加的FAK活化与迁移特定CMZ区（C）相关联。
视频1.在体外模拟白内障手术模型创面愈合之后是时间推移显微镜从时间0伤后通过向第3天伤口闭合，从伤口区域的中心观看。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
- Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
- Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
- Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
- Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
- Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
- Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
- Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
- Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
- Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
- Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K.
- Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
- Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
- Schmidbauer, J. M., et al.
- Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
- Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
- Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
- Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
- Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
- Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
- Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
- Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Ferguson, M. W., O'Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
- Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
- Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
