Introduction
Die meisten Bakterienzellen sind in der Lage, sowohl planktonischen (frei lebende) und oberflächengebundenen (sessile) Modi des Wachstum 1 einzusetzen. In der Oberfläche gebundenen Modus des Wachstums von Bakterienzellen zu sekretieren und umhüllen sich in großen Mengen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), Biofilme bilden. Die EPS besteht hauptsächlich aus Proteinen, Exopolysaccharid, extrazelluläre DNA und ist wichtig, um die Biofilmbildung 2. Sie dient als physikalische Gerüst durch die Bakterien nutzen können, um räumlich unterscheiden und schützt die Bakterien vor schädlichen Umweltbedingungen und Wirtsreaktionen. Verschiedenen Bestandteile EPS haben verschiedene Rollen in der Biofilmbildung 3 und Veränderungen in der Expression von EPS Komponenten drastisch umzuBiofilmStrukturen 4. EPS-Komponenten können auch als Signalmoleküle 5 und neuere Studien hat bestimmte EPS wirkenden Komponenten mit mikrobiellen Zellen gezeigt, ihre Migration und Biofilm diff Führungserentiation 6-8.
Forschung an der EPS hat stark erweiterte auf die morphologische Analysen von Biofilmen von Mutanten in einer bestimmten Komponente der EPS 9,10 defekte produziert basiert. Darüber hinaus wird die EPS üblicherweise am Makromaßstab (bulk Charakterisierung) 11 gekennzeichnet. Morphologische Analyse kann jedoch quantitative Detail und Groß Charakterisierung, die Durchschnittswerte zurückkehrt, verliert den Details, die in der Heterogenität des Biofilms besteht fehlt. Es gibt nun eine steigende Tendenz auf Echtzeit-Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von EPS im Mikromaßstab fortschreiten. Dieses Protokoll zeigt, wie partikel Tracking Mikrorheologie Lage ist, die Raumzeit-Wirkungen von Matrixkomponenten Pel und Psl Exopolysaccharide an die Viskoelastizität und eine effektive Vernetzung von Pseudomonas aeruginosa Biofilm 4 bestimmen.
Passive Mikrorheologie ist eine einfache und kostengünstige rheology Methode, die den höchsten Durchsatz räumlicher microrheological Abtastung eines Materials Datum 12,13 bildet. In passiven Mikrorheologie werden Sonden Kugeln in der Probe platziert und deren Brownsche Bewegung, die durch thermische Energie (k B T) angetrieben wird durch Videomikroskopie verfolgt. Mehrere Teilchen gleichzeitig verfolgt werden, und die zeitabhängigen Koordinaten der Partikel folgen einer herkömmlichen Zufallsbewegung. Im Mittel also, bleiben die Teilchen an der gleichen Position. Ist die Standardabweichung der Verschiebungen oder der mittlere quadratische Verschiebung jedoch (MSD) der Partikel, nicht Null ist. Seit viskosen Flüssigkeiten fließen, die Partikel MSD in einem viskosen Fluid wächst linear fortschreitender Zeit. Im Gegensatz dazu ist das polymere Vernetzung in viskoelastischen gefunden oder elastische Stoffe helfen ihnen, Strömung zu widerstehen, und Partikel werden in ihrer begrenzten Verschiebung, was zu Hochebenen in der MSD-Kurve (Abbildung 1A). Diese Beobachtung folgt die Beziehung MSDαt
Die Grße, Dichte und Oberflächenchemie der Partikel sind für die korrekte Anwendung der microrheological Experiment und sind mit Bezug auf das untersuchte System gewählt (in diesem Fall können die Polymere der Biofilmmatrix siehe 1B). Zunächst misst die Partikel die Rheologie der Substanz mit Strukturen, die viel kleiner als die Teilchen selbst sind. Wenn der Substanz Strukturen sind in ähnlicher Größenordnung an das Teilchen, die Bewegung des parkel wird durch die Form und Ausrichtung der einzelnen Strukturen gestört. Wenn die Strukturen das Teilchen umgebenden viel kleiner sind, jedoch ist dieser Effekt klein und ausgemittelt werden, präsentiert eine homogene Umgebung an das Teilchen (1B). Zweitens sollte die Dichte der Teilchen ähnlich wie das Medium (1,05 g ml -1 für wässrige Medien) sein, dass die Sedimentation vermieden wird, und die Trägheitskräfte vernachlässigbar sind. Die meisten Partikel mit Polystyrol-Gittern die genannten Kriterien erfüllen. Idealerweise hat das Teilchen nicht mit den Polymeren der Biofilmmatrix interagieren, wie die rheologischen Auslegung des Partikel MSD ist nur gültig, wenn eine Bewegung zufällig ist, durch thermische Energie und eine Kollision mit Substanz Strukturen angetrieben. Dies kann durch Prüfen, ob die Sonde Teilchen dazu neigt, zu binden oder abprallen die Oberfläche eines vorge gewachsenen Biofilm beobachtet werden. Trotz des Fehlens von Anziehung zu dem Biofilm, müssen die Partikel in der Lage, in die Matrix eingebaut werden kann.Darüber hinaus kann die physikochemischen Heterogenität des Biofilms in verschiedenen Teilchen mehr als Sonden in den verschiedenen Regionen des Biofilms geeignetes führen. Daher sollte von Partikeln unterschiedlicher Größe und Oberflächenchemie zum Biofilm angewendet werden.
Als solches ist die Partikel MSD in der Lage, nützliche Informationen über die verschiedenen Komponenten beitragen, die Rheologie und die Ausbreitung des Biofilms ist. Weiterhin ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Sonden, um eine Information über die räumliche physikochemischen Heterogenität des Biofilms abzuleiten. Dieses Verfahren auf gemischter Arten Biofilmen verwendet werden, um die Wirkung antimikrobiellen Behandlung auf die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu testen, oder aufgebracht zu untersuchen, wie sich die mechanischen Eigenschaften des Biofilms werden aus der Einführung einer anderen Spezies verändert. Partikel MSD können auch nützlich für die Charakterisierung von Biofilm dispersal. Solche Studien wäre hilfreich, in unserem Verständnis von Biofilmen, die möglicherweise verbessern Biofilm-Behandlungen einnd Engineering von Biofilmen für nützliche Tätigkeiten.
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Protocol
1. Biofilm Anbau
- Zubereitung von Bakterienstämmen
- 1 Tag vor Biofilm Anbau, vorzubereiten planktonischen Bakterienkulturen durch Inokulation von 2 ml geeigneten Wachstumsmedium aus gefrorenem Bakterienkultur. Verwenden Luria-Broth-Medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 Hefeextrakt und 10 g L -1 Trypton) zum mucoid P. aeruginosa und dessen Δ pel und Δ psl Defektmutanten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 200 rpm schütteln Bedingungen. Verdünnte-Nacht-Kulturen auf eine OD600 von 0,40 unter Verwendung eines Spektrophotometers.
- Montieren Flusszelle Setup, die zuvor beschrieben worden, 14 hat, vorzugsweise auf einer Mobilstation oder Wagen, die in das Mikroskop Raum zur Abbildung des Flusszelle ohne Demontage gebracht werden kann.
- Bereiten Sie sterile Wachstumsmedium in 2 l oder 5 l-Flaschen für jeden Durchflusszelle. Verwenden Minimalmedium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 und 0,1 mM CaCl 2) mit 0,04% Glucose (G / V) und 0,2% (G / V) Casaminosäuren) von P. ergänzt aeruginosa Flusszelle Biofilmen.
- Aliquot fluoreszierende Mikrosphären in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-down in sterilem H 2 O für 5 min in Zentrifuge bei 9,391.2 g. Überstand abnehmen und resuspendieren in 1 ml Wachstumsmedium zu Natriumazid (Desinfektionsmittel) vor der Zugabe zum Kulturmedium in 2 L oder 5 L-Medium Flaschen zu entfernen.
HINWEIS: Verschiedene Größen der Mikrokugeln in verschiedenen Konzentrationen und sollte entsprechend den Anweisungen verdünnt werden. Beispielsweise dispergieren 120 ul von 1,0 um Mikrokügelchen Durchmesser von 15 & mgr; l von 0,5 um Mikrokügelchen Durchmesser und 0,96 & mgr; l von 0,2 um Mikrokügelchen Durchmesser in 2 l Wachstumsmedium auf 2,18 × 10 6 ml -1 Mikrokügelchen für jede Partikelgröße zu ergeben. - Bringen Medium Flasche UpstRies Flusszelle und lassen Wachstumsmedium durch gesamte Setup. Gasaustritt stoppen und injizieren verdünnten Übernachtkulturen in Flusszelle Kammern. Dass Bakterien auf das Deckerde für 1 h vor dem kontinuierlichen Fluss von Wachstumsmedium bei einer Flussrate von etwa 5,5 x 10 -3 m sec -1 oder 8 min mit einer peristaltischen Pumpe zu befestigen.
HINWEIS: Biofilme werden gewöhnlich bei Raumtemperatur (25 ° C) für 3-7 Tage gezüchtet. - Alternativ zur statischen Kultur Setup, verdünnte Übernachtkulturen 100-fach in Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 10 ul der Übernachtkultur auf 1 ml Wachstumsmedium mit Partikeln. Erhöhung der Partikelkonzentration im Wachstumsmedium für die statische Anzucht von etwa 500-fache im Vergleich zu derjenigen für die Strömung von Biofilmen (zB waschen und resuspendieren, 600 & mgr; l von 1,0 um Kugeln mit einem Durchmesser von 10 ml Wachstumsmedium), wie Durchflußzelle Biofilme ständig nachgefüllt Partikel, aber statischen Kulturen sind es nicht.
- In 2001; l des verdünnten Übernachtkultur mit Partikeln in die Kammern 8 und Folien. Inkubieren bei 37 ° C unter statischen Bedingungen. Biofilme sind in der Regel für 1 Tag gewachsen. Ersetzen Sie verbrauchte Nährmedium täglich mit frischem Wachstumsmedium mit Partikeln, wenn Biofilm ist für mehr als 1 Tag gewachsen.
2. Mikroskopie
- An Tag 3 und 5, schalten Sie Flow aus der Schlauchpumpe und bringen Flusszelle Setup in die Mikroskopie Raum. Clamp Schlauch nahe dem Eingang und Ausgang der Durchflusszelle Kammern Drift (eine systematische Fehlerursache durch Veränderungen in der Umwelt) vom Fluss zu verhindern. Setzen Sie die Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch von einem aufrechten Mikroskop.
HINWEIS: Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop zur Abbildung von Mikrovertiefungen. - Verwenden Fluoreszenzmikroskopie mit 40x Öl-Objektiv, um Videos von Mikrosphärenbewegung im Biofilm an verschiedenen Standorten (Mikrokolonien und Flach undifferenzierten Schichten) eingebettet und in unterschiedlichen Tagen (Tag 3 und 5), um zu nehmenzeitliche und räumliche Untersuchungen. Nehmen Sie kürzere Videos mit höheren Bildrate, um Ereignisse in kurzen Zeitskalen auftreten untersuchen (zB 1,5 bis 3 min Video Framerate von 25-50 Frames pro Sekunde für schnelle Dynamik) und längere Videos mit niedriger Bildrate, um Ereignisse über längere Zeit zu untersuchen Waagen (zB 15-30 min Video Bildrate von 2,5 bis 5 Bilder / s für langsamere Dynamik).
HINWEIS: Ein Video enthält typischerweise 5-10 Partikel und ist in der Regel von 1,0 bis 2,5 GB in der Dateigröße. Größere Mikrokolonien können mehr Teilchen zu halten. Nehmen Sie 5-10 Videos für die einzelnen Kategorien (zB 5-10 Videos von verschiedenen Mikrokolonien und von verschiedenen Orten in flachen undifferenzierten Schichten). Der Biofilm hat eine heterogene Architektur, die von Mikrokolonien, Kanäle, Hohlräume und Flach undifferenzierten Schichten bestehen kann. - Speichern Sie Ihre Videos in geeigneten Format, das von Fiji / ImageJ gelesen werden können (zB CZI, tif).
- Überprüfen Sie Videos für Drift durch Scrollen durch fertige video und der Beobachtung, dass die Partikel nicht in derselben Richtung gleichzeitig zu bewegen. Drift kann durch z-Tischbewegung, Ströme in der Strömungszelle, Ungleichgewicht der Antischwingungstisch, Luftdruck- oder Temperaturänderungen hervorgerufen werden. Correct kleinere treiben mit Post-Processing-Techniken in der Regel mit Mikroskop-Software zur Verfügung gestellt. Entsorgen Sie alle Videos, bei Drift kann nicht korrigiert werden. Nehmen Sie die folgenden Parameter, die während der Particle Tracking-Analyse erforderlich sind: Auflösung (Pixel / um), Anzahl der Frames, Dauer.
- Entfernen Sie Durchflusszelle von Mikroskoptisch, und starten peristaltische Pumpe weiter Kultivieren des Biofilms.
3. Particle Tracking Analysis
- Erhalten Teilchenbahnen mit Hilfe des Plug-in-Trackmate in Open Source Software (ImageJ). Laden Fiji bei http://fiji.sc/Fiji. Öffnen Sie das Video mit Fidschi und unter dem Plugins-Menü Verfolgung und Trackmate.
- Prüfen oder Einstellungen anzupassen in thE-Fenster darauf hindeutet anfänglichen Kalibrierungseinstellungen, um die Videoparametern entsprechen, wie in Schritt 2.4 aufgezeichnet.
- Detect Partikel in Trackmate mit ImageJ.
- Wählen Sie 'Log-Detektor ", Eingangspartikeldurchmesser und Schwellenwert (zB 1000). Blättern Sie durch das Video, während Sie auf 'Vorschau', um zu überprüfen, dass die lila Kreise folgen Sie den Teilchen in der gesamten Video. Passen Sie die Werte Durchmesser und Schwellen wie nötig: Erhöhung des Schwellenwerts, wenn lila Kreise in den leeren Raum angezeigt. Reduzieren Sie den Schwellenwert, wenn nicht genug Partikel festgestellt werden. Klicken Sie auf Weiter, um den Nachweis führen Sie die Partikel.
- Klicken Sie auf Weiter, wenn mit der Option präsentiert, um hinzuzufügen oder Partikel in 'Initial Schwellen' erkannt zu entfernen, 'Wählen Sie eine Ansicht "und" Wählen Sie einen Filter "Fenster, um ohne Einstellung fortzusetzen, wenn anfängliche Partikeldetektion war zufriedenstellend.
- Wählen Sie "Einfache LAP-Tracker" in der optiauf Leiste 'Wählen Sie ein Tracker-Methode "Fenster als Partikel nur selten aus der Schwerpunkt in den Biofilm zu bewegen und sind leicht verfolgt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen oder niedrigen Verknüpfung und Lückenschließung max Abstandswerte, und klicken Sie auf Weiter.
- Überprüfen Sie, dass Partikelverfolgung ist durch Scrollen durch das Video zu sehen, dass Partikel folgen Sie den von Trackmate gezogen Tracks, und dass es keine unerwünschten oder fehlende Tracks zufriedenstellend. Überspringen Sie die verschiedenen Filterschritte. Zum letzten Fenster "Wählen Sie eine Aktion". Wählen Sie "Export Tracks auf XML-Datei" aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf "Ausführen". Wählen Sie einen Ordner, um die Titel zu speichern.
HINWEIS: Es gibt verschiedene Programme zur Verfügung, in der Öffentlichkeit für die Analyse der Partikelbahnen und die Verwendung von Mikrorheologie. msdanalyzer und TrackArt sind Beispiele für Partikel-Tracking-Analyse-Programme, die in der Matlab-Umgebung ausgeführt werden.
- Bereiten Matlab, um die Partikelbahnen in den XML-Dateien, indem Sie im Menü des importierenMatlab Datei> Pfad ... und fügen Sie die Skripts Ordner mit der Fidschi-Paket.
- Um die Partikelbahnen mit msdanalyzer analysieren, laden Sie den Link auf die ZIP-Datei oder tar.gz-Datei at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Entpacken Sie diemsdanalyzer Ordner 15 und legen Sie sie in einem Ordner, auf die Matlab Pfad gehört (zB C: Dokumente und Einstellungen <Benutzername> Eigene Dateien Matlab). Starten Sie Matlab und initiieren den Analysator durch Eingabe von:
ma = msdanalyzer (2, 'um', 's')
wo um und s sind die physikalischen Raum und Zeiteinheiten in dem Video.- Importieren Sie die Teilchenbahnen durch Eingabe von:
[Titel, md] = importTrackMateTracks ('filename.xml', 'clipZ'; "SCALET ')
ma = ma.addAll (Tracks);
wo 'clipZ' entfernt die z-Dimension für ein 2D-Video und 'SCALET'. - Zeichnen Sie die Trajektorien auf Graphen mit:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Berechnen Sie die MSE der Partikel mit:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Zeichnen Sie die Muskel- und Skeletterkrankungen jedes Teilchens:
Abbildung
ma.plotMSD - Kombinieren Teilchenbahnen von anderen Videos der gleichen categery (zB Partikel im Wildtyp-Mikrokolonien am Tag 3 embedded) durch Wiederholen 3.5.1.1 bis 3.5.1.4).
- Zeichnen Sie die Ensemblemittel oder die Mittel über alle Kurven:
ma.plotMeanMSD
Ändern Sie den y- und x-Achse von linear zu logarithmisch. Bei langen Verzögerungszeiten, die MSD-Kurven werden durch unzureichende Statistiken auf längeren Zeitskalen laut. Die MSD-Kurven können auch stark ansteigen aufgrund dynamischer Fehler. Diese Bereiche der Kurve kann mit dem Pinsel-Werkzeug entfernt werdenum das Ende der Kurve auswählen und Auswahl von 'Bürsten'> 'entfernen Unbrushed' im Menü Extras.
- Importieren Sie die Teilchenbahnen durch Eingabe von:
- Laden Sie Ezyfit bei http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ und fügen Ezyfit in einen Ordner mit dem Matlab Pfad gehören (zB C: Dokumente und Einstellungen <Benutzername> Eigene Dateien Matlab). Installieren Sie die Ezyfit Menü, indem Sie in MATLAB-Workspace efmenu installieren. Starten Sie MATLAB mit Ezyfit Menü in der Abbildung Fenster. Montieren Sie die MSD-Kurven mit dem Potenzgesetz, indem Sie in der Ezyfit Menü 'Show Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' waren n ist der geschätzte diffusive Exponenten α.
HINWEIS: msdanalyzer bedarf der Curve Fitting Toolbox in Matlab für die Montage der MSD-Kurven. Ezyfit ist eine Alternative und kostenlose Software, die Kurvenanpassung durchführen. - Klar aktuellen Partikelbahnen und Muskel- und Skeletterkrankungen, neue Partikel Muskel- und Skeletterkrankungen an anderen Standorten oder Zeit zu berechnen:
klar Nach der Berechnung der verschiedenen mittleren MSD Kurven von Partikeln im Medium (Kontrolle) und Mikrokolonien und undifferenzierte Bereichen verschiedener Stämme, kopieren und fügen Sie die Kurven in einem Diagramm zum Vergleich. Probensteifigkeit und Vernetzungs Anstieg mit niedrigeren MSD-Werte. Flache Kurven unteren α und Proben elastischer als steilere Kurven mit höheren α. - Wählen Sie die Kurve und gehen Sie auf "Extras", um auf die Daten Statistiken, wie der Median und Bereich zu suchen. Die MSD des Wulstes ist proportional der Kriechnachgiebigkeit J (t) des Materials, in welchem der Wulst nach der Beziehung eingebettet
wobei J = Kriechnachgiebigkeit, d = Teilchendurchmesser, k B = Boltzmann-Konstante, T = Temperatur und t = Zeit.
- Entpacken Sie diemsdanalyzer Ordner 15 und legen Sie sie in einem Ordner, auf die Matlab Pfad gehört (zB C: Dokumente und Einstellungen <Benutzername> Eigene Dateien Matlab). Starten Sie Matlab und initiieren den Analysator durch Eingabe von:
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Representative Results
Die lokalen viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms in verschiedenen Regionen des Biofilms, der die Hohlräume (mittel über dem Biofilm), Ebenen (undifferenzierte flachen Schicht von Zellen) und Mikrokolonien (siehe Etiketten in 2A) aufgenommen wurden untersucht. Die zeitlichen Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms während der Reifung von den Tagen 3 bis 5 wurden ebenfalls bestimmt. Der MSD der Partikel in den Hohlräumen wurde als Kontrolle und vergleichbar mit dem MSD von Partikeln in reinem Medium verwendet. Hingegen Teilchen in dem Biofilm eingeschlossen vibriert in festen Positionen und MSD-Werte von den typischen viskoelastischen Materialien stark elastische Gele (Figur 3) angeordnet.
Schleimige P. aeruginosa Wildtyp und seine Δ pel Mutantenstämme (2A und 2B) entwickelte Mikrokolonien auf einer dünnen Ebene, die von Tag 3 in ihrer Biofilmen verstreut. Die Ebene an Tag 3 war zu dünn für dieUntersuchung der rheologischen Eigenschaften. In beiden Biofilmen durch die schleimige P. gebildet aeruginosa Wildtyp- und Δ pel Stämme MSD von Partikeln in der Tag 3 Mikrokolonien war unabhängig von der Zeit für die Zeitverzögerungen von 0,1 sec bis 10 sec (α = 0), was anzeigt, daß die Mikrokolonien waren elastische (Abbildung 4, Tabelle 1) . Die mediane Zeitstand Verstöße aus den entsprechenden Partikel MSE berechnet wurden 4,3 x 10 -2 Pa -1 und 3,6 x 10 -2 Pa -1 auf. Nach Tag 5 der Kriechnachgiebigkeit der Mikrokolonien in schleimige P. aeruginosa Wildtypstamm erhöht bis 2,5 x 10 -1 Pa -1, was eine Verringerung der effektiven Vernetzung innerhalb der Matrix. Die Tag 5 Mikrokolonien waren noch elastisch mit α = 0 Δ pel nicht in der Rheologie in schleimige P. ändern sich von Tag 3 bis 5 den Ebenen aeruginosa Wildtyp und Δ pel Stämme waren similar in Elastizität (α = 0) und effektive Vernetzung zu Tag 3 Mikrokolonien, die reflektierende ihrer Laufzeit (undifferenzierter Struktur) sein könnte.
Biofilme von Δ psl Mutantenstamm (2C) ausgebildet waren weniger differenziert und in Entwicklung verzögert. Dies führte zu Biofilmen mit dicken Ebenen, die Mikrokolonien Tag 3. Die MSD-Werte entwickelt haben gezeigt, dass die Biofilme waren viel weniger wirksam vernetzt, als P. aeruginosa Wildtyp und Δ pel-Stämme (Abbildung 4, Tabelle 1). Die Ebenen waren viskoelastischen, mit α = 0,12 und 0,26 an den Tagen 3 und 5 auf. Die mediane Kriechnachgiebigkeit von Tag 3 und 5 Ebenen betrug 1,0 Pa -1. Wenn Mikrokolonien waren in 5 Tage entwickelt hatte die Kriechnachgiebigkeit von 2,8 x 10 -1 Pa -1 verringert, was darauf hinweist, dass ein Schwellenwert für die Vernetzung wird die Mikrokoloniedifferenzierung erforderlich. However war die Kriechnachgiebigkeit noch größer als der Kriechnachgiebigkeit jüngerer Tag 3 schleimige P. aeruginosa Wildtyp und Δpel Mikrokolonien. Die Tag 5 Mikrokolonien waren viskoelastischen mit α = 0,34. Somit ist die P. aeruginosa Biofilm ist elastisch und hochvernetzte in Abwesenheit von Pel. In Abwesenheit von Psl, wurde der Biofilm viskoelastischen und weniger vernetzt. In den reifen Biofilm-Strukturen wie der Mikrokolonien, Expression sowohl von Pel und Psl Exopolysaccharide führte zu deutlichen rheologische Unterschiede im Laufe der Zeit. Die Verringerung der Vernetzung kann durch die Reduktion von PSL Pel Exopolysaccharide in der Biofilmmatrix während der Reifung ist.
Abb. 1: Particle Tracking Mikrorheologie in einem Biofilm (A) graue Kreise zeigen Partikel MSD in einer viskosen Substanz, die linear mit der Zeit und wächstα = 1 schwarze Dreiecke zeigen Partikel MSD aus einer elastischen Substanz, die unabhängig von Zeit und a = 0 (B) Schematische Darstellung der Sonde Partikelvibrations in der EPS des Biofilms. Das Teilchen wird wie eine Bakterienzelle modelliert und ist ähnlich im Durchmesser. Die Matrixpolymere, die die Teilchen zu umhüllen sind viel kleiner als die Teilchen.
Abbildung 2: P erspecti v e und Schnitt vi e w d a y 5 Biofilmen (grün) b y con f ocal microsco p y nach Conti n üssig < strong> f eeding mit 1,0 μ m (lila), 0,5 μ m (rot) und 0,2 μ m (orange) pa r keln mit negativ geladenen carboxylierte Oberfläche. Biofilme aus (A) schleimige P. gebildet aeruginosa oder Mutanten (B) Δ pel und (C) Δ psl Stämme. Partikel werden in allen Bereichen des Biofilms eingebaut. Beispiele von Mikrokolonien, Ebenen und Hohlräume in (A) markiert. Geändert von Chew et al., MBIO 2014 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abb. 3: Vergleich der Partikelbahnen einer Spur eines Teilchen Ausführen Brownsche Bewegung in Wachstumsmedium (mehrfarbig), verglichen mit Spuren von Partikeln Vibrations in Biofilm-Mikrokolonien (dunkelblau). Die segmentierten Farben zeigen Brüche in Tracking durch Teilchen, das sich aus der Schwerpunkt in der z-Ebene.
Abb. 4: Muskel- und Skeletterkrankungen von 1,0 um Partikel in Biofilmen Mucoid P. aeruginosa ist elastisch und Mikrokolonien werden in wirksamen Vernetzung von den Tagen 3 bis 5 verringert wird; Δ pel elastisch ist und sich nicht in die Rheologie von den Tagen 3 bis 5 zu ändern; Δ PSL ist viskoelastischen und besteht hauptsächlich aus Ebenen, die nicht wesentlich in der Rheologie verändern von 3 bis 5 Tagen.
| Belastung | Tag | Region </ td> | Median Kriechnachgiebigkeit (Pa -1) |
| Wildtyp | 3 Tage | Mikrokolonie | 4,3 x 10 -2 |
| Wildtyp | 5 Tage | Mikrokolonie | 2,5 x 10 -1 |
| Wildtyp | 5 Tage | Ebene | 4,1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 Tage | Mikrokolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 Tage | Mikrokolonie | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 Tage | Ebene | 3,2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 Tage | Ebene | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 Tage | Ebene | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 Tage | Mikrokolonie | 2,8 x 10 -1 |
Tabelle 1: Median Kriechen Einhaltungen und voraus diffusive Exponenten der Wildtyp und mutierten Stämmen nach Biofilm Alter und Region.
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Discussion
Mikrorheologie ist ein nützliches Instrument für die lokale rheologischen Messungen in heterogenen Systemen, wie mikrobielle Biofilmen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik, so dass der Echtzeit-Überwachung der rheologischen Veränderungen innerhalb der gleichen biologischen Probe über mehrere Zeitpunkte. In diesem Protokoll wurde partikel Tracking Mikrorheologie um Pel und Psl Exopolysaccharid Mutanten in Reihenfolge angewendet, um zu untersuchen, wie sie die Elastizität und die effektive Vernetzung des Biofilmmatrix beeinflussen. Psl begünstigt die Entwicklung von elastischen Biofilmen mit hohen effektiven Vernetzung, während Pel begünstigt viskoelastischen und lockerer Biofilmen. Wenn beide Exopolysaccharide erzeugt werden, wird die Biofilm-Mikrokolonien weniger effektiv vernetzt als der Biofilm reift, was mit einer Abnahme Psl über Pel.
Biofilme durch verschiedene Bakterienarten gebildet haben unterschiedliche EPS Kompositionen. Die EPS der schleimigen P. in dieser Studie vor allem consi verwendet aeruginosa-Stämme M. von Exopolysaccharide 16. Andere Tierarten können große extrazelluläre Adhäsionsproteinen 17 und 18 DNA als ihre Hauptkomponenten der EPS zu verwenden. Der hier beschriebene Ansatz könnte verwendet werden, um die rheologischen Beitrag anderer EPS Komponenten und ihre Auswirkung auf das Wachstum zu bestimmen. Darüber hinaus können Biofilme in verschiedenen Setups gewachsen drastisch unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, die ihre Rheologie beeinflussen. B. mukoiden P. aeruginosa ergänzt mit Glucose bildet mehr Biofilm mit hoch differenzierten Strukturen unter Fluss im Vergleich zu statischen Bedingungen. Studien haben auch gezeigt, dass Biofilme ausgesetzt Scherbeanspruchung, wie Strömungs macht die Biofilme mehr Zusammenhalt und elastische 19,20. Wichtige Schritte und Faktoren, die für eine erfolgreiche Biofilm Partikel-Tracking Mikrorheologie Studie berücksichtigen sind wie folgt:
Die Systemmaße für Ermittlungen oder Skala von Interesse in Bezug auf Zeit und Raum
content "> Betrachtet Raumskalen, muß man die Grße der Strukturen, die zu den viskoelastischen Eigenschaften des Systems geben betrachten (in diesem Fall sind die Polymere der Biofilmmatrix) ist. Die Polymere die Sonde umgebenden Teilchen in wesentlich kleiner sein, Struktur als die Partikel und präsentieren einen isotropen Umgebung des Teilchens. Hochauflösende Bildgebung erforderlich ist, um kleine Partikelbewegung oder Vibrationen zu erfassen, aber die Menge an Fläche für gleichwertige Dateigröße abgebildet wird. Bei der Betrachtung zeitlichen Skalen, elastische Biofilmen, die langsam zeigen reduzieren Dynamik erfordern unter Videos über längere Zeitskalen (zB h) und mit niedrigen Frame-Raten (zB min). Kürzere Videos können für viskoelastische Biofilmen mit schnellen Dynamik (min) entnommen werden, erfordern aber höhere Bildraten (s oder Millisekunden). Mit geeigneten Auflösung, Bildrate, Video-Dauer für jedes Experiment wird Dateigrößen halten niedrig für tractable Analyse.Biofilm Viskoelastizität, erterogeneity und Abmessungen
Partikelbewegung kann nicht nachweisbar in sehr elastisch Biofilmen (MSD <10 -4) sein. In solchen Fällen sind aktive microrheological Techniken, die Kraft aufzubringen, um die Partikel verdrängen bevorzugt. Rheologischen Probenahme von verschiedenen Regionen des Biofilms werden sollten, um sicherzustellen, dass die mechanische Heterogenität des Biofilms wird erfasst. Heterogener Morphologie ist jedoch nicht unbedingt ein guter Indikator für die mechanische Benen wie trotz homogener Auftritte der Biofilm kann komplex in der Rheologie werden: Δpsl Biofilmen in der Morphologie homogener und in Differenzierungs verzögert, aber haben eine komplexe und heterogene rheologisches Profil. Im Gegensatz dazu weisen Δpel Biofilme ein heterogenes Aussehen mit gut differenzierten Mikrokolonien aber eine konstante Fließverhalten während des Biofilms. Für Biofilme mit großen Mikrokolonie Dimensionen (zB> 50 um im Durchmesser und Höhe), kann es sinn study die rheologischen Unterschieden je nach Höhe (Ober- und Unterseite der Mikrokolonien) oder Entfernung von Mikrokolonie Kante.
Auswahl der Sondenpartikel
Wie oben beschrieben, sollte die Größe der Teilchen, die größer als die Strukturen der Materialien, die zu ihrer viskoelastischen Eigenschaften zu geben. Darüber hinaus können Partikel mit unterschiedlicher Oberflächenchemie in der Bindung an unterschiedlichen Bereichen und EPS-Komponenten innerhalb des Biofilms führt. Somit werden die Wirkungen der Teilchen mit unterschiedlicher Oberflächenchemie sollte untersucht, so dass Biofilm Heterogenität Erwägung gezogen werden können. Alle Sonden Teilchen sollten eine hohe Zetapotential um die Agglomeration zu minimieren. Teilchen, die aneinander binden können nicht so genau Sonden verwendet werden und von der Analyse ausgeschlossen werden.
Minimierung des Drift-
Drift kann durch Temperatur- oder Luftdruckänderungen, Mikroskopobjekttischbewegung (normalerweise in der z-Richtung), anti-V verursacht werdenibration Tabelle Ungleichgewicht und innere Strömung innerhalb des Systems. Drifts in der Regel in Super-Diffusions des Teilchens und α führen> 1. Ein α> 1 bedeutet, dass andere als thermische Energie, sind aktive Prozesse beteiligt sich bewegenden Teilchen und passive Mikrorheologie werden nicht erhoben.
Proper Biofilm Kulturerhaltungs
Durchflusszellen müssen richtig zusammengesetzt, um Leckagen zu verhindern und Biofilmen müssen vor Verschmutzung freigehalten werden. Biofilme können auch in anderen Konfigurationen alternativ zu der Durchflusszelle gezüchtet werden, wie beispielsweise Folien und Vertiefungen zur statischen Kultivierungsbedingungen. Ein invertiertes Mikroskop sollte zur Abbildung von Mikrovertiefungen verwendet werden.
Zusammenfassend ist particle tracking Mikrorheologie eine nützliche Technik, die mit Mikroskopen Standard an ein biologisches Labor eingesetzt werden können. Darüber hinaus ist Programme bei der Berechnung und Analyse der Partikel Muskel- und Skeletterkrankungen involviert in der Öffentlichkeit zur Verfügung stehen.Zum Beispiel msdanalyzer und TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) sind Programme, die in der Matlab-Umgebung ausgeführt werden. Da jedoch die Technik beruht nur an Wärmeenergie auf die Teilchen zu bewegen, ist es nicht zwischen Proben höhere Elastizität zu lösen. Aktive Techniken wie magnetische tweezing, eine Kraft auf das Teilchen, auf zu handeln und bewegen sich innerhalb der Probe und wäre in der Lage, um die Viskoelastizität von hochelastischen Proben zu bestimmen.
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Acknowledgments
Diese Forschung wird von der National Research Foundation und Bildungsministerium Singapur unter seinem Forschungszentrum der Excellence-Programm unterstützt, das Start-up Grants (M4330002.C70) aus Nanyang Technological University und ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) vom Ministerium für Bildung, Singapur. Die Autoren danken Joey Yam Kuok Hoong für die Teilnahme an der Demonstration dieses Protokolls.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
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