Introduction
अधिकांश बैक्टीरियल कोशिकाओं दोनों planktonic (मुक्त रहने वाले) और विकास एक की सतह से जुड़ी (डंठल) मोड को रोजगार के लिए सक्षम हैं। विकास की सतह से जुड़ी मोड में, बैक्टीरियल कोशिकाओं छिपाना और बाह्य polymeric पदार्थ (ईपीएस) biofilms फार्म करने की बड़ी मात्रा में खुद को डिब्बे में बंद। ईपीएस मुख्य रूप से प्रोटीन, exopolysaccharide, बाह्य डीएनए के होते हैं और biofilm गठन 2 के लिए आवश्यक है। यह बैक्टीरिया स्थानिक अंतर करने के लिए उपयोग करते हैं और हानिकारक पर्यावरण की स्थिति और मेजबान प्रतिक्रियाओं से बैक्टीरिया की रक्षा कर सकते हैं जिसके द्वारा एक शारीरिक पाड़ के रूप में कार्य करता है। ईपीएस के विभिन्न घटकों के नाटकीय रूप से biofilm संरचनाओं 4 फिर से तैयार कर सकते हैं ईपीएस घटकों की अभिव्यक्ति में biofilm गठन 3 और परिवर्तन में विशिष्ट भूमिका है। ईपीएस घटक भी अणुओं 5 संकेत के रूप में कार्य कर सकते हैं, और हाल के अध्ययनों से उनके पलायन और biofilm रचनाकार मार्गदर्शन करने के लिए माइक्रोबियल कोशिकाओं के साथ बातचीत के कुछ ईपीएस घटकों को दिखाया गया हैerentiation 6-8।
ईपीएस पर रिसर्च बहुत ईपीएस 9,10 के एक विशेष घटक में दोषपूर्ण म्यूटेंट द्वारा उत्पादित biofilms के रूपात्मक विश्लेषण पर आधारित उन्नत है। इसके अलावा, ईपीएस आमतौर पर वृहद पैमाने पर (थोक लक्षण वर्णन) 11 पर विशेषता है। आकृति विज्ञान, औसत मान देता biofilm की विविधता के भीतर मौजूद है कि विस्तार खो देता है, जो मात्रात्मक विस्तार और थोक लक्षण कमी कर सकते हैं हालांकि विश्लेषण करती है। सूक्ष्म पैमाने पर ईपीएस के मैकेनिक संपत्तियों की वास्तविक समय लक्षण वर्णन करने के लिए प्रगति के लिए एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति अब नहीं है। इस प्रोटोकॉल कण-ट्रैकिंग microrheology Pseudomonas aeruginosa biofilms 4 की viscoelasticity और प्रभावी तिर्यक पर मैट्रिक्स घटकों पेल के spatiotemporal प्रभाव और पीएसएल exopolysaccharides निर्धारित करने में सक्षम है दर्शाता है कि कैसे।
निष्क्रिय microrheology एक सरल और सस्ती आरएच हैतारीख 12,13 करने के लिए एक सामग्री के स्थानिक microrheological नमूने के उच्चतम throughput प्रदान करता है कि eology विधि। निष्क्रिय microrheology में, जांच क्षेत्रों नमूने में रखा जाता है और थर्मल ऊर्जा (कश्मीर बी टी) द्वारा संचालित उनकी ब्राउनियन गति, वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया जाता है। कई कणों को एक साथ लगाया जा सकता है, और कणों के समय पर निर्भर निर्देशांक एक पारंपरिक यादृच्छिक चल पालन करें। इसलिए, औसत पर, कण एक ही स्थान पर बने हुए हैं। हालांकि, विस्थापन का मानक विचलन या मतलब कणों का विस्थापन (एमएसडी) चुकता, शून्य नहीं है। चिपचिपा द्रव प्रवाह के बाद से समय की प्रगति के रूप में, एक चिपचिपा द्रव में कण एमएसडी रैखिक बढ़ता है। इसके विपरीत, बहुलक तिर्यक viscoelastic में पाया या लोचदार पदार्थों उन्हें प्रवाह का विरोध करने में मदद करेगा और कणों एमएसडी वक्र (चित्रा 1 ए) में पठारों के लिए अग्रणी, उनके विस्थापन में सीमित हो जाते हैं। इस अवलोकन संबंध इस प्रकार है MSDαt
कण के आकार, घनत्व और सतह के रसायन शास्त्र microrheological प्रयोग का सही आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हैं और (इस मामले में biofilm मैट्रिक्स के पॉलिमर, चित्रा 1 बी देखें) का अध्ययन प्रणाली के संबंध में चुना जाता है। सबसे पहले, कण कण में ही तुलना में बहुत छोटे हैं कि संरचनाओं के साथ पदार्थ के rheology के उपाय। पदार्थ की संरचना कण, बराबर की गति के समान पैमाने के हैंticle व्यक्ति संरचनाओं का आकार और अभिविन्यास द्वारा परेशान किया जाता है। हालांकि कण आसपास के ढांचे में बहुत छोटे होते हैं, तो इस आशय छोटा है और कण (चित्रा 1 बी) के लिए एक सजातीय पर्यावरण पेश, बाहर औसत। दूसरे, कण के घनत्व अवसादन से परहेज है और जड़त्वीय बलों नगण्य हैं है कि इस तरह (पानी आधारित माध्यमों के लिए 1.05 ग्राम मिलीलीटर -1) माध्यम के समान होना चाहिए। पॉलीस्टीरिन lattices के साथ अधिकांश कणों उपरोक्त मानदंडों को पूरा। प्रस्ताव पदार्थ संरचनाओं के साथ थर्मल ऊर्जा और टकराव से प्रेरित, अनियमित है, तो कण एमएसडी के rheological व्याख्या ही मान्य है के रूप में आदर्श रूप में, कण biofilm मैट्रिक्स की पॉलिमर के साथ बातचीत नहीं करता है। यह जांच कण बाँध या एक पूर्व विकसित biofilm की सतह से दूर उछाल करने के लिए जाता है कि क्या जाँच करके देखा जा सकता है। हालांकि, biofilm के लिए आकर्षण की कमी के बावजूद, कण मैट्रिक्स में शामिल होने के लिए सक्षम होना चाहिए।इसके अलावा, biofilm की physiochemical विविधता अलग कणों biofilm के अलग-अलग क्षेत्रों में जांच के रूप में अधिक उपयुक्त होने में परिणाम हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न आकार और सतह के रसायन शास्त्र के कणों biofilm करने के लिए लागू किया जाना चाहिए।
जैसे, कण एमएसडी घटकों rheology के लिए योगदान और biofilm के प्रसार कैसे अलग पर उपयोगी जानकारी प्रदान करने में सक्षम है। इसके अलावा, अलग अलग जांच के उपयोग के एक biofilm के स्थानिक physiochemical विविधता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। इस विधि biofilm के यांत्रिक गुणों अन्य प्रजातियों की शुरूआत से बदल रहे हैं कि कैसे जांच करने के लिए मिश्रित प्रजाति biofilms को biofilm के यांत्रिक गुणों पर प्रभाव रोगाणुरोधी उपचार परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, या लागू किया जा सकता है। कण MSDs भी biofilm प्रसार निस्र्पक के लिए उपयोगी हो सकता है। इस तरह के अध्ययन के लिए एक संभावित biofilm उपचार में सुधार, biofilms के बारे में हमारी समझ में मददगार होगाउपयोगी गतिविधियों के लिए biofilms के एन डी इंजीनियरिंग।
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Protocol
1. Biofilm खेती
- जीवाणु उपभेदों की तैयारी
- 1 दिन पहले biofilm खेती करने के लिए, जमे हुए जीवाणु संस्कृति से उचित मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर inoculating द्वारा planktonic बैक्टीरियल संस्कृतियों तैयार करते हैं। Mucoid पी के लिए Luria-रसा मध्यम (10 जी एल -1 सोडियम क्लोराइड, 10 ग्राम एल -1 खमीर निकालने, और 10 ग्राम एल -1 tryptone) का प्रयोग करें aeruginosa और इसकी Δ PEL और Δ पीएसएल दोषपूर्ण म्यूटेंट। 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम झटकों की स्थिति में रात भर सेते हैं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एक आयुध डिपो 0.40 के 600 करने के लिए रात भर संस्कृतियों पतला।
- अधिमानतः disassembly बिना प्रवाह सेल इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप कमरे में लाया जा सकता है कि एक मोबाइल स्टेशन या ट्राली पर, पहले 14 में वर्णित किया गया है, जो प्रवाह सेल की स्थापना, इकट्ठे।
- 2 एल या प्रत्येक प्रवाह सेल के लिए 5 एल बोतलों में बाँझ विकास के माध्यम से तैयार। कम से कम मध्यम M9 (48 मिमी ना 2 4 HPO, 22 मिमी उपयोग2 के.एच. पीओ 4, 19 मिमी एनएच 4 सीएल, 9 मिमी NaCl, 2 मिमी MgSO 4, और पी के लिए 0.04% ग्लूकोज (wt / खंड) और 0.2% (wt / खंड) casamino एसिड) के साथ पूरक 0.1 मिमी CaCl 2) aeruginosa सेल biofilms प्रवाह।
- Microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य फ्लोरोसेंट microspheres और 9,391.2 ग्राम पर अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 2 हे बाँझ एच में नीचे स्पिन। पहले 2 एल या 5 एल मध्यम बोतलों में मध्यम विकास को जोड़ने के लिए सोडियम azide (कीटाणुनाशक) को हटाने के लिए 1 मिलीलीटर मध्यम विकास में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें।
नोट: microspheres की विभिन्न आकारों विभिन्न सांद्रता में आते हैं और निर्देशों के हिसाब से पतला होना चाहिए। उदाहरण के लिए, 2.18 × 10 6 microspheres मिलीलीटर -1 प्रत्येक कण आकार के लिए देने के लिए 1.0 मीटर व्यास microspheres की 120 μl, 0.5 मीटर व्यास microspheres की 15 μl और मध्यम विकास के 2 एल में 0.2 मीटर व्यास microspheres की 0.96 μl फैलाने। - Upst करने के लिए माध्यम बोतल संलग्नप्रवाह सेल के रीम और मध्यम विकास पूरे सेटअप के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं। प्रवाह बंद करो और प्रवाह सेल कक्षों में पतला रात भर संस्कृतियों इंजेक्षन। बैक्टीरिया लगभग 5.5 x 10 -3 मीटर सेकंड -1, या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ 8 आरपीएम की एक प्रवाह दर पर मध्यम विकास के प्रवाह को जारी रखने से पहले 1 घंटे के लिए coverslip बुनियाद को संलग्न करने की अनुमति दें।
नोट: Biofilms आम तौर पर 3-7 दिनों के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर बड़े हो रहे हैं। - वैकल्पिक रूप से, स्थिर संस्कृति की स्थापना के लिए, कणों के साथ 1 मिलीलीटर मध्यम विकास के लिए रातोंरात संस्कृति के 10 μl जोड़कर रात भर संस्कृतियों microcentrifuge ट्यूबों में 100 गुना पतला। प्रवाह biofilms के लिए इस्तेमाल किया है कि की तुलना में लगभग 500 गुना से स्थिर संस्कृति के लिए मध्यम विकास में कण एकाग्रता में वृद्धि (जैसे धोने और विकास के माध्यम के 10 मिलीलीटर में 1.0 मीटर व्यास क्षेत्रों के 600 μl resuspend) लगातार साथ मंगाया जाता प्रवाह सेल biofilms के रूप में कणों लेकिन स्थिर संस्कृतियों नहीं हैं।
- 200 जोड़े1, 8 अच्छी तरह से स्लाइड के कक्षों के कणों के साथ पतला रात संस्कृति के एल। स्थिर शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। Biofilms आमतौर पर एक दिन के लिए बड़े हो रहे हैं। Biofilm अधिक से अधिक 1 दिन के लिए उगाया जाता है, तो कणों के साथ ताजा मध्यम विकास के साथ दैनिक खर्च विकास के माध्यम से बदलें।
2. माइक्रोस्कोपी
- दिन 3 और 5 पर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से प्रवाह बंद कर और माइक्रोस्कोपी के कमरे में प्रवाह सेल सेटअप लाने के लिए। प्रवाह सेल कक्षों के प्रवेश और निकास के पास दबाना ट्यूबिंग बहाव प्रवाह से (पर्यावरण में परिवर्तन से एक व्यवस्थित त्रुटि कारण) को रोकने के लिए। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की खुर्दबीन मंच पर प्रवाह सेल रखें।
नोट: microwells की इमेजिंग के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें। - विभिन्न स्थानों (microcolonies और फ्लैट अविभाजित परतों) में biofilm में एम्बेडेड microsphere गति के वीडियो और अलग अलग दिनों में (3 दिन और 5) के लिए लेने के लिए 40X तेल उद्देश्य के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करेंअस्थायी और स्थानिक जांच। थोड़े समय के तराजू के भीतर होने वाली घटनाओं की जांच के लिए उच्च फ्रेम दर के साथ छोटे वीडियो लें (जैसे 25-50 तेजी से गतिशीलता के लिए फ्रेम प्रति सेकंड की फ्रेम दर पर 1.5-3 मिनट वीडियो), और कम फ्रेम दर के साथ लंबे समय तक वीडियो लंबे समय से अधिक घटनाओं की जांच के लिए तराजू (2.5-5 फ्रेम / धीमी गतिशीलता के लिए सेकंड के फ्रेम दर पर जैसे 15-30 मिनट के वीडियो)।
नोट: एक वीडियो आमतौर पर 5-10 कणों होता है, और फ़ाइल आकार में आम तौर पर 1.0-2.5 जीबी की है। बड़ी microcolonies अधिक कणों पकड़ सकता है। प्रत्येक श्रेणी के लिए 5-10 वीडियो (अलग microcolonies के और फ्लैट अविभाजित परतों में अलग-अलग स्थानों से जैसे 5-10 वीडियो) ले लो। biofilm microcolonies, चैनलों, voids और फ्लैट अविभाजित परतों से मिलकर कर सकते हैं कि एक विषम वास्तुकला है। - फिजी / ImageJ द्वारा पढ़ा जा सकता है कि उचित प्रारूप में वीडियो (जैसे CZI, TIF) को बचाओ।
- समाप्त vid के माध्यम से स्क्रॉल करके बहाव के लिए वीडियो की जाँच करेंईओ और कणों को एक साथ एक ही दिशा में कदम नहीं है कि देख। बहाव Z चरण गति, प्रवाह सेल में धाराओं, विरोधी कंपन मेज, हवा के दबाव या तापमान परिवर्तन के असंतुलन की वजह से हो सकता है। सही नाबालिग आमतौर पर माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ प्रदान की पोस्ट प्रसंस्करण तकनीक का उपयोग कर बहती। बहाव सही नहीं किया जा सकता है, जिसमें किसी भी वीडियो को त्यागें। कण ट्रैकिंग विश्लेषण के दौरान आवश्यक हैं जो निम्नलिखित मानकों, रिकॉर्ड: संकल्प (पिक्सल / उम), फ्रेम की संख्या, अवधि।
- खुर्दबीन मंच से प्रवाह सेल निकालें और biofilm खेती जारी रखने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को पुनः आरंभ।
3. कण ट्रैकिंग विश्लेषण
- खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (ImageJ) में प्लग में TrackMate का उपयोग करके कण trajectories प्राप्त करते हैं। फिजी डाउनलोड http://fiji.sc/Fiji । फिजी के साथ और प्लगइन्स मेनू के तहत वीडियो खोलें, ट्रैकिंग और TrackMate का चयन करें।
- चेक या वीं में सेटिंग्स समायोजित2.4 चरण में दर्ज की गई है के रूप में वीडियो मानकों से मेल करने के लिए प्रारंभिक अंशांकन सेटिंग्स सुझाव ई खिड़की।
- ImageJ का उपयोग TrackMate में कणों का पता लगाने।
- (जैसे 1000) 'लॉग डिटेक्टर', इनपुट कण व्यास और सीमा मूल्य का चयन करें। बैंगनी हलकों वीडियो भर में कणों का पालन करें कि जांच करने के लिए 'पूर्वावलोकन' बटन पर क्लिक whilst के वीडियो के माध्यम से स्क्रॉल करें। आवश्यक के रूप में व्यास और दहलीज मूल्यों समायोजित करें: बैंगनी हलकों खाली जगह में दिखाई देते हैं, तो सीमा मूल्य वृद्धि हुई है। पर्याप्त नहीं कणों का पता चला रहे हैं, तो सीमा मूल्य कम करें। पता लगाने के कणों को पूरा करने के लिए अगले बटन पर क्लिक करें।
- जोड़ सकते हैं या 'प्रारंभिक thresholding' में पाया कणों को हटा दें, 'एक दृश्य का चयन करें' और प्रारंभिक कण का पता लगाने संतोषजनक था, तो Windows समायोजन के बिना जारी रखने के लिए 'एक फिल्टर का चयन करें' करने के लिए विकल्प के साथ प्रस्तुत जब अगले बटन पर क्लिक करें।
- OPTI में 'सरल एलएपी पर नजर रखने वाली' का चयनकणों शायद ही कभी biofilm में ध्यान से बाहर ले जाने के लिए और आसानी से पता लगाया जाता है के रूप में की पट्टी पर खिड़की 'एक ट्रैकर विधि का चयन करें'। सुझाव या कम से जोड़ने और अंतर-समापन अधिकतम दूरी मूल्यों का प्रयोग करें, और अगले क्लिक करें।
- कि कण ट्रैकिंग कणों TrackMate द्वारा तैयार की पटरियों का पालन करें, और यह कि कोई अवांछित या लापता पटरियों देखते हैं कि देखने के लिए वीडियो के माध्यम से स्क्रॉल करके संतोषजनक है की जाँच करें। विभिन्न छानने के कदम को छोड़। 'एक एक्शन का चयन' अंतिम खिड़की के पास जाओ। ड्रॉप डाउन मेनू से 'एक्सएमएल फ़ाइल में निर्यात पटरियों' का चयन करें और 'निष्पादित' पर क्लिक करें। पटरियों को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर चुनें।
नोट: कण trajectories और microrheology के उपयोग के विश्लेषण के लिए सार्वजनिक क्षेत्र में उपलब्ध विभिन्न कार्यक्रम कर रहे हैं। msdanalyzer और TrackArt मैटलैब वातावरण में चलने वाले कण ट्रैकिंग विश्लेषण कार्यक्रमों के उदाहरण हैं।
- के मेनू में चयन करके एक्सएमएल फाइल में कण trajectories आयात करने के लिए मैटलैब तैयारमैटलैब फ़ाइल> निर्धारित मार्ग ... और लिपियों फिजी पैकेज के साथ उपलब्ध फ़ोल्डर जोड़ें।
- Msdanalyzer साथ कण प्रक्षेप पथ का विश्लेषण करने के लिए, जिप फाइल या tar.gz फ़ाइल के लिए लिंक डाउनलोड at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- msdanalyzer फ़ोल्डर 15 निकालें और मैटलैब पथ के अंतर्गत आता है कि एक फ़ोल्डर में ड्रॉप (जैसे C: दस्तावेज़ और सेटिंग्स <username> मेरे दस्तावेज़ मैटलैब )। मैटलैब शुरू और टाइपिंग द्वारा विश्लेषक आरंभ:
मा = msdanalyzer (2, 'उम', 'सेकंड')
उम और सेकंड के वीडियो में शारीरिक अंतरिक्ष और समय इकाइयां हैं जहां।- टाइपिंग द्वारा कण trajectories आयात करें:
[पटरियों, एमडी] = importTrackMateTracks ('FileName.xml', 'Clipz';, 'ScaleT')
मा = ma.addAll (पटरियों);
जहां 'Clipz' जेड एक 2 डी वीडियो के लिए आयाम, और 'scaleT' को हटा। - ग्राफ का उपयोग पर प्रक्षेप पथ की साजिश:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - का उपयोग कर कणों की MSDs कंप्यूट:
मा = ma.computeMSD;
ma.msd - प्रत्येक कण की MSDs की साजिश:
आकृति
ma.plotMSD - ) 3.5.1.4 करने के लिए 3.5.1.1 दोहरा द्वारा (3 दिन में जंगली प्रकार microcolonies में एम्बेडेड जैसे कण) दूसरे ही categery के वीडियो से कण प्रक्षेप पथ का मिश्रण।
- पहनावा मतलब है या सभी घटता अधिक औसत की साजिश:
ma.plotMeanMSD
लघुगणक पैमाने पर करने के लिए रेखीय से y- और एक्स अक्ष बदलें। लंबे अंतराल के समय में, एमएसडी घटता के कारण लंबे समय तक timescales पर अपर्याप्त आंकड़ों के शोर हो जाते हैं। एमएसडी घटता कारण भी गतिशील त्रुटि के लिए तेजी से वृद्धि हो सकती है। वक्र के इन क्षेत्रों ब्रश उपकरण का उपयोग करके हटाया जा सकता है> वक्र के अंत का चयन और चयन 'Brushing' के लिए उपकरण मेनू में 'Unbrushed निकालें'।
- टाइपिंग द्वारा कण trajectories आयात करें:
- पर Ezyfit डाउनलोड http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ और मैटलैब पथ से संबंधित एक फ़ोल्डर में Ezyfit जोड़ने (जैसे C: दस्तावेज़ और सेटिंग्स <username> मेरे दस्तावेज़ मैटलैब )। Efmenu स्थापित मैटलैब कार्यक्षेत्र में टाइप करके Ezyfit मेनू स्थापित करें। आंकड़ा विंडो में Ezyfit मेनू साथ matlab पुनरारंभ करें। Ezyfit मेनू 'शो फ़िट'> 'पावर'> 'एक * एक्स ^ एन' में चयन करके बिजली कानून के एमएसडी curves फिट एन अनुमान के अनुसार वाचाल प्रतिपादक α है थे।
नोट: msdanalyzer एमएसडी घटता की फिटिंग के लिए Matlab में टूलबॉक्स वक्र ढाले की आवश्यकता है। Ezyfit वक्र ढाले प्रदर्शन कर सकते हैं कि एक विकल्प और मुफ्त सॉफ्टवेयर है। - साफ वर्तमान कण trajectories और MSDS अन्य स्थानों या समय में नए कण MSDs गणना करने के लिए:
स्पष्ट विभिन्न मतलब एमएसडी मध्यम (नियंत्रण) में कणों का घटता है, और microcolonies और विभिन्न प्रकारों के अविभाजित क्षेत्रों, कॉपी और तुलना के लिए एक ग्राफ में घटता पेस्ट की गणना के बाद। नमूना कठोरता और कम एमएसडी मूल्यों के साथ तिर्यक वृद्धि हुई है। फ्लैट घटता कम α है और नमूना उच्च α साथ steeper घटता की तुलना में अधिक लचीला है। - वक्र का चयन करें और इस तरह के मंझला और सीमा के रूप में डेटा के आँकड़ों को देखने के लिए "उपकरण" के लिए जाना। मनका के एमएसडी रेंगना अनुपालन के लिए आनुपातिक है, जम्मू मनका संबंध के अनुसार एम्बेडेड है जिसमें सामग्री की (टी),
जहां जम्मू = रेंगना अनुपालन, डी = कण व्यास, कश्मीर बी = Boltzman निरंतर, टी = तापमान और टी = समय।
- msdanalyzer फ़ोल्डर 15 निकालें और मैटलैब पथ के अंतर्गत आता है कि एक फ़ोल्डर में ड्रॉप (जैसे C: दस्तावेज़ और सेटिंग्स <username> मेरे दस्तावेज़ मैटलैब )। मैटलैब शुरू और टाइपिंग द्वारा विश्लेषक आरंभ:
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Representative Results
voids (biofilm ऊपर मध्यम), मैदानों (कोशिकाओं के अविभाजित फ्लैट परत) और microcolonies (2A चित्रा में लेबल देखें) शामिल है जो biofilm, के विभिन्न क्षेत्रों में biofilm के स्थानीय viscoelastic गुण जांच की गई। दिनों से परिपक्वता के दौरान biofilm के viscoelastic गुण में अस्थायी परिवर्तन 3 से 5 भी निर्धारित किया गया है। रिक्तियों में कणों की एमएसडी शुद्ध मध्यम में कणों की एमएसडी के लिए एक नियंत्रण और तुलनीय के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इसके विपरीत, biofilm में फंसे कणों निर्धारित स्थान पर स्फूर्त और एमएसडी मूल्यों viscoelastic सामग्री के विशिष्ट उन जोरदार लोचदार जैल (चित्रा 3) से बताया गया।
Mucoid पी aeruginosa प्रकार के जंगली और उसके Δ PEL उत्परिवर्ती उपभेदों (2A चित्रा और 2 बी) उनकी biofilms में 3 दिन से एक पतली मैदान पर बिखरे हुए microcolonies विकसित की है। 3 दिन सादा के लिए भी पतली थीrheological संपत्तियों की जांच। Mucoid पी द्वारा गठित दोनों biofilms में समय microcolonies लोचदार थे यह दर्शाता है कि 10 सेकंड (α = 0), 0.1 सेकंड का lags के लिए aeruginosa जंगली प्रकार और Δ PEL में तनाव, दिन 3 microcolonies में कणों की एमएसडी (चित्रा 4, 1 टेबल) समय के स्वतंत्र था । इसी कण MSDs से गणना मंझला रेंगना अनुपालन -2 4.3 एक्स 10 थे देहात -1 और 3.6 एक्स 10 -2 पा क्रमश: -1। 5 दिन mucoid पी में microcolonies के रेंगना अनुपालन द्वारा aeruginosa जंगली प्रकार के तनाव मैट्रिक्स के भीतर प्रभावी तिर्यक में कमी का संकेत है, पा -1 2.5 x 10 -1 की वृद्धि हुई। 5 दिन microcolonies अभी भी mucoid पी में दिनों से rheology में 3 से 5 के मैदानों में परिवर्तन नहीं किया α = 0 Δ PEL साथ लोचदार थे aeruginosa जंगली प्रकार और Δ PEL उपभेदों सिमी थेलोच में LAR (α = 0) और उनकी परिपक्वता (अविभाजित संरचना) को प्रतिबिंबित करता हो सकता है, जो दिन में 3 microcolonies, करने के लिए प्रभावी तिर्यक।
Δ पीएसएल उत्परिवर्ती तनाव (चित्रा -2) द्वारा गठित biofilms कम विभेदित और विकास में देरी हुई। इस दिन 3. एमएसडी मूल्यों के बाद microcolonies विकसित की है कि मोटी मैदानों के साथ biofilms में हुई biofilms पी की तुलना में काफी कम प्रभावी ढंग से Crosslinked थे कि पता चला aeruginosa जंगली प्रकार और Δ PEL उपभेदों (चित्रा 4, 1 टेबल)। मैदानों α साथ viscoelastic थे = 0.12 और 0.26 दिनों 3 पर और 5 क्रमशः। दिन 3 और 5 के मैदानों के बीच का रेंगना अनुपालन 1.0 पा रहा था -1। Microcolonies दिन 5 में विकसित किया था, रेंगना अनुपालन एक सीमा तिर्यक microcolony भेदभाव के लिए आवश्यक है कि यह दर्शाता है, 2.8 एक्स 10 -1 पा -1 की कमी हुई थी। Howeveआर, रेंगना अनुपालन युवा दिन 3 mucoid पी का रेंगना अनुपालन की तुलना में अब भी अधिक था aeruginosa प्रकार के जंगली और Δpel microcolonies। 5 दिन microcolonies α = 0.34 के साथ viscoelastic थे। इस प्रकार, पी aeruginosa biofilm लोचदार और पेल के अभाव में अत्यधिक Crosslinked है। पीएसएल के अभाव में, biofilm viscoelastic और कम Crosslinked बन गया। ऐसे microcolonies के रूप में परिपक्व biofilm संरचनाओं में पेल और पीएसएल exopolysaccharides दोनों की अभिव्यक्ति समय के साथ अलग रियोलॉजिकल मतभेद में हुई। तिर्यक में कमी परिपक्वता के दौरान biofilm मैट्रिक्स में पेल exopolysaccharides को पीएसएल की कमी की वजह से हो सकता है।
चित्रा 1:। एक biofilm में कण ट्रैकिंग microrheology (ए) ग्रे हलकों कण एमएसडी समय और साथ रैखिक बढ़ता है, जो एक चिपचिपा पदार्थ में दर्शातीα = 1 काले त्रिकोण biofilm के ईपीएस में हिल जांच कण का समय और एक = 0 (बी) के स्वतंत्र है, जो एक लोचदार पदार्थ के कण एमएसडी आरेख को दर्शाती है। कण एक बैक्टीरिया कोशिका की तरह मॉडलिंग की है और व्यास में समान है। कण आवृत कि मैट्रिक्स पॉलिमर कण की तुलना में बहुत छोटे होते हैं।
चित्रा 2: पी erspecti वी ई और डी के डब्ल्यू ई छठी अनुभागीय एक वाई 5 biofilms (हरा) बी y चोर च Ocal microsco पी वाई कोंटी एन uous के बाद < strong> (बैंगनी) 1.0 μ मीटर, 0.5 μ मीटर (लाल) और 0.2 μ मीटर के साथ eeding एफ (नारंगी) देहात आर नकारात्मक आरोप लगाया Carboxylated सतह के साथ ticles। Biofilms (ए) mucoid पी से गठित aeruginosa, और म्यूटेंट (बी) Δ PEL और (सी) Δ पीएसएल उपभेदों। कण biofilm के सभी क्षेत्रों में शामिल कर रहे हैं। Microcolonies, मैदानों और रिक्तियों के उदाहरण (ए) में चिह्नित कर रहे हैं। चबाना एट अल।, MBio, 2014 से संशोधित 4। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
fig3.jpg "/>
चित्रा 3:। मध्यम विकास में ब्राउनियन गति को क्रियान्वित करने के लिए एक कण का एक ट्रैक के कण trajectories तुलना (बहुरंगी) biofilm microcolonies (गहरे नीले रंग) में हिल कणों की पटरियों की तुलना में। खंडों रंग Z विमान में ध्यान से बाहर जाने की वजह से कण के लिए ट्रैकिंग में टूट जाता है का संकेत मिलता है।
चित्रा 4:। Biofilms में 1.0 माइक्रोन कणों की MSDs mucoid पी aeruginosa लोचदार है और microcolonies से 5 दिन 3 से प्रभावी तिर्यक में कम कर रहे हैं; Δ PEL लोचदार है और 3 से 5 दिनों से rheology में परिवर्तन नहीं होता है; Δ पीएसएल viscoelastic है और मुख्य रूप से 3 से 5 दिनों से rheology में काफी बदल नहीं है कि मैदानी इलाकों के होते हैं।
| तनाव | दिन | क्षेत्र </ टीडी> | माध्य कमीना अनुपालन (पा -1) |
| जंगली प्रकार | 3 दिन | Microcolony | 4.3 एक्स 10 -2 |
| जंगली प्रकार | 5 दिन | Microcolony | 2.5 x 10 -1 |
| जंगली प्रकार | 5 दिन | मैदान | 4.1 एक्स 10 -2 |
| Δpel | 3 दिन | Microcolony | 3.6 एक्स 10 -2 |
| Δpel | 5 दिन | Microcolony | 3.6 एक्स 10 -2 |
| Δpel | 5 दिन | मैदान | 3.2 एक्स 10 -2 |
| Δpsl | 3 दिन | मैदान | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 दिन | मैदान | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 दिन | Microcolony | 2.8 एक्स 10 -1 |
तालिका 1: माध्य रेंगना अनुपालन और जंगली प्रकार की अनुमानित वाचाल कलाकारों और biofilm उम्र और क्षेत्र के हिसाब से उत्परिवर्ती उपभेदों।
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Discussion
Microrheology ऐसे माइक्रोबियल biofilms के रूप में विषम प्रणालियों में स्थानीय रियोलॉजिकल मापन के लिए एक उपयोगी उपकरण है। यह कई बार के अंक से अधिक एक ही जैविक नमूने के भीतर रियोलॉजिकल परिवर्तन की वास्तविक समय की निगरानी सक्षम करने, एक गैर विनाशकारी तकनीक है। इस प्रोटोकॉल में, कण-ट्रैकिंग microrheology वे लोच और biofilm मैट्रिक्स के प्रभावी तिर्यक प्रभावित कैसे जांच के क्रम में पेल और पीएसएल exopolysaccharide म्यूटेंट करने के लिए लागू किया गया था। पेल viscoelastic और पराजित biofilms के पक्ष में है, जबकि पीएसएल, उच्च प्रभावी तिर्यक साथ लोचदार biofilms के विकास के पक्ष में है। दोनों exopolysaccharides का उत्पादन कर रहे हैं, biofilm microcolonies कम प्रभावी ढंग से पेल से अधिक पीएसएल में कमी के साथ संगत, biofilm के रूप में परिपक्व crosslinked हो जाता है।
विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु द्वारा गठित biofilms अलग ईपीएस रचनाओं की है। Mucoid पी की ईपीएस मुख्य रूप से consi इस अध्ययन में इस्तेमाल aeruginosa उपभेदों exopolysaccharides 16 के अनुसूचित जनजातियों। अन्य प्रजातियों के बड़े बाह्य आसंजन प्रोटीन ईपीएस के अपने प्रमुख घटक के रूप में 17 और डीएनए 18 उपयोग कर सकते हैं। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण रियोलॉजिकल अन्य ईपीएस घटकों के योगदान और विकास पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग setups में उगाया biofilms उनकी rheology को प्रभावित करने वाले काफी अलग भौतिक गुण हो सकता है। उदाहरण के लिए, पी mucoid aeruginosa ग्लूकोज स्थिर स्थिति की तुलना में प्रवाह के तहत अत्यधिक विभेदित संरचनाओं के साथ अधिक biofilm रूपों के साथ पूरक। अध्ययनों से यह भी प्रवाह biofilms अधिक एकजुट और 19,20 लोचदार बनाता है जैसे biofilms कतरनी तनाव के संपर्क में दिखाया है। इस प्रकार के रूप में महत्वपूर्ण कदम है और कारक हैं सफल biofilm कण-ट्रैकिंग microrheology अध्ययन के लिए विचार करने के लिए:
समय और स्थान के संबंध में जांच या ब्याज के पैमाने के लिए सिस्टम आयाम
सामग्री "स्थानिक तराजू पर विचार जब>, एक प्रणाली के viscoelastic गुण को जन्म दे कि संरचनाओं के आकार पर विचार करना चाहिए (हमारे मामले में, biofilm मैट्रिक्स के पॉलिमर)। जांच के कण आसपास के पॉलिमर में बहुत छोटा होना चाहिए कण से संरचना और उच्च संकल्प इमेजिंग छोटे कण गति या कंपन पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है। कण करने के लिए एक isotropic वातावरण मौजूद है, लेकिन धीमी है कि प्रदर्शन। लौकिक तराजू पर विचार कर, लोचदार biofilms बराबर फ़ाइल आकार के लिए imaged क्षेत्र की मात्रा कम हो जाएगा गतिशीलता उपयुक्त उपयोग करना। उच्च फ्रेम दर (एसईसी या millisec) लंबे समय के तराजू (जैसे घंटा) से अधिक वीडियो ले रही है और कम फ्रेम दर (जैसे मिनट)। छोटे वीडियो तेजी से गतिशीलता के साथ viscoelastic biofilms (न्यूनतम) के लिए ले जाया जा सकता है, लेकिन आवश्यकता की आवश्यकता होती है फ़ाइल रखेंगे संकल्प, फ्रेम दर, एक प्रयोग के लिए वीडियो की अवधि विनयशील विश्लेषण के लिए कम आकार।Biofilm viscoelasticity, वहterogeneity और आयाम
कण गति बहुत लोचदार biofilms (एमएसडी <10 -4) में undetectable हो सकता है। ऐसे मामलों में, कण विस्थापित करने के लिए बल लागू कि सक्रिय microrheological तकनीक बेहतर कर रहे हैं। Biofilm के अलग-अलग क्षेत्रों के rheological नमूना biofilm के यांत्रिक विविधता पर कब्जा कर लिया है यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। विषम आकृति विज्ञान, तथापि, सजातीय छपने के बावजूद biofilm rheology में जटिल हो सकता है, के रूप में जरूरी यांत्रिक विविधता का एक अच्छा संकेत नहीं है: Δpsl biofilms अधिक आकृति विज्ञान में सजातीय और भेदभाव में देरी कर रहे हैं, लेकिन एक जटिल और विषम रियोलॉजिकल प्रोफ़ाइल है। इसके विपरीत, Δpel biofilms अच्छी तरह से भेदभाव कर microcolonies के साथ एक विषम उपस्थिति लेकिन biofilm भर में एक निरंतर rheology है। बड़े microcolony आयाम (जैसे> 50 व्यास और ऊंचाई में माइक्रोन), यह हो सकता है सार्थक एस के साथ biofilms के लिएtudy microcolony किनारे से ऊंचाई (ऊपर और microcolonies के नीचे), या दूरी के अनुसार रियोलॉजिकल मतभेद।
जांच के कणों का चयन
ऊपर वर्णित है, कणों का आकार अपने viscoelastic गुण को जन्म दे कि सामग्री के ढांचे से अधिक होनी चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न सतह के रसायन शास्त्र के साथ कणों biofilm के भीतर विभिन्न क्षेत्रों और ईपीएस घटकों के लिए बाध्य हो सकता है। कि biofilm विविधता पर विचार किया जा सकता है तो इस प्रकार अलग सतह के रसायन विज्ञान के साथ कणों के प्रभाव का पता लगाया जाना चाहिए। सभी जांच कणों ढेर को कम से कम करने के लिए एक उच्च जीटा क्षमता होनी चाहिए। एक साथ बाँध कण कि सटीक जांच के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
बहाव के न्यूनतम
बहाव तापमान या हवा के दबाव में परिवर्तन, (आमतौर पर Z-दिशा में) खुर्दबीन मंच आंदोलन, विरोधी वी के कारण हो सकते हैंibration तालिका असंतुलन और प्रणाली के भीतर आंतरिक प्रवाह। Drifts आमतौर पर कण और α की superdiffusion में> 1. एक α> 1 थर्मल ऊर्जा की तुलना में, सक्रिय प्रक्रियाओं शामिल चलती कण और निष्क्रिय microrheology हैं अन्य लागू नहीं है इंगित करता है कि परिणाम है।
उचित biofilm संस्कृति रखरखाव
प्रवाह कोशिकाओं को ठीक से लीकेज रोकने के लिए इकट्ठा किया जाना चाहिए और biofilms संक्रमण से मुक्त रखा जाना चाहिए। Biofilms भी इस तरह स्थिर संवर्धन की स्थिति के लिए स्लाइड और microwells के रूप में, प्रवाह सेल करने के लिए अन्य setups विकल्प में उगाया जा सकता है। एक औंधा माइक्रोस्कोप microwells की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
सारांश में, कण ट्रैकिंग microrheology एक जैविक प्रयोगशाला के लिए मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रोजगार प्राप्त किया जा सकता है कि एक उपयोगी तकनीक है। इसके अलावा, गणना और कण MSDs के विश्लेषण में शामिल कार्यक्रमों सार्वजनिक क्षेत्र में आसानी से उपलब्ध है।उदाहरण के लिए, msdanalyzer और TrackArt 21 (के लिए http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart ) मैटलैब वातावरण में चलने वाले प्रोग्राम हैं। तकनीक कणों को स्थानांतरित करने के लिए तापीय ऊर्जा पर ही निर्भर करता है क्योंकि हालांकि, यह उच्च लोच के नमूनों के बीच हल करने में असमर्थ है। ऐसे चुंबकीय tweezing के रूप में चर्चित तकनीक, पर कार्रवाई और नमूना भीतर स्थानांतरित करने के कण पर बल लागू करते हैं और अत्यधिक लोचदार नमूनों की viscoelasticity निर्धारित करने में सक्षम हो जाएगा।
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Acknowledgments
इस शोध उत्कृष्टता कार्यक्रम के अपने अनुसंधान केंद्र के तहत शिक्षा सिंगापुर के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन और मंत्रालय द्वारा समर्थित है, शुरू हुआ अनुदान नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से (M4330002.C70), और AcRF टीयर 2 (MOE2014-T2-2-172) शिक्षा मंत्रालय, सिंगापुर से। लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन में भाग लेने के लिए जॉय रतालू Kuok Hoong धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
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