Introduction
Çoğu bakteri hücrelerinin hem planktonik (serbest yaşayan) ve büyümeye 1. yüzey bağlı (sesil) modları istihdam edebiliyoruz. Büyüme yüzeyi bağlı modunda, bakteri hücreleri salgılar ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) biyofilm oluşturmak için büyük miktarlarda kendilerini örten. EPS esas olarak protein, eksopolisakaritin, hücre dışı DNA'dan oluşur ve biyofilm 2 için gereklidir. Bu bakteriler mekansal farklılaştırmak için kullanabileceğiniz ve zararlı çevresel koşullar ve ev sahibi yanıtlardan bakterileri korur hangi tarafından fiziksel bir iskele olarak hizmet vermektedir. EPS farklı bileşenleri dramatik biyofilm yapıları 4 pişmanlık olabilir EPS bileşenleri ifadesinde biyofilm oluşumu 3 ve değişiklikler farklı rollere sahiptir. EPS bileşenleri molekülleri 5 sinyal olarak işlev görebilir ve son çalışmalar onların göç ve biyofilm diff rehberlik mikrobiyal hücrelerin ile etkileşim bazı EPS bileşenleri göstermiştirerentiation 6-8.
EPS Araştırma ölçüde EPS 9,10 belirli bir bileşeni kusurlu mutantlar tarafından üretilen biyofilm morfolojik analizler dayalı gelişmiş etmiştir. Buna ek olarak, EPS genellikle makro ölçekli (toplu karakterizasyonu) 11 de karakterize edilir. Morfolojik, ortalama değerleri döndürür biyofilm heterojenliğinden içinde var detay kaybeder nicel detay ve dökme karakterizasyonu, yoksun olabilir, ancak analiz eder. Mikro ölçekte EPS mekanik özelliklerinin gerçek zamanlı karakterizasyonu ilerleme artan bir eğilim artık yoktur. Bu protokol parçacık izleme microrheology Pseudomonas aeruginosa biyofilm 4 viskoelastisite ve etkin çapraz bağlanma üzerinde matris bileşenleri Pel uzaysal efektleri ve PSL eksopolisakaridleri belirlemek mümkün gösterilmiştir.
Pasif microrheology basit ve ucuz bir rh olduğunugüncel 12,13 bir malzemenin uzaysal microrheological örnekleme yüksek verim sağlar eology yöntemi. Pasif microrheology, prob küreler örnek yerleştirilir ve termal enerji (k B-T) ile tahrik edilen kendi Brown hareketi, bir video mikroskobu ile takip edilir. Çeşitli parçacıklar aynı zamanda izlenebilir ve parçacıkların zamana bağlı koordinatları geleneksel bir rastgele yürüyüş izleyin. Bu nedenle, ortalama olarak, parçacıklar aynı konumda kalır. Ancak, yer değiştirmelerin standart sapma veya ortalama parçacıkların deplasman (MSD) karesine, sıfır değildir. Viskoz sıvılar akış beri zaman ilerledikçe, yapışkan bir sıvı içindeki parçacık MSD doğrusal büyür. Buna karşılık, polimerik çapraz viskoelastik bulunan veya elastik maddeler onları akışını karşı yardımcı olur ve partiküller MSD eğrisinin (Şekil 1A) yaylalara lider, kendi yerinden sınırlı olur. Bu gözlem, bir ilişki aşağıdaki MSDαt
Parçacığın boyutu, yoğunluğu ve yüzey kimyası microrheological deney doğru bir şekilde uygulanması için kritik olan ve (bu durumda biyofilm matris polimerleri, Şekil 1B'ye bakınız) ele sistemine göre seçilir. İlk olarak, partikül parçacık kendisinden çok daha küçük olan yapılarla maddenin reolojisini ölçer. Maddenin yapısı parçacığın, par hareketine benzer ölçek isenizTICLE münferit yapıların şekli ve yönelimi rahatsız edilir. Ancak partikülü saran yapıların daha küçük olması durumunda, bu etki, küçük olan ve parçacık (Şekil 1B) homojen bir ortamı gösteren, ortalama. İkincisi, parçacığın yoğunluğu sedimantasyon kaçınılması ve atalet kuvvetleri ihmal edilebilir, öyle ki (su bazlı ortamlar için 1.05 g ml -1) orta benzer olmalıdır. Polistren örgüleri olan çoğu parçacıklar yukarıdaki kriterleri karşılayan. Hareket maddesi yapıları ile termal enerji ve çarpışma ile tahrik rasgele ise, partikül MSD reolojik yorumlanması geçerlidir İdeal olarak, partikül biyofilm matris polimer ile etkileşmez. Bu prob partikül bağlamak veya bir ön yetişkin bir biyofilm yüzey öteye sıçrama eğiliminde olmaktadır olup olmadığının kontrol edilmesiyle görülmektedir. Ancak, biyofilm çekim olmamasına rağmen, parçacıkların matris içine dahil edilmesi gerekir.Buna ek olarak, biyofilm fizikokimyasal heterojenite Farklı parçacıklar biyofilm farklı bölgelerinde problar olarak daha uygun olan neden olabilir. Bu nedenle, farklı ebatlarda ve yüzey kimyası parçacıkları biyofilm uygulanmalıdır.
Bunun gibi, parçacık MSD bileşenleri reolojisine katkıda bulunmak ve biyofilm yayılması ne kadar farklı hakkında yararlı bilgiler verebilmektedir. Ayrıca, farklı prob kullanımı, bir biyofilm mekansal fizikokimyasal heterojenite hakkında bilgi elde sağlar. Bu yöntem, biyofilm mekanik özellikleri başka bir türden getirilmesi değiştirilir araştırmak karışık türleri biyofilm biyofilm mekanik özellikleri üzerindeki etkisi antibiyotik tedavisi test etmek için kullanılır ya da uygulanabilir. Parçacık KİSH'lerin biyofilm dağıtmasına karakterize etmek için yararlı olabilir. Bu tür çalışmalar bir potansiyel biyofilm tedavileri geliştirmek, biyofilm anlayışımızda yararlı olacaktıryararlı faaliyetler için biyofilmlerin nd mühendisliği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biyofilm Yetiştiriciliği
- Bakteriyel Suşlarının hazırlanması
- 1 gün önce biyofilm ekimi, dondurulmuş bakteri kültüründen uygun büyüme ortamı 2 ml aşılayarak planktonik bakteri kültürleri hazırlamak. Mukoid P. Luria Broth-ortamı (10 g L-1 NaCl, 10 g L-1 maya özütü ve 10 g L-1 tripton) kullanarak aeruginosa ve Δ pel ve Δ psl hatalı mutantları. 37 ° C ve 200 rpm'de çalkalanarak koşullarında bir gece boyunca inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanılarak OD 0.40 600 gecede kültürleri sulandırınız.
- Tercihen sökülmeden akış hücresi görüntülenmesinde mikroskop odasına getirilebilir bir mobil istasyon ya da arabası üzerinde, daha önce 14 tarif edilmiştir akış hücresi kurulumu, birleştirin.
- 2 L veya her bir akış hücresi için 5 L şişelerde steril büyüme ortamı hazırlayın. Minimal ortam M9 (48 mM Na-2 HPO 4, 22 mM kullanınKH 2 PO 4, 19 mM NH4CI, 9 mM NaCI, 2 mM MgSO 4 ve P.% 0.04 glukoz (ağırlık / hacim) ve% 0.2 (ağırlık / hacim) kasamino asitleri) ile desteklenmiş 0.1 mM CaCl2) aeruginosa hücre biyofilm akış.
- Mikrosantrifüj tüpleri içine kısım flüoresan mikrosferleri ve 9,391.2 g santrifüj içinde 5 dakika boyunca 2 O steril H aşağı dönerler. Önceki 2 L veya 5 L ortamı şişelerde büyüme ortamına ilave sodyum azid (dezenfektan) kaldırmak için 1 ml büyüme ortamında supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
NOT: mikroküreler Farklı boyutlarda farklı konsantrasyonlarda gelir ve talimatlara uygun şekilde seyreltilmiş edilmelidir. Örneğin, 2.18 x 10 6 mikro ml -1 her parçacık boyutu elde 1,0 mikron çapında mikrokürelerin 120 ul, 0.5 mikron çapında mikrosferler 15 ul ve büyüme ortamı 2 L'lik 0.2 mikron çapında mikro-0,96 ul dağıtılır. - Upst orta şişe takınAkış hücresinin ream ve büyüme ortamı tüm kurulum akmasına izin verin. Akışını durdurmak ve akış hücresi odalarına seyreltilmiş gecede kültürleri enjekte edilir. Bakteriler, yaklaşık 5.5 x 10 m -3 sn -1 veya bir peristaltik pompa ile 8 rpm'lik bir akış oranında büyüme ortamının akışı devam etmeden önce 1 saat süre ile lamel alt tabakası eklemek için izin verir.
Not: Biyofilmler, genellikle 3-7 gün boyunca oda sıcaklığında (25 ° C) yetiştirilir. - Seçenek olarak ise, statik kültürü kurulumu için, partiküller ile 1 ml büyüme ortamına, gece boyunca kültürün 10 ul ekleyerek, gece boyuncaki kültürleri mikrosantrifüj tüplerinde 100 kat seyreltilir. Akış biyofilm için kullanılana kıyasla yaklaşık 500 kat statik kültürü için büyüme ortamında partikül konsantrasyonu artırmak (örneğin, yıkama ve büyüme ortamına, 10 ml 1,0 um çapında küre 600 ul tekrar süspansiyon) sürekli ile takviye edilir akış hücresi olarak biyofilm parçacıklar ancak statik kültürler değildir.
- 200 ekle1; 8 kuyu slaytlar odalarına parçacıkları ile seyreltilmiş gecede kültür l. Statik koşullar altında 37 ° C'de inkübe edin. Biyofilmler, genellikle 1 gün için büyütülür. Biyofilm fazla 1 gün yetiştirilir halinde parçacıklar ile, taze büyüme ortamı ile günlük olarak harcanan büyüme ortamını değiştirin.
2. Mikroskopi
- 3 gün ve 5, peristaltik pompanın akışını kapatın ve mikroskopi odasına akış hücresi kurulumu getir. Akış hücresi odalarının girişinde ya da çıkışında Kelepçe boru kayması akışından (ortamındaki değişikliklere göre sistematik bir hata nedeni) önlemek için. Dik bir mikroskop mikroskop sahneye akış hücresi yerleştirin.
NOT: mikro görüntüleme için ters bir mikroskop kullanın. - Çeşitli yerlerde (mikrokoloniler ve düz farklılaşmamış katmanları) de biyofilm gömülü mikroküreli hareket videolar ve farklı günlerde (gün 3 ve 5) için almak 40X petrol amacı ile floresan mikroskopi kullanınzamansal ve uzamsal araştırmalar. Kısa zaman ölçeklerinde içinde meydana gelen olayları araştırmak için daha yüksek kare hızı ile kısa videolar çekin (örn 25-50 hızlı dinamikleri için saniye başına kare kare hızında 1.5-3 dakika video) ve daha düşük kare hızı ile daha uzun videolar uzun süre boyunca olayları araştırmak için terazi (2.5-5 kare / yavaş dinamikleri için sn kare hızında, örneğin 15-30 dakika videolar).
NOT: Bir video genellikle 5-10 parçacıklar içerir ve dosya boyutu, genellikle 1,0-2,5 GB olduğunu. Büyük mikrokoloniler fazla parçacıkları tutabilir. Her kategori için 5-10 videolar (farklı mikrokoloniler ve düz farklılaşmamış katmanlarda farklı yerlerde örneğin 5-10 videoları) atın. Biyofilm mikrokoloniler, kanal, boşluklar ve düz farklılaşmamış tabakadan oluşabilir heterojen bir mimariye sahiptir. - Fiji / ImageJ tarafından okunabilir uygun biçimde videoları (örneğin Czi, tif) kaydedin.
- Bitmiş vid gezinerek drift videoları kontroleo ve parçacıklar aynı anda aynı yönde hareket olmadığını gözlemleyerek. Drift z aşamalı hareket, akış hücresi akımlar, titreşim önleyici tablo, hava basıncı ya da sıcaklık değişimlerinden dengesizlik neden olabilir. Doğru minör genellikle mikroskop Yazılımla birlikte verilen post-işleme teknikleri kullanılarak sürüklenen. Sürüklenme düzeltilebilir olamaz, burada herhangi bir video atın. Parçacık Takip Analizi sırasında gerekli olan aşağıdaki parametreleri, kayıt: Çözünürlük (px / um), Çerçeveler sayısı, süresi.
- Mikroskop sahneye gelen akış hücresini çıkarın ve biyofilm yetiştirilmesi devam peristaltik pompa yeniden başlatın.
3. Parçacık Takip Analizi
- Açık kaynak kodlu yazılım (ImageJ) 'de plug-in TrackMate kullanarak parçacık yörüngeleri edinin. En Fiji indirin http://fiji.sc/Fiji. Fiji ve Eklentiler menüsünün altında videoyu açın, İzleme ve TrackMate seçin.
- Giriş veya th ayarlarıadım 2.4 kaydedilen video parametrelerini maç için ilk kalibrasyon ayarlarını düşündüren e penceresi.
- ImageJ kullanılarak TrackMate partiküller algılar.
- (Örneğin 1000) 'LoG dedektörü', giriş parçacık çapına ve eşik değerini seçin. Mor çevreler videosu boyunca parçacıkları takip ettiğini kontrol etmek 'Preview' butonuna tıklayarak ederken videonun ilerleyin. Gerekirse çap ve eşik değerlerini ayarlayın: mor çevreler boş uzayda görülüyorsa eşik değerini artırın. Yeterli parçacıklar tespit edilirse eşik değerini azaltın. Algılamasını parçacıkları tamamlamak için bir sonraki düğmesini tıklatın.
- Eklemek veya 'İlk eşikleme' tespit parçacıkların kaldırılması, 'bir görünüm seç' ve ilk parçacık algılama tatmin edici olmadığını pencereler ayarlama yapmadan devam etmek için 'bir filtre seçin' seçeneği ile sunulan bir sonraki düğmesini tıklayın.
- Opti içinde 'Basit LAP tracker' seçeneğiniparçacıkların nadir biyofilmdeki odak dışına taşımak ve kolayca izlenir olarak barda pencereyi 'Bir izci yöntemi seçin.' Önerilen veya düşük bağlantı ve boşluk kapama maksimum mesafe değerleri kullanın ve bir sonraki tıklayın.
- Bu parçacık izleme parçacıkların TrackMate tarafından çizilen izleri takip ettiklerini ve hiçbir istenmeyen veya eksik parça olduğunu görmek için video aracılığıyla kaydırarak yeterli olup olmadığını kontrol edin. Çeşitli filtreleme adımları atlayın. 'Bir eylem seçin' nihai penceresine gidin. Açılır menüden 'xml dosyasına İhracat parçaları seçin ve' Yürütme 'düğmesine tıklayın. Parçaları kaydetmek için bir klasör seçin.
NOT: parçacık yörüngeleri ve microrheology kullanımının analizi için kamusal alanda mevcut çeşitli programlar vardır. msdanalyzer ve TrackArt Matlab ortamında çalıştırmak parçacık izleme analiz programları örnekleridir.
- Menüsündeki seçerek xml dosyaları parçacık yörüngeleri almak için Matlab hazırlayınMatlab Dosya> Set Yolu ... ve komut Fiji paketi ile mevcut klasörü ekleyin.
- Msdanalyzer parçacık yörüngeleri analiz etmek, zip dosyası veya tar.gz dosya bağlantısını indir at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- msdanalyzer Klasörünü 15 Özü ve Matlab yoluna ait bir klasörde bırakın (örneğin C: Documents and Settings <Kullanıcı adı> Belgelerim Matlab). Matlab başlatın ve yazarak analizörü başlatmak:
ma = msdanalyzer (2, 'um', 'sek')
um ve sek video fiziksel uzay ve zaman birimleri nerede.- Yazarak parçacık yörüngeleri İthalat:
[izler, md] = importTrackMateTracks ('DosyaAdı.xml', 'Clipz';, 'ScaleT')
ma = ma.addAll (parça);
burada 'Clipz' z 2B video boyutu ve 'scaleT' kaldırır. - Grafik kullanarak üzerine yörüngeleri Plot:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Kullanarak parçacıkların iskelet sistemi hesaplayın:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Her parçacığın iskelet sistemi çizilir:
şekil
ma.plotMSD - ) 3.5.1.4 ile 3.5.1.1 tekrarlayarak (günde 3 yabani tip mikrokoloniler gömülü örneğin parçacıkların) diğer aynı categery videoları partikül yörüngeleri birleştirin.
- Topluluk ortalama veya tüm eğriler üzerindeki ortalama Plot:
ma.plotMeanMSD
Logaritmik ölçeğe lineer Y ve X-ekseni değiştirin. Uzun gecikme zamanlarda, MSD eğrileri nedeniyle uzun zaman ölçeklerinde yetersiz istatistiklerine gürültülü olur. MSD eğrileri nedeniyle de dinamik hata dik yükselebilir. Eğrinin bu bölgeler fırça aracını kullanarak kaldırılabilir> eğrinin sonunu seçin ve seçme 'Fırçalama' Araçlar menüsünden 'Unbrushed Kaldır'.
- Yazarak parçacık yörüngeleri İthalat:
- En Ezyfit indirin http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ ve Matlab yoluna ait bir klasöre Ezyfit ekleyin (örneğin C: Documents and Settings <Kullanıcı adı> Belgelerim Matlab). Efmenu yüklemek Matlab çalışma alanında yazarak Ezyfit menüsüne yükleyin. Şekil penceresinde Ezyfit menüsü ile MATLAB yeniden başlatın. Ezyfit menüsünden 'Show Fit'> 'Güç'> 'a * x ^ n' seçerek güç hukuka MSD eğrileri uygun n tahmini Pasif üs α olduğu idi.
NOT: msdanalyzer MSD eğrilerinin takılması için Matlab Toolbox Montaj Eğrisi gerektirir. Ezyfit eğri uydurma gerçekleştirebilirsiniz alternatif ve ücretsiz bir yazılımdır. - Temizle akım parçacık yörüngeleri ve MSD'ler diğer yerlerde veya zamanda yeni parçacık ve iskelet hesaplamak için:
açık Çeşitli ortalama MSD orta (kontrol) içindeki partiküllerin eğrileri ve mikrokoloniler ve çeşitli suşları farklılaşmamış alanlar, kopyalama ve karşılaştırma için tek bir grafikte içine eğrileri yapıştırmak hesaplandıktan sonra. Örnek sertliği ve alt MSD değerleri ile çapraz bağlama artar. Düz eğrileri düşük a'yı ve örnek yüksek alfa ile dik eğrileri daha esnektir. - Eğri seçin ve medyan ve aralık gibi veri istatistiklerine bakmak için "Araçlar" gidin. Boncuk MSD bozulma uyumu ile orantılıdır, J boncuk ilişkiye göre gömülü olduğu malzemenin (t),
burada J = sürünme uyumu, d = partikül çapı, k B = Boltzman sabiti T = sıcaklık ve t = zaman.
- msdanalyzer Klasörünü 15 Özü ve Matlab yoluna ait bir klasörde bırakın (örneğin C: Documents and Settings <Kullanıcı adı> Belgelerim Matlab). Matlab başlatın ve yazarak analizörü başlatmak:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Boşlukları (biyofilm üzerindeki orta), ovalar (hücrelerin farklılaşmamış düz tabaka) ve mikrokoloniler (Şekil 2A etiketleri bakınız) dahil biyofilm, farklı bölgelerindeki biyofilm yerel viskoelastik özellikleri incelenmiştir. Gün olgunlaşma esnasında biyofilm viskoelastik özellikleri zamansal değişimi 3 ila 5 de belirlenmiştir. Boşlukların içindeki parçacıkların MSD saf ortam içinde parçacıkların MSD için bir kontrol ve karşılaştırılabilir olarak kullanılmıştır. Bunun aksine, biyofilm içinde sıkışıp parçacıklar sabit konumlarda vibrasyonu ve MSD değerleri viskoelastik malzemelerin tipik olan güçlü, elastik köpükler için (Şekil 3) arasında değişmektedir.
Sümüksü P. aeruginosa, vahşi tip ve Δ pel mutant suş hem (Şekil 2A ve 2B) kendi Biyofilmlererde 3. gün itibarı ile ince bir düzlükte dağılmış mikrokoloniler geliştirmiştir. 3. günde düz için çok incereolojik özelliklerinin incelenmesi. Mükoid P. tarafından oluşturulan her iki Biyofilmlererde Zaman mikrokoloniler elastiki belirten 10 sn (α = 0), 0.1 sn gecikme için aeruginosa vahşi tipli ve Δ pel suşları, günde 3 mikrokoloniler parçacıkların MSD (Şekil 4, Tablo 1) zaman bağımsızdır . İlgili parçacık KİSH'lerden hesaplanan medyan sürünme uygunsuzluklar -2 4.3 x 10 idi Pa -1 ve 3,6 x 10 -2 Pa sırasıyla -1. 5 gün mükoid P. mikrokoloniler sürünme uyumu ile aeruginosa, vahşi tip suşu matrisi içinde etkin bir çapraz bağlama bir azalma gösteren Pa -1 2.5 x 10 -1 yükselmiştir. Gün 5 mikrokoloniler hala sümüksü P. gün reolojinin 3 5. ovaları değişmedi α = 0 Δ pel elastik olduğu aeruginosa, vahşi tip ve Δ pel suşları Simi'yi edildielastikiyet lar (α = 0) ve vadelerine (farklılaşmamış yapı) yansıtıcı olabilir gün 3 mikrokoloniler, etkili çapraz.
Δ psl mutant suşu (Şekil 2C) tarafından oluşturulan biyofilm daha az farklılaşmış ve geliştirme gecikmeli oldu. Bu gün 3. MSD değerlerden sonra mikrokoloniler gelişti kalın ovaları ile Biyofilmlererde sonuçlandı biyofilm P. daha az etkili bir çapraz olduğunu gösterdi aeruginosa, vahşi tip ve Δ pel suşları (Şekil 4, Tablo 1). Ovalar a ile viskoelastik vardı = 0.12 ve 0.26 gün 3 de ve 5 sırasıyla. Gün 3 ve 5 ovaları medyan sünme uyumu 1.0 Pa idi -1. Mikrokoloniler günde 5 geliştiği zaman, bozulma uyumu bir eşik çapraz bağlama microcolony farklılaşması için gerekli olduğunu göstermektedir, 2.8 x 10 -1 Pa -1 düşmüştür. However, sürünme uyumu genç günde 3 mükoid P. sünme uyumu hala daha fazlaydı aeruginosa vahşi tipi ve Δpel mikrokoloniler. Gün 5 mikrokoloniler a = 0.34 ile viskoelastik idi. Bu nedenle, P. aeruginosa biyofilm elastik ve görüntü öğesi yokluğunda, yüksek ölçüde çapraz bağlanmış olan. PSL yokluğunda, biyofilm viskoelastik ve daha az çapraz bağlanmış hale geldi. Böyle mikrokoloniler olgun biyofilm yapılarında, Pel ve PSL eksopolisakaridlerin hem ifadesi zamanla farklı reolojik farklar sonuçlandı. Çapraz bağlama azalma olgunlaşması sırasında biyofilm matrisi içinde Pel eksopolisakaridlerin için PSL azalmasına bağlı olabilir.
Şekil 1:. Bir biyofilm parçacık izleme microrheology (A) Gri çevreler partikül MSD zaman ve birlikte doğrusal yetişen, yapışkan bir madde içinde tasvirα = 1 siyah üçgenler biyofilm EPS titreşimli prob parçacığın süresi ve = 0, (B) bağımsız bir elastik madde, parçacık MSD diyagramı tasvir etmektedir. Parçacık bir bakteri hücresi gibi modellenmiş ve çapı benzer olduğunu. Parçacık saran matris polimerleri parçacığın çok küçük.
Şekil 2: P erspecti v e ve d w e vi kesitsel bir y 5 biyofilm (yeşil) b y con f ocal microsco p y Conti n uous sonra < strong> (Mor) 1,0 μ m, 0.5 μ m (kırmızı) ve 0,2 μ m eeding f (turuncu) pa r negatif yüklü karboksillenmiş yüzeyi ile ticles. Biyofilmler (A) mukoid P. oluşturulan aeruginosa ve mutantlar (B) Δ pel ve (C) Δ psl suşları. Parçacıklar biyofilm tüm bölgelerde dahil edilmiştir. Mikrokoloniler, ovalar ve boşlukların örnekleri (A) etiketli. Chew ve diğ., MBio, 2014 Modifiye 4. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
fig3.jpg "/>
Şekil 3:. Büyüme ortamında Brown hareketi yürütme bir parçacığın bir parçanın Parçacık yörüngeleri Karşılaştırılması (çok renkli) biyofilm mikrokoloniler (koyu mavi) titreşen parçacıkların parça kıyasla. Parçalara renkler z-düzleminde odak dışı hareket nedeniyle parçacığa izleme sonları gösterir.
Şekil 4:. Biyofilmlererde 1.0 mikron partiküllerin MSD'ler Mukoid P. aeruginosa elastik ve mikrokoloniler 5 gün 3 itibaren geçerli çapraz bağlantı azalır; Δ pel elastiktir ve 3 ile 5 gün arasında reoloji değiştirmez; Δ psl viskoelastik ve özellikle 3 ila 5 gün reolojinin içinde önemli bir değişiklik yok ovalar oluşur.
| Gerginlik | Gün | Bölge </ td> | Medyan Creep Compliance (Pa -1) |
| Vahşi tip | 3 gün | Microcolony | 4.3 x 10 -2 |
| Vahşi tip | 5 gün | Microcolony | 2.5 x 10 -1 |
| Vahşi tip | 5 gün | Düz | 4.1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 gün | Microcolony | 3.6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 gün | Microcolony | 3.6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 gün | Düz | 3.2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 gün | Düz | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 gün | Düz | 1.0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 gün | Microcolony | 2.8 x 10 -1 |
Tablo 1: Medyan sürünme uygunsuzluklar ve yabani tip tahmini difüzif üsler ve biyofilm yaş ve bölgeye göre mutant suşlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology gibi mikrobiyel filmlerin olarak heterojen sistemler, yerel reolojik ölçümler için yararlı bir araçtır. Birden fazla kez puan üzerinden aynı biyolojik numune içinde reolojik değişikliklerin gerçek zamanlı izleme sağlayan bir tahribatsız tekniktir. Bu protokolde, partikül izleme microrheology onlar elastikiyet ve biyofilm matrisi etkin çapraz bağlanmasını nasıl etkilediğini araştırmak için Pel ve PSL ekzopolisakkarit mutantlar uygulandı. Pel viskoelastik ve gevşek biyofilm yanadır ise psl, yüksek etkili çapraz bağlantı elastik biyofilm gelişimini destekliyor. Her iki eksopolisakaridlerin üretilmesi durumunda, biyofilm mikrokoloniler daha etkili bir görüntü öğesi üzerindeki PSL bir azalma ile tutarlıdır, biyofilm olgunlaştıkça çapraz bağlanmış hale gelir.
Farklı bakteri türleri tarafından oluşturulan biyofilm farklı EPS bileşimleri vardır. Mükoid P. EPS esas olarak consi Bu çalışmada kullanılan aeruginosa suşu eksopolisakaridlerin 16 STS. Diğer türler büyük ekstrasellüler yapışma proteinleri EPS onların ana bileşenleri olarak 17 ve DNA 18 kullanabilirsiniz. Burada anlatılan yaklaşım reolojik diğer EPS bileşenlerin katkı ve büyüme üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, farklı kurulumları yetiştirilen biyofilm kendi reolojisini önemli ölçüde farklı fiziksel özelliklere sahip olabilir. Örneğin, P. sümüksü aeruginosa glikoz statik koşullara göre akış altında son derece farklılaşmış yapıları ile daha fazla biyofilm oluşturan ile desteklenmiş. Çalışmalar ayrıca akış biyofilm daha uyumlu ve esnek hale getirir 19,20 gibi biyofilm stres kesme maruz olduğunu göstermiştir. Aşağıdaki gibi önemli adımlar ve faktörlerdir başarılı biyofilm parçacık izleme microrheology çalışma için dikkate almak:
Zaman ve mekân açısından soruşturma veya ilgi ölçeği için sistem boyutları
İçerik "mekansal ölçekler dikkate alındığında> bir sistemin viskoelastik özelliklerine doğuran yapıların boyutunu düşünmek gerekir (bizim durumumuzda, biyofilm matrisi polimerler). prob parçacık çevreleyen polimerler çok daha küçük olmalı parçacık daha yapısı ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme küçük parçacık hareketi ya da titreşimleri yakalamak için gereklidir. parçacığa izotropik ortam sunmak, ama yavaş gösterirler. zamansal ölçekler dikkate alınarak, elastik biyofilm eşdeğer dosya boyutu için görüntülü alanın miktarını azaltacaktır dinamikleri, uygun kullanma. yüksek kare hızları (sn veya milisaniye) daha uzun zaman ölçeklerinde (örn saat) üzerinde video çekimi ve düşük kare hızları kullanılarak (örneğin dk). Shorter videoları hızlı dinamikleri ile viskoelastik biyofilm (dk) için alınabilir, ancak ihtiyaç gerektirir Dosyayı tutacak çözünürlük, kare hızı, her bir deney için video süresi uysal analiz için düşük boyutları.Biyofilm viskoelastisite, oterogeneity ve boyutlar
Parçacık hareketi çok elastik biyofilm (MSD <10 -4) saptanamayan olabilir. Bu gibi durumlarda, parçacık yer değiştirmesi için kuvvet uygulaması, aktif microrheological teknikleri tercih edilir. Biyofilm farklı bölgelerinde reolojik örnekleme biyofilm mekanik heterojen yakalanır sağlamak için yapılmalıdır. Heterojen morfolojisi, ancak homojen görünüşe rağmen biyofilm reolojisinin karmaşık olabilir gibi mutlaka mekanik heterojenite iyi bir göstergesi değildir: Δpsl biyofilm daha morfoloji homojen ve farklılaşmasında gecikmeli, ancak karmaşık ve heterojen reolojik profiline sahiptir. Bunun aksine, Δpel biyofilm iyi diferansiye mikrokoloniler ile heterojen bir görünüm, ancak biyofilm boyunca sabit bir reolojiye sahip. Büyük microcolony boyutları (örneğin> 50 çap ve yüksekliği mikron), bu olabilir anlamlı s biyofilm içintudy microcolony kenardan yüksekliği (üst ve alt mikrokoloniler), ya da mesafeye göre reolojik farklılıklar.
Prob parçacıklarının seçimi
Yukarıda tarif edildiği gibi, parçacıkların boyutu, viskoelastik özelliklerinin ortaya çıkmasına neden malzeme yapılardan daha büyük olmalıdır. Buna ek olarak, farklı bir yüzey kimyasına sahip partiküller biyofilm içinde farklı alanlarda ve EPS bileşenlerine bağlanma ile sonuçlanabilir. Bu biyofilm heterojen kabul edilebilir, böylece Böylece farklı yüzey kimyası ile parçacıkların etkileri araştırılmalıdır. Tüm prob parçacıkları aglomerasyonunu en aza indirmek için, yüksek zeta potansiyeline sahip olmalıdır. Birbirine bağlanan parçacıklar doğru problar olarak kullanılamaz ve analize dahil edilmelidir.
Sürüklenme Minimizasyonu
Drift sıcaklığı veya hava basıncı değişiklikleri, (genellikle z-yönünde) mikroskop aşamasında hareketi, anti-h kaynaklanabiliribration masa dengesizlik ve sistem içinde dahili akış. Sürükleniyor genellikle parçacık ve a- superdiffusion içinde> 1. Bir α> 1 termal enerji daha etkin işlemleri ilgili hareketli parçacık ve pasif microrheology diğer uygulanamaz olduğunu gösterir sonuçlanır.
Uygun biyofilm kültür bakımı
Akış hücreleri düzgün sızıntılarını engellemek için monte edilmelidir ve biyofilm kirden arındırılmış tutulmalıdır. Biyofilm ayrıca statik kültür koşulları için slaytlar ve mikro olarak, akış hücresi diğer kurulumları alternatif yetiştirilebilir. Bir inverted mikroskop mikro görüntüleme için kullanılmalıdır.
Özet olarak, parçacık izleme microrheology biyolojik laboratuar standart mikroskop kullanılarak, örneğin yararlı bir tekniktir. Buna ek olarak, hesaplama ve parçacık KİSH'lerden analizinde yer alan programlar kamusal alanda hazır.Örneğin msdanalyzer ve TrackArt 21 (için http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) Matlab ortamında çalıştırmak programlardır. Tekniği partikülleri taşımak için termal enerji sadece dayanır çünkü Ancak, yüksek elastisite örnekleri arasındaki çözemediği. Manyetik tweezing gibi aktif teknikler, hareket ve örnek içinde hareket etmek için parçacık üzerinde bir kuvvet uygulamak ve oldukça esnek örneklerin viskoelastisite belirlemek mümkün olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma Mükemmellik Programı kendi Araştırma Merkezi kapsamında Eğitim Singapur Ulusal Araştırma Vakfı ve Bakanlık tarafından desteklenen, Başlangıç Hibeler Nanyang Technological University (M4330002.C70) ve AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) Milli Eğitim Bakanlığı, Singapur. Yazarlar bu protokolün gösteriye katılmak için Joey Yam Kuok Hoong teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
