توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة
Summary
والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
تراكم الطفرات الوراثية في الجينات التنظيمية الرئيسية يغير برمجة الخلية الطبيعية مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والبقاء على قيد الحياة، مما يؤدي إلى السرطان 1. كيناز مسار RAS-RAF-MAP يتوسط الاستجابات الخلوية إلى إشارات النمو. يمكن أن الطفرات أنكجنيك BRAF تنجم عن طفرات في الجين سائق BRAF، والتي قد تتسبب في BRAF oncoprotein لتصبح مفرط 2. الطفرات في جين BRAF يؤدي أيضا إلى إشارات المصب فرط نشاط عن طريق منظمة مجاهدي خلق وERK 3، الذي، بدوره، يؤدي إلى نمو الخلايا المفرط والانتشار بشكل مستقل عن النمو بوساطة عامل التنظيم 4-6.
تتوفر لالتنميط تحور الحمض النووي، مثل الكمية في الوقت الحقيقي الطفرات BRAF V600E في، (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية التي ddPCR العديد من الأدوات. ddPCR هو الأسلوب القائم على PCR لتقدير المطلقتقدم دقة أعلى بالمقارنة مع التقليدية الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) 7،8. يوفر ddPCR أيضا أعلى حل السلطة ودقة للكشف عن الطفرات النادرة في قوالب DNA، مما أبحاث السرطان أكثر إفادة والتشخيص 9. وتشمل مزايا إضافية من ddPCR على QPCR التقليدية حساسيتها تعزيز والدقة عند دراسة الأرقام نسخة قالب منخفض 10-12. هنا، يتجلى بروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية، تليها تحديد وجود أو عدم وجود الطفرات BRAF V600E التي كتبها ddPCR تلقائيا. وكما وصفت استخدام البرمجيات لتحليل البيانات وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله هو بسيط نسبيا وتماما يعتمد على عدد من العينات المراد محة وعدد PCR وddPCR الآلات التقليدية المتاحة.
يصف بروتوكول فقا للإجراءات العادية لBR إشارة FFPE خطوط الخلايا القياسية AF V600E إيجابية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) يتم تنفيذ في صك مؤتمتة بالكامل باستخدام بروتوكول الأنسجة نظام إعداد (TPS). وفي وقت لاحق، ويتم تحليل عينات من الحمض النووي معزولة عن وجود طفرات BRAF V600E باستخدام نظام ddPCR. يتم إجراء تحليل الطفرة المستهدفة بعد أن تم محة عن العينات وتم تحميل البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. اعتمادا على عدد العينات / درس المجموعات، وتحليل البيانات قد تتطلب من واحد إلى عدة ساعات. العنصر التجريبي للمنهجية تتطلب دقة في التعامل مع DNA وrological الماصات وPipettors، شريط فيديو إن الرب علوم التربية شرح المزيد عن عن سياق pipetting ل"> pipetting لفي 96 لوحات جيدة، في حين أن تحليل البيانات تتم باستخدام البرمجيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نسلط الضوء على تطبيق ddPCR وعزل الحمض النووي من الإشارة FFPE القياسية عينات خط الخلية لتقييم محدد تحور الجين. في هذه الدراسة، تم استخدام TPS الآلي DNA طريقة العزلة التي يمكن تكييفها بسهولة، الآلي، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب ع?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل برنامج R & D للجمعية مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (منحة رقم 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Referencias
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, ‘definetherain’. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
