Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

El objetivo general de este procedimiento es reconstituir funcionalmente los canales de mezcal en una interfaz de gotas, un sistema bicapa, y examinar la respuesta de estos canales mecanosensibles a estímulos mecánicos armónicos. Este método permite el estudio de la actividad eléctrica mecánica del mutante de mezcal V 23 T en respuesta a la excitación mecánica armónica después de la reconstitución en una interfaz de gotas por sistema de capas. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza las ventajas técnicas tanto de la técnica de fijación de parche como de los métodos de interfaz de gotas por capa con la capacidad de miniaturizarse, así como la capacidad de controlar la composición química de cada lado de la membrana.

Para formular liposomas, prepare 10 mililitros de una solución lipídica de dos miligramos por mililitro agregando 10 mililitros de tampón de cloruro de potasio a 20 miligramos de lípidos sintéticos D-P-H-P-C comprados como polvo liofilizado. Asegúrese de que tanto los vehículos lipídicos como la solución tampón estén bien mezclados. La mezcla debe verse homogénea y turbia cuando todo se disuelva.

Congele la mezcla a menos 20 grados centígrados, ahora descongele completamente la nueva mezcla de lípidos, dejando que la mezcla se descongele a temperatura ambiente y no en un ambiente caliente. Después de un total de seis ciclos de congelación y descongelación, utilice una extrusora disponible en el mercado para extruir los lípidos forzando toda la suspensión lipídica primero a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 micras y luego seis veces a través de un filtro de membrana de 0,1 micras. Este proceso produce partículas con diámetros cercanos a los 100 nanómetros.

Para fabricar el depósito de aceite, perfore dos orificios opuestos a través de la pared de un cilindro acrílico de dos pulgadas de diámetro y 1,5 centímetros de largo. Los agujeros deben tener un milímetro de diámetro y un centímetro desde el fondo. A continuación, taladre dos agujeros de cuatro milímetros concéntricos a los agujeros de un milímetro perforados anteriormente.

Las profundidades de los agujeros deben ser de un milímetro cada uno. Tenga cuidado de no perforarlos por completo. Estos orificios están hechos para encajar en las juntas de goma.

Coloque y pegue dos juntas de goma de un milímetro de diámetro interior en los orificios más grandes para evitar fugas de aceite. Luego, pegue la máquina al cilindro a una lámina acrílica delgada de 10 centímetros por 10 centímetros usando cualquier epoxi multipropósito el día del experimento, corte una longitud de siete centímetros de alambres de plata de 2 250 micras de diámetro y luego sumerja sus puntas en lejía durante dos horas. Para formar una capa de cloruro de plata, un color gris indica que se ha formado una capa de cloruro de plata.

Con un cortador de vidrio, divida un capilar de vidrio de silicato prestado de 10 centímetros de largo de un milímetro de diámetro exterior y señale un diámetro interior de 58 milímetros en dos capilares de cinco centímetros. Usando una jeringa de un mililitro con una aguja de punta roma de calibre 18, llene los capilares con el hidrogel P-E-G-D-M-A para evitar que el hidrogel hidratado se hinche fuera del capilar. Mantenga una distancia de tres milímetros en las puntas y asegúrese de que no haya burbujas de aire en los capilares.

Inserte los electrodos de plata, cloruro de plata en los capilares llenos de hidrogel. Cura el hidrogel P-E-G-D-M-A a a través de la fotopolimerización de radicales libres tras la exposición a la luz ultravioleta durante dos minutos a un vatio utilizando un punto ultravioleta, el experimento se configura bajo una jaula de Faraday conectada a tierra a una conexión a tierra en el amplificador de parche. Conecte una de las micropipetas a un soporte de microelectrodos recto que tenga un conector macho.

A continuación, conecte el soporte de microelectrodos a la etapa principal del amplificador de parche. Para conectar la etapa principal a la tierra, suelde un cable de cobre aislado de calibre 18 a un conector apropiado para la etapa principal, monte la etapa principal en un micromanipulador manual de tres ejes conectando primero la placa de montaje de la etapa principal al micromanipulador y luego conectando la etapa principal a la placa de montaje. Con los tornillos adecuados, fije la segunda micropipeta al actuador lineal a través de un conector fabricado en laboratorio y, a continuación, monte ambas en un segundo manipulador de micras.

Las micropipetas deben estar opuestas entre sí, alineadas y niveladas horizontalmente. A continuación, en un vial de vidrio, mezcle 0,1 mililitros de los liposomas D-P-H-P-C con 0,01 mililitros de la solución de liposomas de protea de mezcal V 23 T. Con una aguja de microrelleno de calibre 34, llene las puntas de ambas micropipetas con una solución de proteosoma.

Coloque el depósito en la parte superior de un microscopio vertical y pase las micropipetas a través de los orificios opuestos de un milímetro. A continuación, llene el depósito hasta la superficie con decano hexadecimal para formar las gotas esféricas en la punta de las micropipetas. Utilice una tercera micropipeta de vidrio de silicato bo de 10 micras de diámetro montada en un tercer manipulador de microm para dispensar una solución diluida de liposoma de protea de mezcal V 23 T en las puntas de las micropipetas y formar las gotas.

Controle el tamaño de las gotas disminuyendo o aumentando el volumen según lo desee, y déjelas reposar durante 10 minutos para que las monocapas se formen por completo. A continuación, ponga las gotas en contacto por capa. La formación ocurrirá dentro de uno o dos minutos.

Después de configurar el software y el equipo como se describe en el protocolo de texto, utilice un cable BNC para conectar la salida de un generador de forma de onda al interruptor frontal de entrada de comando externo. Envíe una forma de onda triangular de tope pico de 10 hercios y 500 milivoltios a la etapa principal. Usando el manipulador de micrómetros.

Mueva las micropipetas de vidrio horizontalmente para que las gotas entren en contacto hasta que se toquen ligeramente y espere a que se produzca el adelgazamiento de la bicapa. La progresión del proceso de formación de bicapas se puede ver visualmente a través del microscopio y se puede monitorear mediante la medición de corriente. Ajuste el tamaño de la bicapa a aproximadamente 250 micras de diámetro controlando la posición de la gota montada en el actuador usando el manipulador, el tamaño de la bicapa se puede estimar visualmente a través del microscopio.

Una vez que la bicapa se ha formado y es estable, estimule las gotas enviando una señal sinusoidal utilizando un generador de funciones para estimular la proteína de mezcal incorporada en la bicapa. Envíe una forma de onda sinusoidal con una amplitud de pico a pico de 175 micras, una frecuencia de 0,2 hercios y un ciclo de trabajo del 50% al controlador de servidor eléctrico Pieto. Aquí se muestra una grabación atípica de corriente en tiempo real.

La capacitancia medida de la bicapa aumenta repentinamente, lo que indica un adelgazamiento y formación de bicapas antes de que alcance un estado estacionario. La bicapa podría controlarse cambiando la posición de las gotas cuando el DIB se estimula mecánicamente, manteniendo un potencial de CC constante a través de la membrana. El mutante V 23 T del mezcal genera actividades confiables que incluyen principalmente estados subconductores y ocasionalmente eventos de apertura completa.

La compuerta se produce principalmente en el pico de compresión, lo que indica que está relacionado con un aumento de la tensión de la bicapa, como se muestra en el gráfico polar. En este sentido, se destaca la capacidad de esta técnica para ser utilizada para probar otros tipos de biomoléculas. La etina, que es un canal iónico dependiente de voltaje, aumenta la permeabilidad de la membrana con la aplicación de un potencial transmembrana de CC Uno maestro.

Esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe romper accidentalmente los capilares de vidrio o de otra manera. Debe reiniciar la configuración y asegurarse de que todos los cables estén conectados después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los canales activados por estiramiento exploraran nuevos métodos a través de los cuales las fuerzas externas se pueden transmitir a la puerta de los canales sensibles al mecanismo integrado DIB. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo formar una interfaz de gotas por capas, incorporar canales mecanosensibles en las membranas artificiales y estimular estos canales mecánicamente.