Summary

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Published: April 21, 2016
doi:

Summary

Se describe un conjunto de protocolos que en conjunto proporcionan un bioink hidrogel imitando tejido con el que construcciones de tejido 3-D funcionales y viables se pueden bioprinted para su uso en aplicaciones de cribado in vitro.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model “organoids” that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

En los últimos años, una variedad de tecnologías se han convertido en disponibles que aborda la necesidad de fuentes alternativas de órganos y tejidos funcionales mediante la búsqueda de fabricar, o biofabricate, ellos. Bioprinting ha surgido como uno de los más prometedores de estas tecnologías. Bioprinting se puede considerar como una forma de fabricación aditiva robótico de partes biológicas, que se puede utilizar para construir o modelo viable estructuras de órganos similares o similar a un tejido en 3 dimensiones. 1 En la mayoría de los casos, bioprinting emplea un 3 dimensiones (3 -D) dispositivo de impresión que está dirigido por un ordenador para depositar las células y biomateriales en posiciones precisas, recapitulando lo tanto anatómica que imitan arquitecturas fisiológicas. 2 Estos dispositivos de impresión de un "bioink", que puede tomar la forma de agregados de células, las células encapsuladas en hidrogeles o fluidos viscosos, o microportadores sembrado de células, así como polímeros libres de células que proporcionan estructura mecánica o actuar como pla libre de células3,4. ceholders Siguiendo el proceso bioprinting, la estructura resultante puede ser madurados en las estructuras de tejidos u órganos funcionales, y se utilizan para su aplicación final previsto. 5,6 Hasta la fecha, un órgano de tamaño humano completamente funcional completa no se ha impreso, pero sigue siendo el principal objetivo a largo plazo de bioprinting investigación y desarrollo. 2 sin embargo, a pequeña escala "organoides" construcciones de tejido actualmente están siendo implementados en una serie de aplicaciones, incluyendo el modelado patología, desarrollo de fármacos, y la investigación de la toxicología.

Uno de los principales obstáculos que los investigadores han encontrado en la aplicación de tecnología bioprinting es que muy pocos materiales han sido desarrollados con el propósito explícito de bioprinting. Para tener éxito con eficacia en bioprinting, un biomaterial debe cumplir 4 requisitos básicos. El biomaterial debe tener 1) las propiedades mecánicas adecuadas para permitir la deposición (sea extrusión a través de una boquilla como un gel o un inkjet como una gota), 2) la capacidad para mantener su forma como un componente de una estructura 3-D después de la deposición, 3) la capacidad de control de los usuarios de las 2 características anteriores, y 4) el medio ambiente amistoso y de apoyo una célula en absoluto fases del procedimiento. bioprinting 7 Históricamente, el trabajo bioprinting menudo ha tratado de emplear biomateriales tradicionales existentes en dispositivos bioprinting sin tener en cuenta su compatibilidad, en lugar de diseñar un biomaterial que tienen las propiedades necesarias para bioprinting y aplicaciones de post-impresión posteriores.

Una variedad de bioinks se han desarrollado recientemente para mejor interfaz con el hardware de deposición y fabricación. sistemas de hidrogel estándar plantean problemas significativos debido a que generalmente existen como sea precursor de soluciones de fluidos con propiedades mecánicas insuficientes, o hidrogeles polimerizados que si imprimen pueden obstruir las boquillas o se rompan suba sobre el proceso de extrusión. Nuestro equipo, así como otheRS, han explorado diversas formulaciones de hidrogel para hacer frente a estos problemas bioprinting, incluyendo la impresión de esferoides de células en sustratos de hidrogel, 5,8 celular y el filamento de hidrogel de extrusión de tubos microcapillary, 9-11 extruibles ácido hialurónico (HA) hidrogeles de nanopartículas con propiedades de reticulación -Gold dinámicos , 12 de control temporal de la rigidez de hidrogel utilizando fotopolimerizable metacrilado HA y gelatina, 13 de reticulación basado en fibrinógeno-trombina, 14,15 geles de alginato-colágeno de intercambio iónico, 16 y recientemente rápida polimerización de luz ultravioleta (UV) de reticulación -initiated, 17

Estos ejemplos demuestran la viabilidad de los materiales de generación que puede ser bioprinted eficacia. Sin embargo, además de la integración con el hardware, para generar con éxito construcciones de tejido viable y funcional 3-D, los biomateriales deben contener señales bioquímicas y mecánicas que ayuda en el mantenimiento celularviabilidad y función. Estos factores adicionales, perfiles bioquímicos y mecánicos, pueden tener una influencia significativa en la función exitosa de construcciones de tejido bioprinted.

Tanto las células y la matriz extracelular nativa (ECM) son responsables de presentar una amplia gama de moléculas de señalización, tales como factores de crecimiento y otras citoquinas a otras células. La combinación de estas señales varía de un tejido a otro, pero puede ser extremadamente potente e influyente en la regulación del comportamiento de células y tejidos. 18 El empleo de componentes de ECM específicos de tejido de diferentes órganos y la aplicación como un hidrogel o como parte de un hidrogel ha sido explorado con éxito. 19-21 Este enfoque, que se compone de decellularizing un tejido dado, pulverizando, y disolviéndolo, se puede utilizar para producir señales bioquímicas específicas de tejido de cualquier tejido y pueden incorporarse en construcciones de hidrogel 3-D. 22

Adicionalmente,es ampliamente documentado que los tejidos del cuerpo ocupan una amplia gama de rigideces. 23 Como tal, la capacidad de sintonizar las propiedades mecánicas de los biomateriales, tales como el módulo de elasticidad E 'o cizallamiento módulo elástico G', es una herramienta útil en la ingeniería de tejidos . Como se describió anteriormente, el control sobre las propiedades mecánicas bioink permite Biofabrication basado en extrusión usando un gel suave, que puede entonces manipulado adicionalmente por reticulación secundaria en un momento posterior, en la que los niveles de módulo de elasticidad se pueden lograr que coincide con la del tipo de órgano diana. Por ejemplo, los biomateriales se pueden personalizar para que coincida con una rigidez de 5 a 10 kPa como un hígado nativo, 23 o que coincida con una rigidez de 10 a 15 kPa como tejido cardíaco nativo, 24,25, en teoría, el aumento de la capacidad de estos organoides para funcionar en de manera similar a sus contrapartes tejido nativo. La influencia de la rigidez del medio ambiente en el fenotipo celular se ha explored en los últimos años, en particular con respecto a las células madre. Engler et al. Demostraron que la elasticidad de sustrato con la ayuda en la conducción de las células madre mesenquimales (MSC) hacia linajes con la elasticidad del tejido equivalente a la de sustrato. 25 Este concepto ha sido explorado adicionalmente para la diferenciación en músculo, la función cardíaca, el fenotipo del hígado, la proliferación de células madre hematopoyéticas , y el mantenimiento de células madre potencial terapéutico. 24,26-29 ser capaz de sintonizar un hidrogel a diferentes módulos de elasticidad es una característica importante de un biomaterial que se utiliza para biofabricate construcciones de tejido. 30

Aquí se describe un protocolo que representa un enfoque versátil que se utiliza en nuestro laboratorio para formular un sistema de hidrogel que se puede extrusión bioprinted, y personalizar para 1) contener el perfil bioquímico de un tipo de tejido particular, y 2) imitan el módulo elástico de ese tipo de tejido . Al abordar estos requisitos, nuestro objetivo es provide un material que puede recapitular las características fisicoquímicas y biológicas de in vivo de tejidos. 31 El sistema compuesto de hidrogel modular descrito en el presente documento se aprovecha de un enfoque de reticulación múltiples para producir bioinks extruibles, y permite una reticulación secundaria para estabilizar y aumenta la rigidez de la productos finales para que coincida con una gama de tipos de tejidos. personalización bioquímica se cumple mediante el uso de componentes de ECM específicos de tejido. Como demostración, empleamos una variedad específica del hígado de este sistema de hidrogel de Bioprint hígado funcional construcciones organoides. El protocolo descrito utiliza un dispositivo bioprinting 3-D personalizado. En general, este protocolo se puede adaptar a la mayoría de las impresoras de base de extrusión, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren pruebas por el usuario.

Protocol

1. hidrogel Bioink Formulaciones y Preparación Con el fin de proporcionar perfiles bioquímicos específicos de tejido, específico de tejido preparar ECM digerir soluciones como se describió anteriormente para el hígado. 20 Nota: En general, esta ECM digest comprenderá 40% del volumen bioink hidrogel final que se emplea. Varios cientos de mililitros de solución de ECM digesto se pueden preparar, alícuotas, y se congelaron a -80 ° C para uso futuro. Antes de hidrogel formulación, disolver un fotoiniciador, 2-hidroxi-4 '- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, en agua a 0,1% w / v. Nota: Los volúmenes en el rango de 50-100 ml se pueden preparar con antelación y se almacena protegida de la luz a 4 ° C durante varios meses. Para formar bioinks de hidrogel, primero disolver los componentes de material de base de los kits de hidrogel de ácido hialurónico (HA) en la solución de fotoiniciador agua. Disolver la gelatina tiolada HA y tiolada por separado en agua-photoinitiator solución (paso 1.2) para hacer 2% w / v soluciones. Disolver diacrilato de polietilenglicol (PEGDA), el agente de reticulación en los kits de hidrogel, en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución. Disolver polietilenglicol (PEG) alquino 8-brazo (10 kDa MW) en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución. En general, formar hidrogeles utilizando el siguiente esquema, aunque personalización adicional es posible. Combinar 4 partes 2% tiolado HA, 4 partes 2% de gelatina tiolada, 1 parte reticulador 1, 1 parte reticulante 2 con 8 partes de solución de ECM tejido y 2 partes de medios de cultivo de hepatocitos (HCM) (o 10 partes de agua como un no-tejido genérico hidrogel específicos de). Nota: adicional HA no modificado o gelatina se pueden añadir para que la extrusión bioink más suavemente. Esto se describe a continuación. Agite la mezcla resultante en alta (velocidad 10 de 10) durante 10 segundos para mezclar antes de su uso. </ Li> El uso de hidrogel bioink Para la extrusión o ensayo bioprinting, transferir la mezcla en un cartucho de jeringa o una impresora y deje que se reticulan espontáneamente durante 30 minutos (etapa 1 reticulación) a 37 ° C. Para las mediciones reológicas, transferir la mezcla en una placa de Petri de 35 mm y dejarla para reticular durante 30 minutos. Nota: La mezcla comienza inmediatamente para reticular a través de la formación del enlace tiol-acrilato y comenzará a aumentar la viscosidad. La mezcla debe ser transferida a una jeringa, cartucho de impresión, o ubicación de destino dentro de los 10 min para evitar la obstrucción de una pipeta o una jeringa durante la transferencia. Cuando se desea reticulación secundaria (etapa 2), irradiar la etapa geles 1-reticulados con luz ultravioleta (365 nm, 18 W / cm 2) para iniciar una reacción de polimerización tiol-alquino. Nota: La duración de la irradiación depende de la superficie del material. En general, un centímetro cuadrado de material sólo requiere 1-2 seg de la exposición UV en este poder UV. 2. Pruebas de compatibilidad de la impresora Antes de las pruebas de integración con dispositivos bioprinting, las características de extrusión de ensayo sobre la mesa de laboratorio con ensayos de extrusión simples usando jeringas estándar y puntas de las agujas de calibre pequeño (20-30 gauge). Empuje la bioink a través de una jeringa estándar para lograr filamentos extruidos sin problemas de hidrogel con pocos o sin baches. Extrusión de líneas o patrones simples es suficiente para determinar el éxito. Para la integración bioprinter, cargar bioink preparados con la pipeta ellos en cartuchos de impresora, y permitir 30 minutos para el bioink a someterse espontánea etapa 1 reticulación dentro del cartucho. Nota: El volumen de bioink depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. cartuchos de impresora pueden parecerse o ser jeringas que son compatibles con el dispositivo bioprinter. Evaluar la compatibilidad de extrusiónpara bioprinting mediante la impresión de un patrón simple usando el bioink. Por ejemplo, imprimir un patrón de 7 x 7 mm compuesto por líneas paralelas. Aplicar presión (por ejemplo, 20 kPa de presión neumática), mientras que el cabezal de impresión se mueve en el plano XY a una velocidad de aproximadamente 300 mm / min. Nota: diámetros de boquilla del cabezal de impresión de diferentes tamaños se pueden utilizar, pero boquillas cónicas con aberturas de 400 a 500 m de diámetro son óptimas para la impresión de esferoides en el rango de 250 a 350 micras. Si los materiales extruidos son desiguales o irregulares, consulte el paso 2.4, o reducir la cantidad de PEGDA para ablandar el material reticulado etapa 1. formulaciones bioink preparados adecuadamente extruir sin problemas, lo que permite la deposición precisa de los patrones o arquitecturas deseados. Nota: Los procedimientos bioprinting uso se describe un dispositivo bioprinting 3-D de diseño personalizado en casa específicamente para construir el tejido de impresión 32 Como tales, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren testin.g por el usuario. Para mejorar las propiedades de extrusión, complementar no modificado HA y gelatina a las bioinks (1,5 mg / ml y 30 mg / ml, respectivamente). 3. Validación por Bioprinting con el hígado Las construcciones primarias Preparar 3-D esferoides hepáticos célula primaria en la horca métodos de caída como el componente celular 33 Nota: Bioprinting se puede realizar sin esferoides, pero en su lugar con las células individuales en suspensión en el bioinks de hidrogel también. Los esferoides se emplean aquí para acelerar las interacciones célula-célula y construir funcionalidad. El número de esferoides o células empleadas depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. Estos pasos deben realizarse en condiciones estériles, utilizando materiales esterilizados. Preparar HCM mediante la adición de los contenidos descongelados de la kit componente suplemento HCM a los medios de hepatocitos basal (HBM) y filtrado estéril. Descongelar la ONU componentes de suplementostil líquido. Añadir los componentes del suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albúmina de suero bovino [ácido graso libre], 10 ml; sulfato de gentamicina / anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemisuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crecimiento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; la transferencia, 0,5 ml) a la 500 ml HBM. Filtro estéril a través de un filtro de 0,45 micras micras o 0,22 usando una unidad de filtro sobre frascos, o un filtro de punta de la jeringa. Determinar la densidad celular de hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas por recuento en un hemocitómetro después de cada tipo de célula se ha descongelado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Combinar los hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas en una relación de 80:10:10 por el número de células en medios de HCM que ha sido calentado a 37 ° C en un tubo cónico. Nota: El volumen de los medios de comunicación a utilizar depende de la cantidad total de la célula específicos de la aplicación y debe ser determinado por THe usuario. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 520 xg, a 20 ° C. Aspirar el sobrenadante, dejando atrás el sedimento celular. Resuspender el sedimento celular en medios de HCM para producir una suspensión de células que contiene 1.000 células por 40 medios mu l. Volumen total depende de que se produce el número de esferoides. Transferir la suspensión celular a placas de gota formato colgantes 96 pocillos. Añadir un total de aproximadamente 1000 células a cada pocillo en la MCH y mantener a 37 ° C, en 5% de CO 2 durante 3 días durante los cuales forman esferoides multicelulares. Recoger esferoides hepáticas de la placa de gota colgante utilizando una pipeta. Transferir a un tubo cónico estéril de 15 ml. esferoides hepáticos Bioprint en bioink hidrogel específico de hígado Preparar una formulación de hígado que contiene ECM-bioink hidrogel como se describe en el paso 1, el empleo de 8% PEGDA y 8% de 8 brazos que PEG alquino como reticulantes. Utilice esta combinación de su capacidad en resulting en un hidrogel cierre en el módulo de elasticidad de cizallamiento al tejido del hígado nativo. Deje que los esferoides se depositan en el fondo del tubo cónico en el que fueron colocados en el paso 3.1.7. Esto varía según el tamaño y la densidad de esferoides, pero ocurre generalmente dentro de 1-2 min. Retire todos los medios por aspiración con cuidado, o con una pipeta. Transferir el volumen deseado de solución de hidrogel bioink recién preparada al tubo cónico que contiene los esferoides. En general, un volumen apropiado es 10% -25% mayor que el volumen de la construcción de 3-D para ser impreso. cuidadoso pipeteado arriba y hacia abajo para volver a suspender los esferoides en la solución de hidrogel bioink. Transferencia a un cartucho bioprinter utilizando una pipeta o pipeta serológica. En el interior del cartucho de bioprinter, permita que la solución de someterse a la primera etapa de reticulación (reacción de tiol-acrilato) durante 30 min. Nota: Dependiendo del tamaño del esferoide, el cartucho puede ser necesario girar lentamente o puede necesitar ser mezclado con el contenidouna espátula estéril para mantener los esferoides distribuidos por todo el bioink durante la reticulación etapa 1. Esto es menos de una necesidad para bioinks preparados con células suspendidas en lugar de esferoides. Nota: Después de la etapa 1 de reticulación, los usuarios tienen una ventana de funcionamiento de varias horas. Sin embargo, se recomienda realizar el proceso de bioprinting rápidamente para mejorar la viabilidad celular. Después de la etapa 1 de reticulación, utilice un dispositivo bioprinting para crear estructuras de hidrogel deseados que contienen los esferoides hepáticos primarios (u otras células). Nota: Esta tecnología proporciona un sistema para biofabricating una amplia variedad de estructuras. Los parámetros tales como el volumen total, el número de células o esferoides, la geometría de la estructura impresa, y el sustrato sobre el que se imprimen los constructos dependen de los objetivos de la usuario altamente. Después de la deposición en la configuración deseada, administrar la luz UV durante 2-4 segundos para iniciar el mecanismo de reticulación secundaria, la estabilización de la constructs y el aumento de la rigidez a nivel deseado. Nota: La concentración de PEG-alquino, y por lo tanto la densidad de reticulación final global, controla principalmente la rigidez construcción final. Repetir el 3.2.4 pasos y 3.2.5 con el fin de crear construcciones de varias capas.

Representative Results

Cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen correctamente, los hidrogeles deben contener un perfil bioquímico específico para el tipo de tejido diana, 20 permiten un alto grado de control sobre bioprinting y módulo elástico final, 34 y apoyar células funcionales viables en construcciones de tejido. Personalización de hidrogel Para mejor hígado nativo mímica,…

Discussion

Hay varios componentes que son críticos a considerar cuando se trata de construcciones de tejido biofabricate 3-D, para su posible uso en seres humanos o para aplicaciones de detección in vitro. El empleo de los componentes celulares apropiadas determina la funcionalidad potencial final, mientras que el dispositivo Biofabrication sí determina la metodología general para llegar al constructo final. El tercer componente, el biomaterial, es igualmente importante, ya que sirve el doble papel. Específicamente, …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen la financiación de la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DTRA) bajo Espacio y Sistemas de Guerra Naval Pacific Center (SSC Pacífico) Contrato No. N6601-13-C-2027. La publicación de este material no implica la aprobación por parte del gobierno de los resultados o las conclusiones de este documento.

Materials

Hyaluronic acid Sigma 53747
Gelatin Sigma G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma 410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) ESI-BIO GS315 Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa Creative PEGWorks PSB-887
Primary human hepatocytes Triangle Research Labs HUCPM6
Primary human liver stellate cells ScienCell 5300
Primary human Kupffer cells Life Technologies HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM) Lonza CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit Lonza CC-3198 HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)
Triton X-100 Sigma T9284 Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide Fischer Scientific A669 Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue n/a n/a
Lyophilizer any n/a
Freezer mill any n/a
Bioprinter n/a n/a The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate InSphero CS-06-001 InSphero GravityPlus 3D Culture Platform

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Skardal, A., Devarasetty, M., Kang, H., Seol, Y., Forsythe, S. D., Bishop, C., Shupe, T., Soker, S., Atala, A. Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink. J. Vis. Exp. (110), e53606, doi:10.3791/53606 (2016).

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