Method Article

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

DOI:

10.3791/53606

⸱

April 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest Univeristy Health Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un conjunto de protocolos que en conjunto proporcionan un bioink hidrogel imitando tejido con el que construcciones de tejido 3-D funcionales y viables se pueden bioprinted para su uso en aplicaciones de cribado in vitro.

Abstract

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Bioprinting ha surgido como un enfoque de biofabricación versátil para crear construcciones de órganos de ingeniería tisular. Estos constructos tienen un uso potencial como reemplazos de órganos para la implantación en pacientes, y también, cuando se crean en una escala de tamaño más pequeña como "organoides" modelo que se pueden usar en sistemas in vitro para el cribado de drogas y toxicología.

A pesar del desarrollo de una amplia variedad de dispositivos de bioimpresión, la aplicación de la tecnología de bioimpresión puede verse limitada por la disponibilidad de materiales que agilizan los procedimientos de bioimpresión y apoyan la viabilidad y función celular al proporcionar pistas específicas de tejido. Aquí describimos un versátil sistema de hidrogel a base de ácido hialurónico (HA) y gelatina compuesto por un protocolo de reticulación multi-reticulante de 2 etapas, que puede proporcionar señales bioquímicas específicas de los tejidos e imitar las propiedades mecánicas de los tejidos in vivo.

Los factores bioquímicos se proporcionan mediante la incorporación de materiales de matriz extracelular derivados de tejidos, que incluyen potentes factores de crecimiento. Las propiedades mecánicas de los tejidos son combinaciones controladas de reticulantes basados en PEG con diferentes pesos moleculares, geometrías (lineales o multibrazo) y grupos funcionales para producir biotintas extruibles y valores finales de rigidez al cizallamiento de construcción en un amplio rango (100 Pa a 20 kPa). Utilizando estos parámetros, se utilizaron biotintas de hidrogel para bioimprimir esferoides hepáticos primarios en una biotinta específica para el hígado con el fin de crear construcciones hepáticas in vitro con alta viabilidad celular y una producción funcional medible de albúmina y urea. Esta metodología proporciona un marco general que se puede adaptar para la personalización futura de hidrogeles para la biofabricación de una amplia gama de tipos de construcción de tejidos.

Introduction

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En los últimos años, una variedad de tecnologías se han convertido en disponibles que aborda la necesidad de fuentes alternativas de órganos y tejidos funcionales mediante la búsqueda de fabricar, o biofabricate, ellos. Bioprinting ha surgido como uno de los más prometedores de estas tecnologías. Bioprinting se puede considerar como una forma de fabricación aditiva robótico de partes biológicas, que se puede utilizar para construir o modelo viable estructuras de órganos similares o similar a un tejido en 3 dimensiones. 1 En la mayoría de los casos, bioprinting emplea un 3 dimensiones (3 -D) dispositivo de impresión que está dirigido por un ordenador para depositar las células y biomateriales en posiciones precisas, recapitulando lo tanto anatómica que imitan arquitecturas fisiológicas. 2 Estos dispositivos de impresión de un "bioink", que puede tomar la forma de agregados de células, las células encapsuladas en hidrogeles o fluidos viscosos, o microportadores sembrado de células, así como polímeros libres de células que proporcionan estructura mecánica o actuar como pla libre de células3,4. ceholders Siguiendo el proceso bioprinting, la estructura resultante puede ser madurados en las estructuras de tejidos u órganos funcionales, y se utilizan para su aplicación final previsto. 5,6 Hasta la fecha, un órgano de tamaño humano completamente funcional completa no se ha impreso, pero sigue siendo el principal objetivo a largo plazo de bioprinting investigación y desarrollo. 2 sin embargo, a pequeña escala "organoides" construcciones de tejido actualmente están siendo implementados en una serie de aplicaciones, incluyendo el modelado patología, desarrollo de fármacos, y la investigación de la toxicología.

Uno de los principales obstáculos que los investigadores han encontrado en la aplicación de tecnología bioprinting es que muy pocos materiales han sido desarrollados con el propósito explícito de bioprinting. Para tener éxito con eficacia en bioprinting, un biomaterial debe cumplir 4 requisitos básicos. El biomaterial debe tener 1) las propiedades mecánicas adecuadas para permitir la deposición (sea extrusión a través de una boquilla como un gel o un inkjet como una gota), 2) la capacidad para mantener su forma como un componente de una estructura 3-D después de la deposición, 3) la capacidad de control de los usuarios de las 2 características anteriores, y 4) el medio ambiente amistoso y de apoyo una célula en absoluto fases del procedimiento. bioprinting 7 Históricamente, el trabajo bioprinting menudo ha tratado de emplear biomateriales tradicionales existentes en dispositivos bioprinting sin tener en cuenta su compatibilidad, en lugar de diseñar un biomaterial que tienen las propiedades necesarias para bioprinting y aplicaciones de post-impresión posteriores.

Una variedad de bioinks se han desarrollado recientemente para mejor interfaz con el hardware de deposición y fabricación. sistemas de hidrogel estándar plantean problemas significativos debido a que generalmente existen como sea precursor de soluciones de fluidos con propiedades mecánicas insuficientes, o hidrogeles polimerizados que si imprimen pueden obstruir las boquillas o se rompan suba sobre el proceso de extrusión. Nuestro equipo, así como otheRS, han explorado diversas formulaciones de hidrogel para hacer frente a estos problemas bioprinting, incluyendo la impresión de esferoides de células en sustratos de hidrogel, 5,8 celular y el filamento de hidrogel de extrusión de tubos microcapillary, 9-11 extruibles ácido hialurónico (HA) hidrogeles de nanopartículas con propiedades de reticulación -Gold dinámicos , 12 de control temporal de la rigidez de hidrogel utilizando fotopolimerizable metacrilado HA y gelatina, 13 de reticulación basado en fibrinógeno-trombina, 14,15 geles de alginato-colágeno de intercambio iónico, 16 y recientemente rápida polimerización de luz ultravioleta (UV) de reticulación -initiated, 17

Estos ejemplos demuestran la viabilidad de los materiales de generación que puede ser bioprinted eficacia. Sin embargo, además de la integración con el hardware, para generar con éxito construcciones de tejido viable y funcional 3-D, los biomateriales deben contener señales bioquímicas y mecánicas que ayuda en el mantenimiento celularviabilidad y función. Estos factores adicionales, perfiles bioquímicos y mecánicos, pueden tener una influencia significativa en la función exitosa de construcciones de tejido bioprinted.

Tanto las células y la matriz extracelular nativa (ECM) son responsables de presentar una amplia gama de moléculas de señalización, tales como factores de crecimiento y otras citoquinas a otras células. La combinación de estas señales varía de un tejido a otro, pero puede ser extremadamente potente e influyente en la regulación del comportamiento de células y tejidos. 18 El empleo de componentes de ECM específicos de tejido de diferentes órganos y la aplicación como un hidrogel o como parte de un hidrogel ha sido explorado con éxito. 19-21 Este enfoque, que se compone de decellularizing un tejido dado, pulverizando, y disolviéndolo, se puede utilizar para producir señales bioquímicas específicas de tejido de cualquier tejido y pueden incorporarse en construcciones de hidrogel 3-D. 22

Adicionalmente,es ampliamente documentado que los tejidos del cuerpo ocupan una amplia gama de rigideces. 23 Como tal, la capacidad de sintonizar las propiedades mecánicas de los biomateriales, tales como el módulo de elasticidad E 'o cizallamiento módulo elástico G', es una herramienta útil en la ingeniería de tejidos . Como se describió anteriormente, el control sobre las propiedades mecánicas bioink permite Biofabrication basado en extrusión usando un gel suave, que puede entonces manipulado adicionalmente por reticulación secundaria en un momento posterior, en la que los niveles de módulo de elasticidad se pueden lograr que coincide con la del tipo de órgano diana. Por ejemplo, los biomateriales se pueden personalizar para que coincida con una rigidez de 5 a 10 kPa como un hígado nativo, 23 o que coincida con una rigidez de 10 a 15 kPa como tejido cardíaco nativo, 24,25, en teoría, el aumento de la capacidad de estos organoides para funcionar en de manera similar a sus contrapartes tejido nativo. La influencia de la rigidez del medio ambiente en el fenotipo celular se ha explored en los últimos años, en particular con respecto a las células madre. Engler et al. Demostraron que la elasticidad de sustrato con la ayuda en la conducción de las células madre mesenquimales (MSC) hacia linajes con la elasticidad del tejido equivalente a la de sustrato. 25 Este concepto ha sido explorado adicionalmente para la diferenciación en músculo, la función cardíaca, el fenotipo del hígado, la proliferación de células madre hematopoyéticas , y el mantenimiento de células madre potencial terapéutico. 24,26-29 ser capaz de sintonizar un hidrogel a diferentes módulos de elasticidad es una característica importante de un biomaterial que se utiliza para biofabricate construcciones de tejido. 30

Aquí se describe un protocolo que representa un enfoque versátil que se utiliza en nuestro laboratorio para formular un sistema de hidrogel que se puede extrusión bioprinted, y personalizar para 1) contener el perfil bioquímico de un tipo de tejido particular, y 2) imitan el módulo elástico de ese tipo de tejido . Al abordar estos requisitos, nuestro objetivo es provide un material que puede recapitular las características fisicoquímicas y biológicas de in vivo de tejidos. 31 El sistema compuesto de hidrogel modular descrito en el presente documento se aprovecha de un enfoque de reticulación múltiples para producir bioinks extruibles, y permite una reticulación secundaria para estabilizar y aumenta la rigidez de la productos finales para que coincida con una gama de tipos de tejidos. personalización bioquímica se cumple mediante el uso de componentes de ECM específicos de tejido. Como demostración, empleamos una variedad específica del hígado de este sistema de hidrogel de Bioprint hígado funcional construcciones organoides. El protocolo descrito utiliza un dispositivo bioprinting 3-D personalizado. En general, este protocolo se puede adaptar a la mayoría de las impresoras de base de extrusión, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren pruebas por el usuario.

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Protocol

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1. hidrogel Bioink Formulaciones y Preparación

  1. Con el fin de proporcionar perfiles bioquímicos específicos de tejido, específico de tejido preparar ECM digerir soluciones como se describió anteriormente para el hígado. 20
    Nota: En general, esta ECM digest comprenderá 40% del volumen bioink hidrogel final que se emplea. Varios cientos de mililitros de solución de ECM digesto se pueden preparar, alícuotas, y se congelaron a -80 ° C para uso futuro.
  2. Antes de hidrogel formulación, disolver un fotoiniciador, 2-hidroxi-4 '- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, en agua a 0,1% w / v.
    Nota: Los volúmenes en el rango de 50-100 ml se pueden preparar con antelación y se almacena protegida de la luz a 4 ° C durante varios meses.
  3. Para formar bioinks de hidrogel, primero disolver los componentes de material de base de los kits de hidrogel de ácido hialurónico (HA) en la solución de fotoiniciador agua.
    1. Disolver la gelatina tiolada HA y tiolada por separado en agua-photoinitiator solución (paso 1.2) para hacer 2% w / v soluciones.
    2. Disolver diacrilato de polietilenglicol (PEGDA), el agente de reticulación en los kits de hidrogel, en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución.
    3. Disolver polietilenglicol (PEG) alquino 8-brazo (10 kDa MW) en solución de fotoiniciador agua (paso 1.2) para hacer un 8% w v / solución.
  4. En general, formar hidrogeles utilizando el siguiente esquema, aunque personalización adicional es posible.
    1. Combinar 4 partes 2% tiolado HA, 4 partes 2% de gelatina tiolada, 1 parte reticulador 1, 1 parte reticulante 2 con 8 partes de solución de ECM tejido y 2 partes de medios de cultivo de hepatocitos (HCM) (o 10 partes de agua como un no-tejido genérico hidrogel específicos de).
      Nota: adicional HA no modificado o gelatina se pueden añadir para que la extrusión bioink más suavemente. Esto se describe a continuación.
  5. Agite la mezcla resultante en alta (velocidad 10 de 10) durante 10 segundos para mezclar antes de su uso.
  6. El uso de hidrogel bioink
    1. Para la extrusión o ensayo bioprinting, transferir la mezcla en un cartucho de jeringa o una impresora y deje que se reticulan espontáneamente durante 30 minutos (etapa 1 reticulación) a 37 ° C.
    2. Para las mediciones reológicas, transferir la mezcla en una placa de Petri de 35 mm y dejarla para reticular durante 30 minutos.
      Nota: La mezcla comienza inmediatamente para reticular a través de la formación del enlace tiol-acrilato y comenzará a aumentar la viscosidad. La mezcla debe ser transferida a una jeringa, cartucho de impresión, o ubicación de destino dentro de los 10 min para evitar la obstrucción de una pipeta o una jeringa durante la transferencia.
    3. Cuando se desea reticulación secundaria (etapa 2), irradiar la etapa geles 1-reticulados con luz ultravioleta (365 nm, 18 W / cm 2) para iniciar una reacción de polimerización tiol-alquino.
      Nota: La duración de la irradiación depende de la superficie del material. En general, un centímetro cuadrado de material sólo requiere 1-2 seg de la exposición UV en este poder UV.

2. Pruebas de compatibilidad de la impresora

  1. Antes de las pruebas de integración con dispositivos bioprinting, las características de extrusión de ensayo sobre la mesa de laboratorio con ensayos de extrusión simples usando jeringas estándar y puntas de las agujas de calibre pequeño (20-30 gauge).
    1. Empuje la bioink a través de una jeringa estándar para lograr filamentos extruidos sin problemas de hidrogel con pocos o sin baches. Extrusión de líneas o patrones simples es suficiente para determinar el éxito.
  2. Para la integración bioprinter, cargar bioink preparados con la pipeta ellos en cartuchos de impresora, y permitir 30 minutos para el bioink a someterse espontánea etapa 1 reticulación dentro del cartucho.
    Nota: El volumen de bioink depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. cartuchos de impresora pueden parecerse o ser jeringas que son compatibles con el dispositivo bioprinter.
  3. Evaluar la compatibilidad de extrusiónpara bioprinting mediante la impresión de un patrón simple usando el bioink. Por ejemplo, imprimir un patrón de 7 x 7 mm compuesto por líneas paralelas. Aplicar presión (por ejemplo, 20 kPa de presión neumática), mientras que el cabezal de impresión se mueve en el plano XY a una velocidad de aproximadamente 300 mm / min.
    Nota: diámetros de boquilla del cabezal de impresión de diferentes tamaños se pueden utilizar, pero boquillas cónicas con aberturas de 400 a 500 m de diámetro son óptimas para la impresión de esferoides en el rango de 250 a 350 micras.
    1. Si los materiales extruidos son desiguales o irregulares, consulte el paso 2.4, o reducir la cantidad de PEGDA para ablandar el material reticulado etapa 1. formulaciones bioink preparados adecuadamente extruir sin problemas, lo que permite la deposición precisa de los patrones o arquitecturas deseados.
      Nota: Los procedimientos bioprinting uso se describe un dispositivo bioprinting 3-D de diseño personalizado en casa específicamente para construir el tejido de impresión 32 Como tales, los parámetros de impresión específicas varían dramáticamente para cada tipo de dispositivo y requieren testin.g por el usuario.
  4. Para mejorar las propiedades de extrusión, complementar no modificado HA y gelatina a las bioinks (1,5 mg / ml y 30 mg / ml, respectivamente).

3. Validación por Bioprinting con el hígado Las construcciones primarias

  1. Preparar 3-D esferoides hepáticos célula primaria en la horca métodos de caída como el componente celular 33
    Nota: Bioprinting se puede realizar sin esferoides, pero en su lugar con las células individuales en suspensión en el bioinks de hidrogel también. Los esferoides se emplean aquí para acelerar las interacciones célula-célula y construir funcionalidad. El número de esferoides o células empleadas depende de la aplicación específica y debe ser determinado por el usuario. Estos pasos deben realizarse en condiciones estériles, utilizando materiales esterilizados.
    1. Preparar HCM mediante la adición de los contenidos descongelados de la kit componente suplemento HCM a los medios de hepatocitos basal (HBM) y filtrado estéril.
      1. Descongelar la ONU componentes de suplementostil líquido.
      2. Añadir los componentes del suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albúmina de suero bovino [ácido graso libre], 10 ml; sulfato de gentamicina / anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemisuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crecimiento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; la transferencia, 0,5 ml) a la 500 ml HBM.
      3. Filtro estéril a través de un filtro de 0,45 micras micras o 0,22 usando una unidad de filtro sobre frascos, o un filtro de punta de la jeringa.
    2. Determinar la densidad celular de hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas por recuento en un hemocitómetro después de cada tipo de célula se ha descongelado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Combinar los hepatocitos primarios humanos, células de Kupffer, y células estrelladas en una relación de 80:10:10 por el número de células en medios de HCM que ha sido calentado a 37 ° C en un tubo cónico.
      Nota: El volumen de los medios de comunicación a utilizar depende de la cantidad total de la célula específicos de la aplicación y debe ser determinado por THe usuario.
    4. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 520 xg, a 20 ° C.
    5. Aspirar el sobrenadante, dejando atrás el sedimento celular.
    6. Resuspender el sedimento celular en medios de HCM para producir una suspensión de células que contiene 1.000 células por 40 medios mu l. Volumen total depende de que se produce el número de esferoides.
    7. Transferir la suspensión celular a placas de gota formato colgantes 96 pocillos. Añadir un total de aproximadamente 1000 células a cada pocillo en la MCH y mantener a 37 ° C, en 5% de CO 2 durante 3 días durante los cuales forman esferoides multicelulares.
    8. Recoger esferoides hepáticas de la placa de gota colgante utilizando una pipeta. Transferir a un tubo cónico estéril de 15 ml.
  2. esferoides hepáticos Bioprint en bioink hidrogel específico de hígado
    1. Preparar una formulación de hígado que contiene ECM-bioink hidrogel como se describe en el paso 1, el empleo de 8% PEGDA y 8% de 8 brazos que PEG alquino como reticulantes. Utilice esta combinación de su capacidad en resulting en un hidrogel cierre en el módulo de elasticidad de cizallamiento al tejido del hígado nativo.
    2. Deje que los esferoides se depositan en el fondo del tubo cónico en el que fueron colocados en el paso 3.1.7. Esto varía según el tamaño y la densidad de esferoides, pero ocurre generalmente dentro de 1-2 min. Retire todos los medios por aspiración con cuidado, o con una pipeta.
    3. Transferir el volumen deseado de solución de hidrogel bioink recién preparada al tubo cónico que contiene los esferoides. En general, un volumen apropiado es 10% -25% mayor que el volumen de la construcción de 3-D para ser impreso. cuidadoso pipeteado arriba y hacia abajo para volver a suspender los esferoides en la solución de hidrogel bioink. Transferencia a un cartucho bioprinter utilizando una pipeta o pipeta serológica.
    4. En el interior del cartucho de bioprinter, permita que la solución de someterse a la primera etapa de reticulación (reacción de tiol-acrilato) durante 30 min.
      Nota: Dependiendo del tamaño del esferoide, el cartucho puede ser necesario girar lentamente o puede necesitar ser mezclado con el contenidouna espátula estéril para mantener los esferoides distribuidos por todo el bioink durante la reticulación etapa 1. Esto es menos de una necesidad para bioinks preparados con células suspendidas en lugar de esferoides.
      Nota: Después de la etapa 1 de reticulación, los usuarios tienen una ventana de funcionamiento de varias horas. Sin embargo, se recomienda realizar el proceso de bioprinting rápidamente para mejorar la viabilidad celular.
    5. Después de la etapa 1 de reticulación, utilice un dispositivo bioprinting para crear estructuras de hidrogel deseados que contienen los esferoides hepáticos primarios (u otras células).
      Nota: Esta tecnología proporciona un sistema para biofabricating una amplia variedad de estructuras. Los parámetros tales como el volumen total, el número de células o esferoides, la geometría de la estructura impresa, y el sustrato sobre el que se imprimen los constructos dependen de los objetivos de la usuario altamente.
    6. Después de la deposición en la configuración deseada, administrar la luz UV durante 2-4 segundos para iniciar el mecanismo de reticulación secundaria, la estabilización de la constructs y el aumento de la rigidez a nivel deseado.
      Nota: La concentración de PEG-alquino, y por lo tanto la densidad de reticulación final global, controla principalmente la rigidez construcción final.
    7. Repetir el 3.2.4 pasos y 3.2.5 con el fin de crear construcciones de varias capas.

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Results

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Cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen correctamente, los hidrogeles deben contener un perfil bioquímico específico para el tipo de tejido diana, 20 permiten un alto grado de control sobre bioprinting y módulo elástico final, 34 y apoyar células funcionales viables en construcciones de tejido.

Personalización de hidrogel
Para mejor hígado nativo mímica, el bioink...

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Discussion

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Hay varios componentes que son críticos a considerar cuando se trata de construcciones de tejido biofabricate 3-D, para su posible uso en seres humanos o para aplicaciones de detección in vitro. El empleo de los componentes celulares apropiadas determina la funcionalidad potencial final, mientras que el dispositivo Biofabrication sí determina la metodología general para llegar al constructo final. El tercer componente, el biomaterial, es igualmente importante, ya que sirve el doble papel. Específicamente, el co...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen la financiación de la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DTRA) bajo Espacio y Sistemas de Guerra Naval Pacific Center (SSC Pacífico) Contrato No. N6601-13-C-2027. La publicación de este material no implica la aprobación por parte del gobierno de los resultados o las conclusiones de este documento.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ácido hialurónicoSigma53747
GelatinaSigmaG6144
2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenonaSigma410896
Kit de hidrogel de ácido hialurónico y gelatina (HyStem-HP)El kit ESI-BIOGS315contiene los componentes Heprasil (ácido hialurónico tiolado y heparinizado), Gelin-S (tiolado gelatina), y Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10  kDaCreative PEGWorksPSB-887
Hepatocitos humanos primariosTriangle Research LabsHUCPM6
Células estrelladas hepáticas humanas primariasScienCell5300
Células Kupffer humanas primariasLife TechnologiesHUKCCS Hepatocyte
Basal Media (HBM)LonzaCC-3199
Hepatocyte Media Kit de suplementosLonzaCC-3198HCM SingleQuot Kits (contiene ácido ascórbico, 0,5  Ml; albúmina sérica bovina [sin ácidos grasos], 10  Ml; sulfato de gentamicina/anfotericina B, 0,5 y nbsp; Ml; hidrocortisona 21-hemisuccinato, 0,5 y nbsp; Ml; insulina, 0,5 y nbsp; Ml; factor de crecimiento epidérmico recombinante humano, 0,5  Ml; transferencia, 0.5  ml)
Triton X-100SigmaT9284Otros fabricantes están bien.
Hidróxido de amonioFischer ScientificA669Otros fabricantes están bien.
Tejido fresco de cadáver porcinon/an/a
Liofilizadorcualquieran/a
Molino congeladorcualquieran/a
Bioprintern/an/aLa bioimpresora descrita en este documento fue construida internamente a medida. En general, otros dispositivos son adecuados siempre que admitan la impresión basada en extrusión controlada por computadora de materiales de hidrogel.
Placa de cultivo colganteInSpheroCS-06-001InSphero GravityPlus Plataforma de cultivo 3D

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