Summary
우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.
Introduction
최근, 다양한 기술이이를 제조 또는 biofabricate 모색하여 기능 기관 및 조직의 대체 소스에 대한 필요성을 해결이 가능하게되었다. Bioprinting는이 기술의 가장 유망한 중 하나로 떠오르고있다. Bioprinting은 3 차원 패턴 가능한 기관 형상 또는 조직과 같은 구조를 구축하거나 사용할 수있는 생물학적 부품 로봇 첨가제 제조의 형태로 생각 될 수있다. 대부분의 경우 1 bioprinting 3 (3 차원을 채용 -D)함으로써 recapitulating 정확한 위치로 세포 및 생체 물질을 증착하기 위해 컴퓨터에 의해 지시되는 인쇄 장치 생리 아키텍처 해부학을 흉내 낸.이 이러한 장치 세포 집합체의 형태를 취할 수있는 "bioink"를 인쇄 하이드로 캡슐화 세포 점성 유체, 또는 셀 시드 미세 전달체뿐만 아니라 무 세포 PLA 기계적 구조 또는 행위를 제공하는 무 세포 중합체ceholders. 3,4- bioprinting 처리 후는, 결과 구조는 기능적 조직 또는 기관 구조로 성숙하고 의도 된 최종 애플리케이션에 사용될 수있다. -5,6- 현재까지 완전한 완전히 기능 인간 크기 기관이 인쇄되지 않은, 하지만이 연구 개발 bioprinting의 주요 장기 목표가 남아있다. (2) 그러나, "organoid"티슈 구조물은 병리 모델링, 약물 개발 및 독성 검사를 포함하여 응용 프로그램으로 구현되는 소규모.
연구자 bioprinting 기술을 적용 발생한 주요 장애물 중 하나는 매우 적은 재료 bioprinting의 명시적인 목적으로 개발 된 것이있다. 효과적으로 bioprinting에서 성공하기 위해, 생체 재료 (4) 기본 요구 사항을 충족해야합니다. 바이오 물질이 증착을 허용하도록 1) 적절한 기계적 특성을 가질 필요가 (이것은 겔 또는 I와 같은 노즐을 통해 압출 될액적으로서 nkjet) 증착 후의 3 차원 구조의 구성 요소로 그 형상을 유지하기 위해, 2) 기능, 3)이 종래의 특성에 대한 사용자 제어 및 4) 셀 친절한 지원 환경에서 모든 기능 bioprinting 절차의 단계. 7 역사적으로, 작업을 bioprinting는 종종 대신 bioprinting 및 후속 후 인쇄 응용 프로그램에 필요한 특성을 가지고 생체 재료의 설계, 자신의 호환성을 고려하지 않고 bioprinting 장치에서 기존의 전통적인 생체 재료를 사용하기 위해 노력하고 있습니다.
bioinks의 다양한 증착 및 제조 하드웨어와 더 나은 인터페이스에 최근에 개발되었다. 그들은 일반적으로 어느 전구체로서 충분한 기계적 특성, 또는 경우 노즐을 막히게 할 수있는 인쇄 또는 압출 공정에 망가가 중합 하이드로 유체 솔루션이 존재하기 때문에 표준 겔 시스템은 심각한 문제를 제기. 우리 팀뿐만 아니라 인접로rs는 하이드로 겔 기판에 세포 회전 타원체 인쇄, 마이크로 캐 필러 튜브에서 5,8 세포와 하이드로 겔 필라멘트 압출, 동적 가교 특성을 가진 9-11 압출 히알루 론산 (HA) - 금 나노 입자 하이드로 겔을 포함하여 이러한 bioprinting 문제를 해결하기 위해 다양한 하이드로 겔 제형을 살펴 보았다 광중합을 사용하여 하이드로 겔 강도의 12 시간 제어, 17 HA 및 젤라틴, 13 피브리노겐 - 트롬빈 계 가교제, 14, 15의 이온 교환 알긴산 콜라겐 겔 (16) 메타 크릴 레이트 최근 급격한 중합 자외선 (UV) -initiated 가교
이러한 예는 효과적으로 bioprinted에 의해 수 생성 물질의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 하드웨어의 통합에 추가하여, 성공적 가능한 기능적 3-D 조직 구조를 생성하기 위해, 생체 물질은 세포 유지를 지원하는 생화학 적 및 기계적 신호를 포함해야생존과 기능. 이러한 추가 요인, 생화학 적 및 기계적 프로필, bioprinted 조직 구조의 성공적인 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
두 세포 및 원시 세포 외 기질 (ECM)는 이러한 성장 인자 및 다른 세포에 다른 사이토킨 신호 분자로서 폭넓게 제시 할 책임이있다. 이들 신호의 결합 조직의 조직에서 다르지만, 세포 및 조직의 행동을 조절하는 매우 강력한 영향력 수있다. (18) 탐색 된 다른 기관으로부터 조직 특이 ECM 부품을 채용하고, 하이드로 겔 또는 하이드로 겔의 일부로서 구현 성공. 19-21, 주어진 조직 decellularizing을 분쇄하고, 용해 구성되는이 방법, 임의의 조직으로부터 조직 - 특이 적 생화학 적 신호를 생성하기 위해 3-D 하이드로 겔 구조에 혼입 될 수있는 이용 될 수있다. (22)
또한,그것이 널리 체내 조직을 강성의 넓은 범위를 차지하는 것이 설명되어있다. 이와 같이 23 튜닝 능력 등 탄성률 E '또는 전단 탄성률 G'와 같은 생체 재료의 기계적 특성, 조직 공학에서 유용한 도구 . 전술 한 바와 같이, bioink 기계적 특성 제어 대상 기관 유형과 일치하는 다음 상기 탄성률 레벨이 달성 될 수있는 나중 지점에서 이차 가교에 의해 조작 할 수있는 연질 겔을 사용하여 압출 기반 biofabrication 허용한다. 예를 들어, 생체 재료는에서 작동하는이 organoids의 능력 증가, 이론 (24, 25)을, 네이티브 간처럼 23 ~ 10 kPa로의 강성을 일치 또는 기본 심장 조직처럼 10 ~ 15 kPa로의 강성에 맞게 사용자 정의 할 수 그 나라 티슈 대응 유사한 방식. 세포 표현형에 환경 강성의 영향은 특급있다특히 줄기 세포에 대하여, 최근 lored. 잉글 러 외는. 조직 탄성 기판의 그것과 일치하는 계통으로 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 구동에서 도움이 기판 탄성을 보였다. (25) 이러한 개념은 상기 근육으로 분화, 심장 기능, 간 표현형, 조혈 줄기 세포의 증식에 대한 탐구 한 및 줄기 세포 치료 가능성의 유지. 24,26-29 조정할 수있는 서로 다른 탄성률을 하이드로 겔은 조직 구조를 biofabricate 데 사용되는 생체 재료의 중요한 특징이다. (30)
여기에서는 압출 bioprinted 수있는 하이드로 겔 시스템을 공식화하기 위해 실험실에서 사용 다기능 방식을 나타내고, 특정의 조직 유형의 생화학 적 프로파일을 포함하고 2) 그 조직 유형의 탄성률을 모방) (1)에 정의 된 프로토콜을 설명 . 이러한 요구 사항을 해결함으로써, 우리는 페이지에 목표생체의 물리 화학적 및 생물학적 특성 요점을 되풀이 할 수있는 물질을 rovide 조직.도 31은 여기에 기술 된 모듈러 하이드로 복합 시스템은 압출의 bioinks을 수득 다중 가교 방식을 활용하고 안정화시키는 보조 가교 결합을 허용하고의 강성을 증가 최종 제품은 조직 유형의 범위와 일치한다. 생화학 커스터마이즈 조직 특이 ECM 성분을 사용하여 만족된다. 데모, 우리는 기능 간 organoid 구조를 bioprint이 하이드로 겔 시스템의 간 고유의 다양한 사용합니다. 기술 된 프로토콜은 사용자 3 차원 bioprinting 장치를 사용한다. 일반적으로,이 프로토콜은 대부분 압출 기반 프린터에 적용 할 수 있고, 특정 인쇄 파라미터는 장치의 각 유형에 대해 극적으로 변화하고, 사용자에 의해 검사를 필요로한다.
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Protocol
1. 하이드로 겔 Bioink 제형 및 준비
- 조직 특이 적 생화학 적 정보를 제공하기 이전에 상술 간 조직 특이 ECM 솔루션 다이제스트 준비하기 위해. 20
주 : 일반적으로, ECM 다이제스트 채용 최종 히드로 겔 bioink 용적의 40 %를 포함 할 것이다. ECM 다이제스트 솔루션의 수백 밀리리터가 준비 분주하고, 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다. - 광개시제, 2- 히드 록시 -4 '녹이고 하이드로 겔 제형에 앞서 - 0.1 %로 (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone 물하여 W / V.
주 : 50-100 ml의 범위에서 볼륨이 미리 제조 될 수 있고, 몇 달 동안 4 ℃에서 차광 저장된다. - bioinks 하이드로 겔을 형성하기 위해, 우선 수분 광개시제 용액에 히알루 론산 (HA) 하이드로 겔 키트에서 기재 성분을 용해.
- 물 페이지에 별도로 HA 티올과 티올 젤라틴을 녹여hotoinitiator 솔루션 (단계 1.2) w / v 용액 2 %를 확인합니다.
- 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)의 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 키트에 가교제를 용해.
- 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8 아암 알킨 (10 kDa의 MW)을 녹인다.
- 추가 사용자가 가능하지만 일반적으로 다음과 같은 방식을 사용하여 하이드로 겔을 형성한다.
- 일반이 아닌 조직으로 2 %는 HA를 티올 4 부, 4 부 2 % 티올 젤라틴, 1 부 가교제 1, 1 부 가교제 2 8 부 조직의 ECM 솔루션 2 부 간세포 배양 배지 (HCM) (10 부품 물을 결합 - 특정 하이드로 겔).
주 : 추가 변성 HA 또는 젤라틴보다 원활 bioink 돌출을 첨가 할 수있다. 이것은 후술한다.
- 일반이 아닌 조직으로 2 %는 HA를 티올 4 부, 4 부 2 % 티올 젤라틴, 1 부 가교제 1, 1 부 가교제 2 8 부 조직의 ECM 솔루션 2 부 간세포 배양 배지 (HCM) (10 부품 물을 결합 - 특정 하이드로 겔).
- 사용 전에 혼합 10 초 (10 명 중 속도 10) 고에 생성 된 혼합물을 소용돌이. </ 리>
- 하이드로 겔 bioink의 사용
- 압출 또는 bioprinting 테스트에 대한 주사기 또는 프린터 카트리지 내로 혼합물을 전송하고, 37 ° C에서 30 분 (1 단계 가교)에 대해 자발적으로 가교 할 수있다.
- 유변학 적 측정 들어 35mm 페트리 접시에 혼합물을 전송하고 30 분 동안 가교 결합 할 수있다.
참고 : 혼합물을 즉시 티올 - 아크릴 레이트 결합 형성을 통해 가교 시작하여 점도가 증가하기 시작합니다. 혼합물을 전송하는 동안 주사기 또는 피펫의 막힘을 방지하기 위해 10 분 내에 주사기 카트리지 또는 타겟 위치로 전송한다. - 이차 가교 (2 단계)가 요구되는 경우, 티올 알킨 중합 반응을 개시하는 단계를 자외선 (365 nm의, 18 W / cm 2) 1 가교 겔을 조사.
주 : 조사 시간은 물질의 표면적에 의존한다. 일반적으로 재료의 평방 센티미터는 1- 필요이 UV 전력에서 UV 노출이 초.
2. 프린터 호환성 테스트
- 표준 주사기와 작은 게이지 바늘 팁 (20 ~ 30 게이지)를 사용하여 간단한 압출 검사와 실험실 벤치에 bioprinting 장치, 테스트 압출 특성과의 통합 테스트에 앞서.
- 거의 또는 전혀 범프 하이드로 겔의 원활 압출 필라멘트를 달성하기 위해 표준 주사기를 통해 bioink을 누릅니다. 선이나 간단한 패턴으로 돌출하는 것은 성공을 결정하기에 충분하다.
- bioprinter 통합의 경우, 프린터 카트리지로 피펫 팅에 의해 준비를 bioink로드와 bioink 30 분 카트리지 내에서 자발적으로 1 단계 가교를받을 수 있습니다.
참고 bioink의 볼륨이 특정 어플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 프린터 카트리지는 유사하거나 bioprinter 장치와 호환되는 주사기 할 수있다. - 압출 호환성 평가bioink를 사용하여 간단한 패턴을 인쇄하여 bioprinting합니다. 예를 들어, 평행 한 라인으로 구성된 7 × 7mm 패턴을 출력한다. 압력 (예컨대, 20 kPa의 공기압)을 적용하는 동안 약 300mm / 분의 속도로 XY 평면에서의 헤드 이동한다.
다양한 크기의 프린트 헤드의 노즐 직경이 사용될 수 있지만, 400 ~ 500 μM 직경 개구부 원추형 노즐은 250-350 μm의 범위에서 회전 타원체 인쇄에 최적 참고.- 압출 재료가 울퉁불퉁하거나 불규칙한 경우 2.4 단계 참조하거나 1 단계 가교 물질을 부드럽게 PEGDA의 양을 줄일 수 있습니다. 제대로 준비 bioink 제형은 원하는 패턴 또는 구조의 정확한 증착을 가능하게 매끄럽게 돌출.
장치의 각 유형에 대해 극적으로 같은 특정 인쇄 매개 변수로서 32 설명 사용 bioprinting 절차를 구체적으로 인쇄를 구성하는 조직을 위해 집에서 디자인 된 사용자 지정 3 차원 bioprinting 장치를 다양하고 testin 필요합니다. 참고사용자가 g.
- 압출 재료가 울퉁불퉁하거나 불규칙한 경우 2.4 단계 참조하거나 1 단계 가교 물질을 부드럽게 PEGDA의 양을 줄일 수 있습니다. 제대로 준비 bioink 제형은 원하는 패턴 또는 구조의 정확한 증착을 가능하게 매끄럽게 돌출.
- 압출 특성을 개선 bioinks에 수정되지 않은 HA 및 젤라틴을 보충하기 위해 (1.5 ㎎ / ㎖, 30 ㎎ / ㎖, 각각).
주 간를 구축과 Bioprinting 3. 검증
- 세포 구성 요소 (33)로 드롭 방법을 매달아 3-D 일차 전지 간 타원체를 준비
참고 Bioprinting도 하이드로 겔 bioinks 현탁 개별 세포 타원체없이 수행 대신 할 수있다. 타원체가 세포 - 세포 상호 작용을 가속 기능을 구성하기 위해 여기에서 사용된다. 사용 타원체 또는 셀의 수는 특정 애플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 이러한 단계는 멸균 물품을 사용하여 멸균 조건 하에서 수행되어야한다.- 간세포의 기저 미디어 (HBM) 및 멸균 필터링에 HCM 보충 구성 요소 키트의 해동 내용을 추가하여 HCM을 준비합니다.
- 보충 구성 요소 유엔를 해동액체 참깨.
- 황산 젠타 마이신 / 암포 테리 신 B, 0.5 ㎖;, 하이드로 코르티손 21- 헤 미숙시 네이트, 0.5 ml의 인슐린 0.5 ㎖; 10 ㎖, 소 혈청 알부민 [지방산 무료] 0.5 mL를 보충 성분 (아스코르브 산을 추가 인간 재조합 표피 성장 인자 0.5 ㎖를 상기 용액 (500)에 HBM), 0.5 ml의 전사.
- 병 탑 필터 유닛 또는 주사기 팁 필터를 사용하여 0.45 ㎛의 0.22 ㎛의 필터를 통해 멸균 필터.
- 각각의 세포 유형은 제조업 자의 지시에 따라 해동 후 혈구 계산에 의해 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포의 세포 밀도를 결정한다.
- 원추형 튜브에서 37 ° C로 가온 한 HCM 배지에서 세포 수에 의해 80:10:10의 비율로 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포 수확기.
주 : 사용되는 매체의 용적이 전체 세포 수에 대한 애플리케이션 특정 달려 번째 의해 결정되어야E 사용. - 20 ℃에서 520 × g으로 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 세포 펠렛을 남기고 상층 액을 흡인.
- 40 ㎕의 배지 당 1,000 세포를 포함하는 세포 현탁액을 수득 HCM 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 타원체의 수는 생산되는에 전체 볼륨이 달려있다.
- 96 웰 형식 매달려 드롭 판에 세포 현탁액을 전송합니다. 다세포 스페 로이드가 형성되는 과정을 3 일 동안 5 % CO 2에서, HCM의 각 웰에 약 1,000 세포의 총 첨가하고 37 ℃에서 유지한다.
- 피펫을 사용하여 매달려 드롭 판에서 간 회전 타원체를 수집합니다. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 전송합니다.
- 간세포의 기저 미디어 (HBM) 및 멸균 필터링에 HCM 보충 구성 요소 키트의 해동 내용을 추가하여 HCM을 준비합니다.
- 간 특정 하이드로 겔 bioink에 Bioprint 간 타원체
- 가교제로서 PEGDA 8 % 8 % 8 아암 PEG의 알킨을 이용하는 단계 1과 간 ECM 함유 하이드로 겔 bioink의 제형을 준비한다. resu에서의 기능이 조합을 사용하여기본 간 조직에 전단 탄성 계수에 가까운 하이드로 겔에 lting.
- 타원체들이 단계 3.1.7에 넣고있는 원추형 튜브의 바닥에 정착하자. 이것은 구형의 크기 및 밀도에 기초하지만, 일반적으로 1 ~ 2 분 이내에 발생 달라진다. 주의 깊게 흡입에 의해 또는 피펫 모든 용지를 제거합니다.
- 타원체를 함유하는 원뿔형 튜브에 새로 제조 된 하이드로 겔 bioink 용액을 원하는 부피로 이동. 일반적으로, 적절한 양의 10 %를 인쇄 할 수있는 3 차원 구조체의 체적에 비해 -25 % 크다. 조심스럽게 하이드로 겔 bioink 용액에 회전 타원체를 재현 탁 아래로 피펫합니다. 피펫 또는 혈청 학적 피펫을 사용하여 bioprinter 카트리지에 전송합니다.
- bioprinter 카트리지 내부의 용액을 30 분 동안 최초의 가교 단계 (티올 레이트 화 반응)을 겪게 할 수있다.
주 : 구형의 크기에 따라 카트리지가 느리게 회전 될 필요가있다거나 내용물을 혼합 할 필요가있다멸균 주걱 1 단계 가교 동안 bioink에 걸쳐 분산 회전 타원체를 유지합니다. 이 일시 중단 된 세포 대신 회전 타원체 준비 bioinks에 대한 필요성 이하이다.
주의 : 단계 1의 가교 후, 사용자는 몇 시간 동안의 동작 윈도우를 갖는다. 그러나, 세포 생존을 향상시키기 위해 신속 bioprinting 처리를 행하는 것을 추천합니다. - 단 하나의 가교 후, 주 간 타원체 (또는 다른 세포)를 함유하는 하이드로 겔, 원하는 구조를 생성하기 위해 bioprinting 장치를 사용한다.
주 :이 기술은 구조물의 다양한 biofabricating위한 시스템을 제공한다. 구조가 인쇄되는 이러한 전체 부피, 세포 또는 타원체 인쇄 된 구조 형상의 수, 기판 등의 파라미터는 사용자의 목적에 따라 크게 좌우된다. - 원하는 구성으로 증착 한 후, 공동 안정화 보조 가교 결합 메카니즘을 개시 2-4 초 동안 UV 광을 관리원하는 수준으로 nstructs 및 증가 강성.
주 : PEG-알킨의 농도, 따라서 전체적인 최종 가교 밀도는 주로 최종 구조체의 강성을 제어한다. - 다층 구조물을 생성하기 위하여 단계 3.2.4 및 3.2.5을 반복한다.
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Representative Results
전술 한 과정이 올바르게 준수 할 때 하이드로 겔은 표적 조직 유형 특정 생화학 적 프로파일을 포함한다 (20) bioprinting 최종 탄성률 (34)을 통해 고도의 제어를 허용 및 조직 구조물은 가능한 기능 셀을 지원한다.
히드로 겔 지정
가장 모방 네이티브간에, 하이드로 겔 bioink이 간 ECM 솔루션과 성장 인자 어레이에 의해 보충하고, 20 ECM 솔루션 (PG / ㎖,도 1a에 도시 됨) 성장 인자 및 사이토 카인의 다양한 포함한다. 이들은 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF), bFGF를, 뼈 형태 형성 단백질 5 (BMP-5), FGF-4, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP-2), TGF-β의 B1, BMP-7, EGF를 포함 , FGF-7, 성장 호르몬 (GH), 헤파린 결합 성 EGF 형 증식 인자 (HB-EGF), HGF 및 Neurotrophin 3 (NT-3). 또한, ECM 솔루션은 비색 분석에 의해 분석되는 추가 구성 요소가 포함되어 있습니다. 20 간 ECM 솔루션의 경우, 간 ECM 솔루션의 총 콜라겐 함량이 있었다 91.33 ± 0.58 ㎎ / ㎖, 엘라스틴 내용이었다 189.33 ± 48.40 ㎎ / ㎖하고, 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG) 함량은 86.00 ± 53.45 ㎎ / ㎖ (그림 1B)이었다.
하이드로 겔은, 자연 1 단계 티올 - 아크릴 레이트 화학은 중성 pH에서 발생 할 수 있도록함으로써 기계적 성질이 전단 응력 스윕 테스트 레오 미터에 (0.6-10 아빠, 발진 주파수 1 Hz에서). 10,12,13,34을 사용하는 것을 특징으로 할 수있다 bioink 113.66 ± 22.59 Pa의 G '부드러운 겔이 형성된다. 자외선 광중합에 의한 2 단계 티올 - 알킨 가교 개시 후, 약 10 kPa의 (10,637 ± 113.83 아빠, Figu에 G '증가1C 재), 간 조직의 탄력성을 흉내 낸. 농도, 분자량 및 가교 결합제의 형상의 추가 조작은 2 단계 G '값의 넓은 범위를 달성 할 수있다. (34)
bioprinted 하이드로 겔의 품질
화학 전략 및 하이드로 겔 bioinks의 1 단계 및 2 단계 가교의 구현이도 2에 기재되어있다. 일반적으로, 아크릴화 PEG 중합체를 기반으로 같은 Extralink 같은 가교제가 자발적으로 중성의 HA에 티올기를 젤라틴 사슬과 반응 세포의 존재의 pH (스테이지 1) 소프트 압출 하이드로 겔을 형성한다. 이 소프트 겔은 UV 광 알킨 변성 PEG 중합체에 기초한 반응 티올 및 보조 가교제의 광중합을 개시하는 데 사용 된 후 bioink로 bioprinted 수있다. 가교제의 특정 분자량 및 형상 갈베른 bioprinted 구조의 최종 강도. 7 × 7mm 패턴은 테스트 목적으로 (그림 3A) 구현 하였다. 초기 테스트는 초기 제제는 압출 것으로 나타났다하지만,시 및 압출 (그림 3B) 후 불규칙한 응집되어 나타났다. 압출 특성을 개선하기 위해 수정되지 않은 HA 및 젤라틴은 bioinks (1.5 ㎎ / ㎖, 30 ㎎ / ㎖)을 첨가 하였다. 개선 된 부드러운 인쇄 구조는 그림 3C에 표시됩니다.
생존과 bioprinted 주 인간의 간 구조의 기본 기능
생체 활성 간 특정 하이드로 겔은 bioink 캡슐화 이전에 플라스틱 커버 슬립 위에 드롭 배양 달아 제조 한 일차 인간 간 스페 로이드를 증착하는데 사용 된 bioprinter 3-D를 사용. 세포 배양 환경의 다양한 강력한 처리 및 전송을 허용 플라스틱 커버 슬립에 인쇄된다. bioprinting 후, 안녕하세요간 구조물은 GH 세포 생존율은 LIVE / DEAD 생존력 / 세포 독성 및 염색 초점 현미경 (도 4a) 후에 관찰 하였다. 최적의 환경 조건에서 생존 능력은 85 % 이상이어야합니다. 기본 인간의 간세포는 일반적으로 환경 변수의 몇 가지 최적화를 요구 기계적 및 화학적 스트레스에 민감 간주됩니다.
bioprinting과 생존의 확인에 따라, 문화에 배치되는 추가 간 구조가 분비 요소 및 알부민의 분석을위한 3 일, 7 일, 10 일 및 14 일에 제거 미디어 분취 액을 분석하여 기능을 평가할 수있다. 우레아 비색 분석은 15 ng를 20 / ㎖ (도 4B) 사이에 남아있는, 14 일 시간 과정을 통해 간에서 구조 요소 분비의 비교적 일관된 레벨을 보여준다. 감지 요소 레벨은 서로 다른 시간에 서로 차이가 없었다전철기. 인간 알부민 ELISA 분석은 구조에서 알부민 생산도 125 ng를 140 / ㎖ (도 4C) 사이에 안정적으로 남아있는 시간에 따른 상대적으로 일관성 유지 보여준다. 간 조직, 세포 알부민 양성 발현 CYP3A4 (대사에 관련된 시토크롬 P450 이소 형), E-cadherin의 (상피 세포 - 세포 부착 단백질) 및 디펩 티딜 나타내는 마커 염색 때 또한 펩 -4- (a 단백질 발현 높은 간) (그림 4D-F) 관찰된다. 함께 촬영이 생존 및 기능 데이터는 제안이 생존과 bioprinted 일차 전지 기반의 간 구조의 기능을 유지하는 조직 고유의 하이드로 겔 bioink 보조.
그림 1. 하이드로 겔 성분 특성 및 강도 평가. A) 성장 인자 및간. B로부터 제조 된 ECM 솔루션) 콜라겐, 글리코 사 미노 글리 칸의 비색 분석 정량, 간 ECM 솔루션의 엘라스틴 내용에 대한 프로테오믹스 배열에 의한 사이토 카인 분석. C) bioink 강성을 제어 할 수있는 기능의 데모. 단 하나의 가교 후, 겔은 비교적 부드럽고 원활하게 압출 될 수있다. UV 광, 간 조직 탄성률 모방 이상의 크기 순서에 의해보다 탄성 계수가 증가하여 2 단계 가교 후. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
조직을 통해 압출 bioprinting 및 제어를위한 여러 PEG 계 가교제를 고용 그림 2. 기계적 특성을 구성. S를아크릴 레이트 계 가교제 (가교제 1), 알킨 기반 가교제 (가교제 2)로 구성 인쇄 bioinks의 제제의 trategy는 티올 젤라틴, 조직 ECM 자료 및 수정되지 않은 HA 및 젤라틴을 HA를 티올. bioink 제형을 제조하여 자발적 부드러운 압출 소재 결과 결합 티올 레이트를 통하여 가교 결합된다. Bioprinting이 수행된다. 마지막으로, bioprinted 층 융합 안정화 및 간 탄성률을 가져왔다. 이 프로세스는 다층 구조를 생성하는 반복 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
bioinks 그림 3. Bioprinting 테스트. A)는 7 × 7mm 권선 패턴은 bioink 압출 테스트에 사용 된bioprinter에 보내고. B)를 PEGDA 8 - 아암 PEG 알카 bioink의 초기 제제 원료 HA 추가) 불규칙 증착. C 초래 젤라틴은 bioink 원활 압출 결과 압출 개선. 스케일 바 -. 1mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생존과 간 특정 하이드로 겔 bioink. A) bioprinting의 간 bioink의 구현에 bioprinted 간 타원체의 기능 그림 4. 데모는, 높은 생존 구조의 결과. 녹색 - 칼 세인의 생존 세포를 오전 묻은; 레드 - 에티 디움 호모 다이머 묻은 죽은 세포 B) 우레아 및 C) 14 일 동안 간 구조에 의해 분비 알부민.각각 비색과 ELISA 분석에 의해 정량화 문화 AYS. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. D) CYP3A4, E) 세포 내 알부민, 및 F) DPP4 및 E-cadherin의 : 간 조직과 관련된 마커의 면역 염색. 녹색 또는 빨간색 - 얼룩을 표시; 블루 -. DAPI 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 또는 시험 관내 스크리닝 응용 프로그램에 대한 최종 사용, 3 차원 조직 구조를 biofabricate 할 때 고려해야 할 중요한 몇 가지 구성 요소가 있습니다. biofabrication 장치 자체는 최종 구조에 도달하기위한 일반적인 방법을 결정하는 동안 적절한 세포 성분을 이용하는 것은 최종 잠재적 기능을 결정한다. 이 이중 역할을 역할로 세 번째 구성 요소, 바이오 물질은 똑같이 중요하다. 특히, 생체 재료의 구성 요소는 biofabrication 하드웨어 (즉, bioprinters) 또한 잠재적으로 취약한 생물학적 세포 구성 요소를 지원 모두 호환 가능해야합니다. 이러한 요구 사항을 모두 최적화 bioprintable 물질은 몇 가지 중요한 변수를 충족시킬 필요에 따라 어려울 수있다 : 1)을 효율적이고 방해 인쇄를 용이하게하기 위해 적절한 화학, 기계 및 시간적 특성을 갖는다; 제조 단계 및 bioprin 중에 2)지지 세포 생존팅 절차; 3) 최적의 세포 생존과 bioprinting 다음 최종 조직 구조 기능을 강화하는 친절한 환경을 제공합니다. 우리는 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 여기에 설명 된 방법에 기술 된 모듈러 하이드로 bioink 시스템을 채용한다. 우선, 성장 인자, 콜라겐, 개그, 특정 조직 형태의 ECM으로부터 유도 elastins을 도입함으로써, 우리는 상기 대상 조직의 유형의 연상 생화학 프로필을 달성 할 수있다. 둘째,이 유사하지만, 독립적 인 가교 반응을 이용하여, 우리는 압출 계, 상기 제 2 가교 단계로 변경 될 수있는 대상과 일치하는 결정 재료 탄성률에 도달하는 가장 호환 소프트 압출 재료를 얻을 수있다 선택의 조직. (34)
유용하게,이 시스템의 주요 특징은 polyme를 조작 무력화 될 수있는 다수의 화학 반응을 지원하는 능력이다rization 동역학 및 bioink 시스템의 기계적 특성. 이 독립적 인 반응 유형, 티올 레이트 및 티올 - 알킨을 사용함으로써, 우리는 주사기 또는 bioprinting 소자를 통해 압출 될 수있는 연성 재료 결과 스테이지 한 티올 레이트의 반응, 및 2 단 티올을 수행하는 기능을 실현 단지 최종 bioprinted 구조체의 탄성률을 결정하는 광개시제의 존재 하에서 UV 노광에 개시 -alkyne 반응. 이러한 여러 단계는 bioprintable 재료 초래한다. 따라서, 이러한 별도의 반응 형태를 유지하고, 압출 후의 탄성률 커스터마이즈를 지원하는 bioink 안정을 달성하기 위해 중요하다.
biofabrication 위해 시스템을 사용하여 일차 연신 어느 보조 가교제를 통해 최종 탄성률 조작 또는 다른 조직 유래 ECM 물질의 포함을 통해 이루어진다 커스터마이즈 용이성이다 또는 성장 인자 칵테일. 조직의 ECM은 성장 인자와 자주 조직 유형 사이의 전반적인 분포에 따라 다른 사이토 카인의 다양한 포함되어 있습니다. 우리는 이러한 요소는 기본 인간의 간세포와 같은 특정 세포 유형의 기능을 유지하기위한 필수적인 있다고 생각합니다. 이 개념의 구현은 미리 헤파린 결합 성장 인자와 함께 하이드로 겔뿐만 아니라 간 ECM에서 다른 ECM 성분의 헤파린 사슬을 결합하여 생존율 및 헤파린 히아루론산 샌드위치 배양 차 인간 간세포 기능. (20)를 증가하는 것으로 입증되었으며, 우리는 수 있었다 장시간 동안 시험 관내 생존과 기능을 유지 차 인간 간세포이 간 특정 생화학을 제시한다. 이 방법은 쉽게 연구자 decellularizing 및 다른 조직을 용해하여이 조직 - 특이 적 인자 재현부를 달성 할 수 있도록, 다른 조직 유형을 확장 할 수있다.
텐트 "> 사용자 인식되어야 함이 bioink 시스템의 기본 구성 요소는 이전 bioprinting 구현되었지만, 10,12,17 미만 뉘앙스, 조직 특이 적 접근뿐만 아니라 다른 재생 의학의 다양한 용도, 35- 45 biofabrication 모든 조직 유형에 대해 시도되지 않았다. 따라서, 이러한 추가의 조직 구조를 생성하기 위해 필요한 어떤 발전하고, 문제가있을 수있다. 그러나, 여기서 설명 된 것과 같은 모듈 형 시스템이 잘 적응할 수있다. 다른 가능성 제한은 일부 세포 유형은 특정 바이오 물질을 향하여있을 수 자연 친 화성을 포함한다. 일반적으로, 우리가 발명자들은이 하이드로 겔 시스템 지지체의 히알루 론산, 젤라틴, 및 PEG 계 기재 성분 생존 세포 유형의 다양한 문화, 아직 이러한 고유의 섬유 NA가 콜라겐, 서로 다른 조성의 설계 환경에서 더 잘 수행 세포의 일부 유형의 수 있습니다탄력 자연입니다 진짜야, 또는 엘라스틴,. 이와 같이, 소정의 조직 유형 및 최종 애플리케이션에 대한 최적의 재료를 고려가 중요하고, 여기에 설명 된 하이드로 겔 bioink 시스템이 모든 용도에 적합하지 않을 수있다. 또한,이 bioprinting이 수행되고있는 환경 조건을 고려하는 것이 중요합니다. 준비 및 인쇄 시간이 너무 37 ° C 사용 bioinks에서, 더 빠른 프로토콜을 인출 한 경우이 프로토콜의 개발 과정에서, 우리는 가까운 주변 (실온) 가난한 생존으로 이어질 셀 미디어없이 bioinks를 사용하여 상태에서 전환 극적으로 세포 생존 능력을 증가 미디어 컴포넌트와.최근까지 몇 물질 또는 물질 시스템은 bioprinting 시스템과 인터페이스하기 위해 특별히 개발되었다. 그 결과, 대부분의 물질은 biofabrication과의 호환성을 지원하는 세포 생물학적 특성을 활용하거나, 단순한, 또는하드웨어. 몇몇 재료는 모두 영역에 최적입니다. 이 방법에서 설명 된 시스템은 압출 bioprinting 필요한 기계적 물성을 용이하게하면서 이에 생물학적 특성의 지정을 허용하는 이러한 특성을 분리시킨다. 이 하이드로 겔 bioink 시스템의 추가적인 특징은 그것이 biofabricating에 사용되는 표적 조직 모두 생화학 적 및 물리적 파라미터를 모방 할 수 있다는 것이다. 이것은 거의 모든 조직의 생화학 적 요인 재현부 허용뿐만 아니라 모든 연부 조직의 탄성 계수 매칭, 유연성이 뛰어난 레벨을 지원한다. 조직의 이러한 측면 모두에 대한 관심은 거의 나란히 탐구되지 않았다.
이 기술의 모듈 특성은 다양한 애플리케이션에서 구현 될 수있는 유연성을 제공한다. 다양한 조직 유형을 모방하는 능력이 연구에서 예로서 사용뿐만 아니라 간 구조를 biofabricate하는 기능을 제공하지만, 콘구조체 체내의 다른 조직의 대부분을 나타내는. 아마도 이러한 매개 변수를 사용하여 가장 명백한 다양한 애플리케이션은 주입 또는 약물 및 독성 스크리닝 실시간 애플리케이션을 위해 설계 구조의 종료 함수를 최적화하기 위해 특정 조직에 양쪽 측면과 일치 할 수있는 능력이다. 환자에게 주입 인간 크기 조직의 발생으로 인해 조직 공학적 기관에 작용 혈관을 제조 할 수있는 능력에 대한 규제 허들 세포 소싱 및 제한에 많은 연구자에 대한 최종 목표이지만,이 높은 목표 발전과 시간을 필요 실현 될 수 있습니다. 그러나, 여기에 설명 된 방법과 같은 기술은 시작은 체외 플랫폼 "organoids"를 생성 구현한다. 팀뿐만 아니라, 다른 현재의 독성 시험을 수행하는 모델 시스템을 구축 biofabrication를 organoid 이용된다. 또한 이러한 organoids을 위해 사용될 수있다암, 46 등의 병리와 질병의 진행을 공부하고 잠재적 인 치료 치료를 테스트합니다. 마지막으로,이 시스템은 또 다른 중요한 사용을 지원합니다. 이러한 매개 변수를 독립적으로 조작함으로써, 연구자들은 기계적 요인 대 생화학의 상대적 중요성을 결정하는 기본 과학 실험을 수행 할 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 공간과 해군 전쟁 시스템 센터 태평양 (SSC PACIFIC) 계약 번호 N6601-13-C-2027에서 국방 위협 감소기구 (DTRA)에 의해 자금을 인정합니다. 이 자료의 공개는 본 연구 결과 나 결론 정부의 승인을 구성하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
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