Summary
Vi beskriver en uppsättning protokoll som tillsammans ger en vävnadsliknande hydrogel bioink som funktionella och livskraftiga 3-D konstruktioner vävnads kan bioprinted för användning i in vitro screeningsapplikationer.
Introduction
Under de senaste åren har en mängd olika tekniker blir tillgängliga som tar upp behovet av alternativa källor till funktionella organ och vävnader genom att försöka tillverka eller biofabricate, dem. Bioprinting har dykt upp som en av de mest lovande av dessa tekniker. Bioprinting kan betraktas som en form av robot additiv tillverkning av biologiska delar, som kan användas för att bygga eller mönster livskraftig organliknande eller vävnadsliknande strukturer i 3 dimensioner. 1 I de flesta fall utnyttjar bioprinting en 3-dimensionell (3 -D) utskriftsenhet som styrs av en dator för att sätta in celler och biomaterial i exakta positioner, vilket rekapitulera anatomiskt liknande fysiologiska arkitekturer. 2 Dessa enheter ut en "bioink", som kan ta formen av cellaggregat, celler inkapslade i hydrogeler eller viskösa vätskor, eller cellsådd mikrobärare, såväl som cellfria polymerer som ger mekaniska struktur eller fungera som cellfritt placeholders. 3,4 Efter bioprinting processen, kan den resulterande strukturen mognat till funktionell vävnad eller organstrukturer och används för sitt avsedda slut ansökan. 5,6 Hittills en komplett fullt fungerande människa-sized organ har inte skrivits ut, men det är fortfarande den främsta långsiktiga mål för bioprinting forskning och utveckling. 2 emellertid småskaliga "organoid" vävnadskonstrukten förs för närvarande i ett antal applikationer, inklusive patologi modellering, läkemedelsutveckling och toxikologi screening.
En av de största hindren som forskare har stött på vid tillämpningen bioprinting tekniken är att mycket få material har utvecklats för det uttryckliga syftet att bioprinting. För att effektivt lyckas bioprinting måste ett biomaterial uppfylla 4 grundläggande krav. Biomaterialet måste ha 1) lämpliga mekaniska egenskaper för att möjliggöra avsättning (oavsett om det strängsprutning genom ett munstycke som en gel eller en inkjet som en droppe), 2) förmågan att hålla sin form som en del av en 3-D struktur efter avsättning, 3) förmåga för användaren kontroll av de 2 tidigare egenskaper, och 4) en cell vänlig och stödjande miljö alls faser av bioprinting förfarande. 7 Historiskt bioprinting arbete har ofta försökt att använda befintliga traditionella biomaterial i bioprinting enheter utan hänsyn till deras kompatibilitet, i stället för att utforma ett biomaterial för att ha de egenskaper som är nödvändiga för bioprinting och efterföljande efterutskriftstillämpningar.
En mängd olika bioinks har nyligen utvecklats för att på ett bättre gränssnitt med avsättningen och tillverkning hårdvara. Standard hydrogel system utgör stora problem eftersom de finns i allmänhet antingen föregångare Fluid Solutions med otillräckliga mekaniska egenskaper, eller polymeriserade hydrogeler som om de utskrivna kan täppa munstycken eller blir delas upp på extruderingsprocessen. Vårt team, liksom andrasrs, har undersökt olika hydrogelformuleringar att ta itu med dessa bioprinting problem, bland annat cell sfäroid utskrift i hydrogel substrat, 5,8 cell och hydrogel filament extrudering från microcapillary rör, 9-11 strängsprut hyaluronsyra (HA) -guld nanopartiklar hydrogeler med dynamiska tvärbindningsegenskaper , 12 temporal kontroll av hydrogel styvhet med användning av fotopolymeriserbara metakrylerade HA och gelatin, 13 fibrinogen-trombin-baserade tvärbindning, 14,15 jonisk utbytes alginat-kollagen-geler, 16 och nyligen snabba polymeriserande ultraviolett ljus (UV) -initiated tvärbindning, 17
Dessa exempel visar möjligheten att generera material som kan genom bioprinted effektivt. Men förutom integration med hårdvara, för att framgångsrikt generera livskraftiga och funktionella 3-D vävnad konstruktioner måste biomaterial innehålla biokemiska och mekaniska signaler som stöd för att upprätthålla cellulärlivsduglighet och funktion. Dessa ytterligare faktorer, biokemiska och mekaniska profiler, kan ha en betydande inverkan på den framgångsrika funktion bioprinted vävnadskonstruktioner.
Båda cellerna och den nativa extracellulära matrisen (ECM) är ansvariga för att presentera ett brett spektrum av signalmolekyler, såsom tillväxtfaktorer och andra cytokiner till andra celler. Kombinationen av dessa signaler varierar från vävnad till vävnad, men kan vara extremt potent och inflytelserik vid reglering cell- och vävnads beteende. 18 Under användning av vävnadsspecifika ECM-komponenter från olika organ och genomförande som en hydrogel eller som del av en hydrogel har undersökts med framgång. 19-21 Detta tillvägagångssätt, som är sammansatt av decellularizing en given vävnad, pulverisering den, och lösa upp den, kan användas för att framställa vävnadsspecifika biokemiska signaler från någon vävnad och kan införlivas i 3-D-hydrogel-konstruktioner. 22
Dessutom,det är allmänt dokumenterat att vävnader i kroppen upptar ett brett spektrum av styvheter. 23 Som sådan, förmågan att avstämma de mekaniska egenskaperna hos biomaterial, såsom elasticitetsmodulen E 'eller skjuvning elasticitetsmodul G', är ett användbart verktyg i vävnadsteknik . Såsom beskrivits ovan, kontroll över bioink mekaniska egenskaper möjliggör extrudering baserade biofabrication med användning av en mjuk gel, som sedan kan manipuleras ytterligare genom sekundär tvärbindning vid en senare punkt, vid vilken elasticitetsmodul nivåer kan uppnås som matchar den hos typ målorganet. Till exempel, kan biomaterial anpassas för att matcha en styvhet på 5-10 kPa som en infödd lever, 23 eller matcha en styvhet på 10 till 15 kPa som nativt hjärtvävnad, 24,25 teoretiskt ökar förmågan hos dessa organoids att fungera i ett liknande sätt som deras nativa vävnads motsvarigheter. Inverkan av miljö styvhet på cellfenotyp har explored under de senaste åren, särskilt med avseende på stamceller. Engler et al. Visade att substrat elasticitet understödda i drivande mesenkymala stamceller (MSC) mot linjerna med vävnadens elasticitet matchar den hos substratet. 25 Detta koncept har vidare utforskas för differentiering till muskel, hjärtfunktion, lever fenotyp, hematopoetisk stamcellsproliferering , och underhåll av stamcells terapeutiska potential. 24,26-29 att kunna ställa en hydrogel till olika elasticitetsmoduler är en viktig egenskap hos ett biomaterial som kommer att användas för att biofabricate vävnadskonstrukten. 30
Här beskriver vi ett protokoll som utgör en mångsidig metod som används i vårt laboratorium för att formulera en hydrogel system som kan extrudering bioprinted och anpassade för att 1) innehåller den biokemiska profilen hos en speciell vävnad typ och 2) härma elasticitetsmodulen hos den vävnadstyp . Genom att ta itu med dessa krav, strävar vi efter att provide ett material som kan sammanfatta de fysiokemiska och biologiska egenskaper för in vivo vävnad. 31 Modul hydrogel kompositsystem som beskrivs häri utnyttjar en flertvärbindande tillvägagångssätt för erhållande av extruderbara bioinks, och tillåter en sekundär tvärbindning för att stabilisera och ökar styvheten hos den end produkter för att matcha en rad vävnadstyper. Biochemical anpassning uppfylls genom att använda vävnadsspecifika ECM-komponenter. Som en demonstration, använder vi en leverspecifik variation av denna hydrogel system Bioprint funktionella lever organoid konstruktioner. Protokollet som beskrivs med ett anpassat 3-D bioprinting enhet. I allmänhet kan detta protokoll anpassas till de flesta extrudering-baserade skrivare, specifika utskriftsparametrar varierar kraftigt för varje typ av enhet och kräver testning av användaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel Bioink Formuleringar och förberedelser
- För att tillhandahålla vävnadsspecifika biokemiska profiler, förbereda vävnadsspecifik ECM smälta lösningar som tidigare beskrivits för lever. 20
Obs: I allmänhet kommer denna ECM Digest omfatta 40% av den slutliga hydrogel bioink volym som används. Flera hundra milliliter av ECM uppslutningslösningen kan framställas, alikvoterades och frystes vid -80 ° C för framtida användning. - Före hydrogelformulering, upplösa en fotoinitiator, 2-hydroxi-4 '- (2-hydroxietoxi) -2-metylpropiofenon, i vatten vid 0,1% vikt / volym.
Obs: Volymerna i 50-100 ml området kan förberedas i förväg och förvaras skyddad från ljus vid 4 ° C i flera månader. - För att bilda hydrogel bioinks, först lösa basmaterialet komponenter från hyaluronsyra (HA) hydrogel kit i vatten fotoinitiator lösning.
- Lös det tiolerade HA och tiolerad gelatin separat i vatten-photoinitiator lösning (steg 1,2) för att göra 2% w / v-lösningar.
- Upplösa polyetylenglykoldiakrylat (PEGDA), tvärbindningsmedlet i hydrogelen kit, i vatten-fotoinitiator-lösning (steg 1,2) för att göra en 8% vikt / volym lösning.
- Upplösa polyetylenglykol (PEG) 8-Arm alkyn (10 kDa MW) i vatten-fotoinitiator-lösning (steg 1,2) för att göra en 8% vikt / volym lösning.
- I allmänhet bildar hydrogeler med användning av följande schema, även om ytterligare anpassning är möjlig.
- Kombinera 4 delar 2% tiolerade HA, 4 delar 2% tiolerad gelatin, en del tvärbindare en, en del tvärbindare 2 med 8 delar vävnad ECM lösning och 2 delar hepatocyte odlingsmedier (HCM) (eller 10 delar vatten som en allmän icke-vävnad -specifika hydrogel).
Not: Ytterligare omodifierad HA eller gelatin kan tillsättas för att göra bioink extrude smidigare. Detta beskrivs nedan.
- Kombinera 4 delar 2% tiolerade HA, 4 delar 2% tiolerad gelatin, en del tvärbindare en, en del tvärbindare 2 med 8 delar vävnad ECM lösning och 2 delar hepatocyte odlingsmedier (HCM) (eller 10 delar vatten som en allmän icke-vävnad -specifika hydrogel).
- Vortexa den resulterande blandningen på hög (hastighet 10 av 10) för 10 sek för att blandas före användning. </ Li>
- Användning av hydrogel bioink
- För extrudering eller bioprinting testning, överföra blandningen i en spruta eller bläckpatron och låt den tvärbinda spontant under 30 minuter (steg 1 tvärbindning) vid 37 ° C.
- För reologiska mätningar, överföra blandningen i en 35 mm petriskål och låt den tvärbinda under 30 minuter.
Obs: Blandningen börjar omedelbart att tvärbinda genom tiol-akrylat bindning och kommer att börja öka i viskositet. Blandningen bör överföras till en spruta, bläckpatron, eller målplatsen inom 10 minuter för att undvika igensättning av en pipett eller spruta under överföringen. - När sekundär tvärbindning (etapp 2) önskas, bestråla stadium 1-tvärbundna geler med ultraviolett ljus (365 nm, 18 W / cm 2) för att initiera en tiol-alkyn polymerisationsreaktionen.
Beakta: Varaktighet för bestrålning är beroende av ytarean hos materialet. I allmänhet, en kvadratcentimeter av material kräver endast 1-2 sek UV-exponering vid denna UV makt.
2. Skrivare kompatibilitetstester
- Före integrationstestning med bioprinting anordningar, test extrudering egenskaper på laboratoriebänk med enkla extrudering tester med standardsprutor och små nål tips (20-30 gauge).
- Skjut bioink genom en standardspruta för att uppnå ett smidigt extruderade filament av hydrogel med få eller inga gupp. Strängsprutning av linjer eller enkla mönster är tillräckligt för att bestämma framgång.
- För bioprinter integration, ladda bioink preparat genom att pipettera dem i skrivarpatroner, och tillåta 30 min för bioink att genomgå spontan steg 1 tvärbindning i patronen.
Obs: Volym bioink beror på den specifika applikationen och bör bestämmas av användaren. Skrivarpatroner kan likna eller vara sprutor som är kompatibla med bioprinter enheten. - Utvärdera extrudering kompatibilitetför bioprinting genom att skriva ett enkelt mönster med hjälp av bioink. Till exempel genom att skriva ut en 7 x 7 mm mönster består av parallella linjer. Applicera tryck (t.ex. 20 kPa pneumatiskt tryck) medan skrivhuvudets rör sig i XY-planet med en hastighet av cirka 300 mm / min.
Obs: skrivhuvud munstycksdiametrar av olika storlekar kan användas, men koniska munstycken med öppningar 400-500 iM diameter är optimala för utskrift spheroids i 250-350 pm intervallet.- Om de extruderade materialen är lumpy eller oregelbundna, se steg 2,4, eller minska mängden PEGDA att mjuka upp stadium ett tvärbundet material. Ordentligt förberedd bioink formuleringar pressa smidigt, möjliggör exakt avsättning i önskade mönster eller arkitekturer.
Obs! Bioprinting procedurer beskrivna använda en anpassad 3-D bioprinting anordning som är konstruerad i huset speciellt för vävnad konstruera utskrift 32 Som sådan, specifika utskriftsparametrar varierar dramatiskt för varje typ av enhet och kräver testin.g av användaren.
- Om de extruderade materialen är lumpy eller oregelbundna, se steg 2,4, eller minska mängden PEGDA att mjuka upp stadium ett tvärbundet material. Ordentligt förberedd bioink formuleringar pressa smidigt, möjliggör exakt avsättning i önskade mönster eller arkitekturer.
- För att förbättra strängsprutningsegenskaper, komplettera omodifierad HA och gelatin för att de bioinks (1,5 mg / ml och 30 mg / ml, respektive).
3. Validering av Bioprinting med primär lever konstruktioner
- Förbered 3-D sfäroider primärcell lever genom droppe metoder som den cellulära komponenten 33
Notera: Bioprinting kan utföras utan sfäroider, men istället med enskilda celler suspenderade i hydrogelpartiklarna bioinks samt. Sfäroider används för att påskynda cell-cell interaktioner och konstruera funktionalitet. Antalet sfäroider eller celler som används beror på den specifika applikationen och bör bestämmas av användaren. Dessa steg bör utföras under sterila förhållanden, med hjälp av sterila leveranser.- Bered HCM genom att tillsätta de upptinade innehållet i HCM tillägg komponent kit till hepatocyt basala media (HBM) och steril filtrering.
- Tina Tillägget komponenter until vätska.
- Tillsätt kompletterar komponenterna (askorbinsyra, 0,5 ml, bovinserumalbumin [fettsyra gratis], 10 ml, gentamicinsulfat / amfotericin B, 0,5 ml, hydrokortison 21-hemisuccinat, 0,5 ml, insulin, 0,5 ml, humant rekombinant epidermal tillväxtfaktor , 0,5 ml; överföring, 0,5 ml) till 500 ml HBM.
- Sterilfiltrera genom ett 0,45 | im eller 0,22 ^ m filter med användning av en flaska-top filterenhet eller en sprutspets filter.
- Bestämma celldensitet av primära mänskliga hepatocyter, Kupffer-celler och stellatceller genom räkning på en hemocytometer efter varje celltyp har tinats i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Kombinera primära mänskliga hepatocyter, Kupffer-celler och stellatceller i en 80:10:10 förhållande av cellantalet i HCM media som har värmts till 37 ° C i ett koniskt rör.
Obs: Volymen av media som skall användas beror på den totala cellantalet specifika för ansökan och bör bestämmas av the användare. - Centrifugera cellsuspensionen under 5 minuter vid 520 xg vid 20 ° C.
- Aspirera supernatanten och lämnar efter sig cellpelleten.
- Resuspendera cellpelleten i HCM medier för att ge en cellsuspension innehållande 1000 celler per 40 | il media. Total volym är avhängig av antalet sfäroider som produceras.
- Överför cellsuspensionen till 96 brunnar fallplåtarna format hängande. Lägg totalt cirka 1000 celler till varje brunn i HCM och hålls kvar vid 37 ° C i 5% CO2 under 3 dagar under vilka flercelliga sfäroider bildas.
- Samla lever sfäroider från hängande droppe plattan med hjälp av en pipett. Överföring till en steril 15 ml koniska rör.
- Bered HCM genom att tillsätta de upptinade innehållet i HCM tillägg komponent kit till hepatocyt basala media (HBM) och steril filtrering.
- Bioprint lever sfäroider i leverspecifik hydrogel bioink
- Bereda en formulering av lever ECM-innehållande hydrogel bioink såsom beskrivits i steg 1, med användning av 8% PEGDA och 8% 8-Arm PEG alkyn som tvärbindare. Använd denna kombination för sin förmåga i Resulting i en hydrogel nära i skjuvning elasticitetsmodul till nativt levervävnad.
- Låt sfäroiderna sedimentera till botten av den koniska rör i vilket de var placerade i steg 3.1.7. Detta varierar beroende på sfäroid storlek och täthet, men i allmänhet sker inom 1-2 minuter. Ta bort allt material genom att försiktigt aspirera eller med en pipett.
- Överföra den önskade volymen av nyberedd hydrogel bioink lösningen till den koniska rör som innehåller sfäroiderna. I allmänhet är en lämplig volym 10% -25% större än volymen av den 3-D-konstruktion som skall tryckas. Noggrant pipettera upp och ner för att resuspendera sfäroiderna i hydrogelen bioink lösning. Överföring till en bioprinter patron med hjälp av en pipett eller serologisk pipett.
- Inuti bioprinter kassetten låt lösningen genomgå första tvärbindningssteget (tiol-akrylat reaktion) under 30 minuter.
Obs! Beroende på sfäroid storlek, kan patronen behöva vara långsamt roteras eller innehållet kan behöva blandas meden steril spatel för att hålla sfäroiderna fördelade i hela bioink under etapp 1 tvärbindning. Detta är mindre en nödvändighet för bioinks framställda med suspenderade celler i stället för sfäroider.
Obs: Efter steg 1 tvärbindning, användare har en rörelsefönster på flera timmar. Det är dock rekommenderas att utföra bioprinting processen snabbt för att förbättra cellviabilitet. - Efter steg 1 tvärbindning, använder en bioprinting enhet för att skapa önskade hydrogel strukturer som innehåller de primära lever sfäroiderna (eller andra celler).
Notera: Denna teknik tillhandahåller ett system för biofabricating en mängd olika strukturer. Parametrar såsom total volym, antal celler eller sfäroider, den tryckta struktur geometri och substrat på vilka konstruktioner är tryckta är starkt beroende av målen för användaren. - Efter avsättning till den önskade konfigurationen, administrera UV-ljus under 2-4 sek för att initiera den sekundära tvärbindningsmekanismen, stabilisera constructs och ökad styvhet till den önskade nivån.
Obs: Koncentrationen av PEG-alkyn, och sålunda den totala slutliga tvärbindningstäthet, styr i första hand den slutliga konstruktionen styvhet. - Upprepa steg 3.2.4 och 3.2.5 för att skapa flerskiktskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När de förfaranden som beskrivs ovan följs korrekt, bör hydrogeler innehåller en biokemisk profil som är specifik för målvävnaden typ, 20 möjliggöra en hög grad av kontroll över bioprinting och slutelasticitetsmodul, 34 och stödja livskraftiga funktionella celler i vävnadskonstruktioner.
hydrogel Anpassning
För att bäst härma infödda levern, var hydrogelen bioink kompletteras med lever ECM-lösningar och en tillväxtfaktor Array, 20 ECM lösningar innehåller en mängd olika tillväxtfaktorer och cytokiner (visas i pg / ml, Figur 1A). Dessa inkluderar hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF), bFGF, benmorfogenetiskt protein 5 (BMP-5), FGF-4, insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF , FGF-7, tillväxthormon (GH), heparinbindande EGF-liknande tillväxtfaktor (HB-EGF), HGF och neurotrophin 3 (NT-3). Dessutom, ECM-lösningar innehålla ytterligare strukturella komponenter, som analyseras av kolorimetriska analyser. 20 för lever ECM-lösningar, total kollagenhalt av lever ECM-lösningar var 91,33 ± 0,58 mg / ml, var elastin innehåll 189,33 ± 48,40 mg / ml, och glykosaminoglykan (GAG) innehållet var 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figur 1B).
Hydrogel bioink mekaniska egenskaper kan karaktäriseras med användning av en skjuvspänning sveptest (0,6-10 Pa, oscillationsfrekvensen 1 Hz) på reometern. 10,12,13,34 Genom att tillåta spontan stadium en tiol-akrylat kemi för att ske vid neutralt pH, en mjuk hydrogel med en G "av 113,66 ± 22,59 Pa bildas. Efter initiering av steg 2 tiol-alkyn tvärbindning genom UV fotopolymerisation, G 'ökar till cirka 10 kPa (10.637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), imitera levervävnad elasticitet. Ytterligare manipulering av koncentrationerna, molekylvikter, och geometrier av tvärbindare kan uppnå ett brett utbud av steg 2 G 'värden. 34
Kvaliteten på bioprinted hydrogel
Kemisk strategi och genomförande av steg 1 och steg 2 tvärbindning av hydrogelen bioinks beskrivs i figur 2. I allmänhet, tvärbindare såsom Extralink, som är baserade på akryle PEG-polymerer, spontant reagerar med tiolgrupper på HA och gelatinkedjorna vid neutralt pH (steg 1) i närvaro av celler för att bilda en mjuk sprutbar hydrogel. Denna mjuka hydrogel kan bioprinted som en bioink, varefter UV-ljus används för att initiera fotopolymerisation av oreagerade tioler och de sekundära tvärbindare baserade på alkyn-modifierad PEG-polymerer. De särskilda molekylvikter och geometrier av tvärbindnings gåvern slutet styvhet bioprinted konstruktionen. En 7 x 7 mm mönster genomfördes för teständamål (figur 3A). Initiala tester visade att de initiala formuleringarna var extruderbara, men verkade oregelbundna och hopklumpat under och efter extrudering (figur 3B). För att förbättra extrudering egenskaper, var omodifierad HA och gelatin kompletterat med bioinks (1,5 mg / ml och 30 mg / ml). Den förbättrade släta tryckt struktur visas i figur 3C.
Livskraft och grundläggande funktion av bioprinted primära humana lever konstruktioner
Använda 3-D bioprinter den bioaktiva leverspecifik hydrogel bioink användes för att kapsla in och deponera primära humana lever sfäroider, som tidigare framställts genom att hänga droppe kulturer, på plasttäck. Skrivs ut på plasttäck tillåts för robust hantering och överföring till en mängd olika cellkulturmiljöer. Efter bioprinting high cellviabilitet i lever konstruktionerna observerades efter LIVE / DEAD viabilitet / cytotoxicitet färgning och konfokalmikroskopi (figur 4A). Under optimala miljöförhållanden bör lönsamheten vara över 85%. Primära humana hepatocyter i allmänhet anses känsliga för mekaniska och kemiska påfrestningar, som krävde en viss optimering av miljövariabler.
Efter bioprinting och verifiering av lönsamheten kan ytterligare lever konstruktioner som är placerade i kultur bedömas för funktionalitet genom att analysera media portioner avlägsnades på dag tre, dag 7, dag 10 och dag 14 för analys av utsöndrat urea och albumin. Urea kolorimetriska analyser avslöjar en relativt jämn nivå av urea utsöndring från levern konstruktioner under 14-dagars tidsförlopp, återstår mellan 15 och 20 ng / ml (Figur 4B). Detekterade ureanivåerna var inte signifikant olika från varandra vid de olika tidspunkter. Human albumin ELISA-analysen visar att albuminproduktion från konstruktionerna är också fortfarande relativt jämn över tiden, förblir stabila mellan 125 och 140 ng / ml (Figur 4C). Dessutom, när färgas för markörer som tyder på levervävnad, positivt uttryck för intracellulär albumin, CYP3A4 (en cytokrom P450 enzymet involverat i metabolismen), E-cadherin (en epitelcell-celladhesionsprotein), och dipeptidylpeptidas-4 (ett protein som uttrycks högt i levern) observeras (Figur 4D-F). Sammantaget denna livskraft och funktionella data tyder på att de vävnadsspecifika hydrogel bioink hjälpmedel i att upprätthålla viabilitet och funktion hos bioprinted primära cellbaserade lever konstruktioner.
Figur 1. hydrogel komponent karakterisering och styvhet bedömning. A) tillväxtfaktor ochcytokin analys av proteomik arrayer för ECM-lösningar framställda från levern. B) Kolorimetrisk analys kvantifiering av kollagen, glykosaminoglykan och elastin innehåll i levern ECM-lösningar. C) Demonstration av förmågan att styra bioink styvhet. Efter steg 1 tvärbindning, är gelén relativt mjuk och i stånd att extruderas smidigt. Efter steg 2 tvärbindning genom UV-ljus, elastiska modul ökar med mer än en storleksordning, härma levervävnad elasticitetsmodul. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Använda flera PEG-baserade tvärbindningsmedel för extrudering bioprinting och kontroll över vävnaden konstruera mekaniska egenskaper. SSTRATEGI formulering av utskrivbara bioinks består av akrylatbaserade tvärbindare (tvärbindnings 1), alkyn baserade tvärbindningsmedel (tvärbindare 2), tiolerad HA, tiolerad gelatin, vävnads ECM material, och omodifierad HA och gelatin. Den bioink formulering framställs och spontant tvärbinder genom tiol-akrylat-bindning, vilket resulterar i ett mjukt, extruderbart material. Bioprinting utförs. Slutligen är de bioprinted skikten smält, stabiliserad, och fördes till levern elasticitetsmodul. Denna process kan upprepas för att generera flerskiktsstrukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bioprinting testning av bioinks. A) En 7 x 7 mm lindningsmönstret användes för bioink urtagningstesting i bioprinter. B) Den ursprungliga utformningen av en PEGDA och 8-arm PEG alkyn bioink resulterade i oregelbunden avsättning. C) Lägga rå HA och gelatin förbättrad extrudering, vilket resulterar i jämn extrudering av bioink. Skala bar -. 1 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Demonstration av livskraft och funktion av lever sfäroider bioprinted i levern specifika hydrogel bioink. A) Genomförande av lever bioink för bioprinting, resulterade i hög viabilitet konstruktioner. Grön - kalcein AM-färgade levande celler; Röd - B Ethidium homodimer-färgade döda celler) Urea och C) albumin utsöndras av lever konstruktioner över 14 d.ays i kultur, kvantifierade genom kolorimetriska och ELISA-analyser, respektive. Felstaplar indikerar standardavvikelsen. Immunfärgning av markörer associerade med levervävnad: D) CYP3A4, E) Intracellulär albumin, och F) DPP4 och E-cadherin. Grön eller röd - indikerade fläck; Blå -. DAPI klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera komponenter som är kritiska att tänka på när man försöker biofabricate 3-D vävnadskonstrukten, för eventuell användning i människor, eller för in vitro-screening program. Under användning av lämpliga cellulära komponenterna bestämmer slutet potentiella funktionalitet, medan biofabrication enheten själv bestämmer den allmänna metoden för att nå slutkonstruktionen. Den tredje komponenten, biomaterialet, är lika viktigt, eftersom det tjänar dubbla roller. Specifikt måste biomaterial komponenten vara kompatibel med både biofabrication hårdvara (dvs bioprinters) och även stödja de potentiellt känsliga biologiska cellkomponenter. Optimera båda dessa krav kan vara svårt, eftersom bioprintable material måste uppfylla flera viktiga parametrar: 1) inneha den lämpliga kemiska, mekaniska och temporala egenskaper för att underlätta en effektiv och obehindrad utskrift; 2) stöd cellviabiliteten under förberedelsestegen och bioprinting förfarande; 3) och ger en gästfri miljö som bäst förbättrar cellviabiliteten och eventuell vävnad konstruktion funktion enligt bioprinting. Vi använder modul hydrogel bioink som beskrivs i den metod som beskrivs här för att uppfylla dessa krav. Dels genom att införliva tillväxtfaktorer, kollagen, GAG, och elastiner härrör från ECM av en viss vävnadstyp, kan vi uppnå en biokemisk profil som påminner om typ målvävnaden. För det andra, genom att använda 2 liknande, men oberoende tvärbindningsreaktioner har vi möjlighet att uppnå ett mjukt extruderbart material, som är kompatibelt med de flesta extrudering baserad, vilket kan förändras ytterligare med andra tvärbindningssteg för att nå en bestämd materialelasticitetsmodul som matchar ett mål vävnad val. 34
Den kritiska egenskap hos detta system som gör den användbar är förmågan att stödja flera kemiska reaktioner som kan utnyttjas för att manipulera den polymerization kinetik och mekaniska egenskaperna hos bioink systemet. Genom att använda 2 oberoende reaktionstyper, tiol-akrylat och tiol-alkyn, uppnår vi möjlighet att utföra ett steg en tiol-akrylat reaktion som resulterar i ett mjukt material som kan strängsprutas genom en spruta eller bioprinting enhet, och en scen två tiol -alkyne reaktion, som endast initieras vid UV-exponering i närvaro av en fotoinitiator, som bestämmer elasticitetsmodulen för den slutliga bioprinted konstruktionen. Dessa multipla steg leder till en bioprintable material. Som sådana, i syfte att uppnå en stabil bioink som stöder extrudering och efterföljande elasticitetsmodul anpassning, bibehålla dessa separata reaktionstyper är viktig.
Den primära dragning till att använda systemet för biofabrication är dess enkelhet för anpassning, vilket sker antingen genom att manipulera slutet elasticitetsmodul genom den sekundära tvärbindningsmedel eller genom införande av olika vävnads härledda ECM material eller tillväxtfaktorcocktails. ECM i vävnader innehåller en mängd tillväxtfaktorer och andra cytokiner, som ofta varierar i totala fördelningen mellan vävnadstyper. Vi tror att dessa faktorer är i ett stycke för att upprätthålla funktionen hos vissa celltyper, såsom primära humana hepatocyter. Genomförandet av detta koncept har tidigare visat sig öka lönsamheten och funktion av primära humana hepatocyter i hepariniserade hyaluronsyra sandwich kulturer. 20 Genom att kombinera heparinkedjor i hydrogelen med heparinbindande tillväxtfaktorer liksom andra ECM-komponenter från levern ECM, kunde vi att presentera detta leverspecifik biokemisk profil för att primära mänskliga hepatocyter, upprätthålla viabilitet och funktion in vitro under en förlängd tidsperiod. Detta tillvägagångssätt kan lätt utvidgas till andra vävnadstyper, vilket gör att forskare för att uppnå rekapitulation av dessa vävnadsspecifika faktorer genom decellularizing och solubilisera andra vävnader.
tält "> Användare bör vara medvetna om att när de baskomponenter i detta bioink systemet har genomförts i bioprinting tidigare, 10,12,17 men i mindre nyanserad, vävnadsspecifika strategier, samt en mängd andra regenerativ medicin program, 35- 45 biofabrication har inte försökt alla vävnadstyper. som sådan, kan det finnas en viss vidareutveckling och felsökning krävs för att skapa sådana ytterligare vävnads konstruktioner. dock kan ett modulärt system som det som beskrivs här mycket väl vara anpassningsbar. Andra potentiella begränsningar innefattar naturliga affiniteter att vissa celltyper kan ha mot specifika biomaterial. i allmänhet har vi funnit att hyaluronsyra, gelatin, och PEG-baserade baskomponenter i denna hydrogel systemstöd viabla kulturer av ett stort antal olika celltyper, men det kan vara vissa typer av celler som utför bättre i tekniska miljöer med olika sammansättningar, såsom kollagen, som har en inneboende fiber naTure, eller elastin, som till sin natur mer elastisk. Som sådan, är ersättning för det optimala materialet för en given vävnadstyp och slutanvändning viktigt och hydrogel bioink systemet som beskrivs här är kanske inte tillräckligt för alla ändamål. Dessutom är det viktigt att beakta de miljöförhållanden under vilka bioprinting utförs. Under utvecklingen av detta protokoll, vi gått från nära omgivningens (rumstemperatur) betingelser med användning bioinks utan någon cellmedia, som leder till dålig lönsamhet om preparatet och utskriftstiden var alltför utdragen, att snabbare protokoll enligt 37 ° C med hjälp av bioinks med en mediakomponent, som ökat dramatiskt cellviabilitet.Fram till nyligen var några material eller materialsystem som utvecklats speciellt för att samverka med bioprinting system. Som ett resultat, de flesta material är förenklade, utnyttja antingen sina biologiska egenskaper för att stödja celler, eller, deras förenlighet med biofabricationhårdvara. Få material är optimala i båda sfärerna. Det system som beskrivs i denna metod frikopplar dessa egenskaper, vilket möjliggör anpassning av biologisk karakterisering, samtidigt underlätta de mekaniska egenskaper som krävs för extrudering bioprinting. En ytterligare uppdelning av detta hydrogel bioink system är att det kan härma både biokemiska och fysikaliska parametrar målvävnaderna det används för biofabricating. Detta stöder en imponerande nivå av flexibilitet, vilket möjliggör rekapitulation av de biokemiska faktorer på nästan alla vävnader, såväl som matcha elasticitetsmodulen för någon mjukvävnad. Uppmärksamhet på båda dessa aspekter av en vävnad har sällan undersökts i tandem.
Den modulära naturen av denna teknik ger en flexibilitet för att implementeras i en mängd olika tillämpningar. Förmågan att imitera olika vävnadstyper ger möjlighet att biofabricate inte bara lever konstruktioner som används som ett exempel i detta arbete, men constructs representerar många av de andra vävnader i kroppen. Den kanske mest uppenbara bred tillämpning med användning av dessa parametrar är förmågan att matcha båda aspekterna till en speciell vävnad för att optimera slut funktion av konstruerade konstruktionerna för verkliga tillämpningar såsom implantation eller drog- och toxikologi screening. Medan generering av mänskliga stora vävnader för implantation i patienter är slutmålet för många forskare, på grund av rättsliga hinder, cell sourcing, och begränsningar på förmågan att tillverka funktionella kärl i vävnadstekniska organ, kommer detta höga mål kräver ytterligare utveckling och tid som skall förverkligas. Men teknik såsom den metod som beskrivs här för närvarande börjar genomföras för att generera "organoids" för in vitro-plattformar. Vårt team, liksom andra, är för närvarande utnyttjar organoida biofabrication att skapa modellsystem där toxikologiska studier utförs. Dessutom kan sådana organoids användas för attstudera sjukdomar och sjukdomsprogression, såsom cancer, 46 och testa potentiella terapeutiska behandlingar. Slutligen detta system stöder också en annan viktig användning. Genom att manipulera dessa parametrar självständigt, kan forskare utföra grundläggande vetenskapliga experiment för att bestämma den relativa betydelsen av biokemiska kontra mekaniska faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt finansiering från Reduction Agency (DTRA) under Space och Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) kontrakt nr N6601-13-C-2027 Defense Threat. Offentliggörandet av detta material utgör inte godkännande av regeringen av resultaten eller slutsatser häri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
