Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

El objetivo general de este protocolo es demostrar un enfoque versátil para diseñar biotintas de hidrogel que puedan extruirse mediante dispositivos de bioprintado. Las biotintas pueden utilizarse entonces para fabricar construcciones tridimensionales de tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del bioprintado, como cómo controlar las propiedades mecánicas necesarias para proporcionar un material que pueda extruirse usando un bioprinter.

La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos componentes disponibles comercialmente combinados de forma modular para crear un bioink hidrogel sencillo y eficaz que se puede bioprintar. Las aplicaciones de estas tecnologías incluyen la creación de organoides tridimensionales de tejidos que pueden utilizarse para modelar con precisión los efectos de fármacos, toxinas y enfermedades. Aunque este método puede proporcionar un marco para bioprintar construcciones hepáticas tridimensionales, también puede aplicarse a otros tipos de tejidos, como el muscular, pulmonar y colónico.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se utilizan varios reactivos diferentes para crear la biotinta de hidrogel, aunque en realidad es bastante sencillo. El procedimiento será demostrado por Young-Joon Seol, un postdoctorado de nuestro equipo. Para comenzar, prepare un digesto de matriz extracelular específico para el tejido que se utilizará en la formulación del hidrogel, tal como se describe en otra sección.

Luego, disuelva un fotoiniciador en agua a una relación de peso por volumen del 0,1 %. Para formar las bio-tintas de hidrogel, primero disuelva los componentes base de los kits de hidrogel de ácido hialurónico en alícuotas individuales de la solución acuosa de fotoiniciador. A continuación, combine la solución de matriz extracelular, el ácido hialurónico tioilado al 2 %, la gelatina tioilada al 2 %, los agentes de reticulación y el medio de cultivo de hepatocitos en las proporciones que se indican aquí. Para mejorar las propiedades de extrusión de la bio-tinta, añada 1,5 miligramos por mililitro de ácido hialurónico no modificado y 30 miligramos por mililitro de gelatina a la mezcla.

Luego, agite la mezcla resultante en vórtex a alta velocidad durante diez segundos antes de usarla. Antes de probar la biotinta en un dispositivo de bioprinting, primero evalúe las características de extrusión en el banco de laboratorio. Utilizando una jeringa estándar, coloque una muestra de la biotinta y luego fije una aguja de calibre 20 a 30 a la jeringa.

Deje que el bioink se entrecruce y luego empuje el bioink a través de la aguja para obtener filamentos de hidrogel extruidos suavemente. Si la formulación es capaz de crear un filamento con pocos o ningún bulto, entonces está lista para la bioprintación. Para cargar las preparaciones de bioink en una bioprintadora, pipetee los bioinks en cartuchos esterilizados de impresora.

Déjelos reposar durante 30 minutos antes de la extrusión, ya que la bio-tinta experimentará una reticulación espontánea de etapa uno dentro del cartucho. A continuación, cargue el cartucho en el sistema de impresión y conecte una fuente de presión neumática al cartucho. Prepare un patrón sencillo, como esta cuadrícula de siete por siete milímetros compuesta por líneas paralelas, para imprimirlo y evaluar así su compatibilidad con la extrusión.

Mientras el cabezal de impresión se mueve en el plano XY a una velocidad de aproximadamente 300 milímetros por minuto, aplique una presión de 20 kilopascales al cartucho para extruir el bioink. Si los materiales extruidos son irregulares o presentan grumos, reduzca la cantidad de agente de reticulación añadido con el fin de ablandar el material reticulado en la etapa uno. Una formulación de bioink adecuadamente preparada debe extruirse de forma uniforme, permitiendo una deposición precisa y la formación de arquitecturas definidas.

Prepare esferoides hepáticos tridimensionales de células primarias en una placa de 96 pocillos utilizando el método de gota colgante, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de tres días en cultivo, recolecte los esferoides hepáticos de la placa de gota colgante usando una pipeta y transfiéralos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Deje que los esferoides sedimenten en el fondo del tubo cónico durante uno o dos minutos.

Luego, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta. Transfiera entre el 110 y el 125 por ciento del volumen deseado del constructo 3D impreso de la solución de biotinta hidrogel recién preparada al tubo cónico que contiene los esferoides. A continuación, pipete cuidadosamente los esferoides hacia arriba y hacia abajo para volver a suspenderlos en la solución de biotinta hidrogel.

Una vez suspendida uniformemente, transfiera la solución de esferoides a un cartucho de biopresión mediante una pipeta y permita que la solución pase por la primera etapa de reticulación durante 30 minutos. Tras esta etapa de reticulación, utilice un dispositivo de biopresión para crear las estructuras deseadas de hidrogel que contengan los esferoides hepáticos primarios. Después de cada capa impresa, exponga la biotinta impresa a luz UV durante dos a cuatro segundos para iniciar el mecanismo de reticulación secundaria.

Esto estabilizará los constructos y aumentará la rigidez al nivel deseado. La concentración de alquino de PEG en la solución es lo que controla la densidad global de reticulación, y por lo tanto controla principalmente la rigidez del constructo final. Después de la bioimpresión, se observó una alta viabilidad celular en los constructos hepáticos mediante microscopía confocal.

Bajo condiciones ambientales óptimas, la viabilidad debe ser superior al 85 %. Además, cuando los constructos se tiñeron con marcadores indicativos de tejido hepático, se observó expresión positiva de CYP3A4, una isoforma del citocromo P450, albúmina intracelular, E-cadherina, una proteína de adhesión célula-célula epitelial, y DPP4, una proteína altamente expresada en el hígado. Cuando se analizó el medio de cultivo en busca de niveles de urea y albúmina, se encontró que el constructo secretó tanto urea como albúmina a niveles constantes durante el curso de 14 días. Esto sugiere además que las biotintas de hidrogel específicas para el tejido ayudan a mantener la función de las células hepáticas.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas desde el inicio hasta el final si se lleva a cabo correctamente. Sin embargo, esto a menudo depende del dispositivo de bioimpresión específico que se utilice. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los pasos demostrados deben adaptarse frecuentemente para ser compatibles con otros tipos de tejidos o dispositivos de bioimpresión.

Tras seguir este procedimiento, se pueden crear otras formulaciones de biotinta en hidrogel para soportar la bioprintación de otros tipos de tejidos. El desarrollo de estas tecnologías ayudó a allanar el camino hacia la creación de plataformas de múltiples organoides, tipo "órgano-en-un-chip", para la evaluación de fármacos y la modelización de enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comenzar a diseñar materiales que puedan utilizarse para la bioprintación de estructuras de tejido tridimensionales mediante reticulación en múltiples pasos.

No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso para la visión, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas protectoras contra los rayos UV, al realizar este procedimiento.