Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

El objetivo general de este protocolo es demostrar un enfoque versátil para el diseño de biotintas de hidrogel que puedan extruirse a través de dispositivos de bioimpresión. Las biotintas se pueden utilizar para fabricar construcciones de tejidos tridimensionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioimpresión, como por ejemplo cómo controlar las propiedades mecánicas necesarias para proporcionar un material que se pueda extruir con una bioimpresora.

La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos componentes disponibles en el mercado combinados de forma modular para crear una biotinta de hidrogel bioimprimible sencilla y eficaz. Las aplicaciones de estas tecnologías incluyen la creación de organoides de tejido en 3D que se pueden utilizar para modelar con precisión los efectos de medicamentos, toxinas y enfermedades. Aunque este método puede proporcionar un marco para las construcciones hepáticas de bioimpresión en 3D, también se puede aplicar a otros tipos de tejidos como el músculo, el pulmón y el colon.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se utilizan varios reactivos diferentes para crear la biotinta de hidrogel, pero en realidad es bastante sencillo. La demostración del procedimiento estará a cargo de Young-Joon Seol, un postdoctorado de nuestro equipo. Para comenzar, prepare una digestión de matriz extracelular específica para cada tejido que se utilizará en la formulación de hidrogel como se describe en otra parte.

Luego, disuelva un fotoiniciador en agua en una proporción de peso por volumen de 0.1%Para formar las biotintas de hidrogel, primero disuelva los componentes del material base de los kits de hidrogel de ácido hialurónico en alícuotas individuales de la solución del fotoiniciador de agua. A continuación, combine la solución de ECM, el ácido hialurónico tiolado al 2 %, la gelatina tiolada al 2 %, los reticulantes y los medios de cultivo de hepatocitos en las proporciones que se muestran aquí. Para mejorar las propiedades de extrusión de la biotinta, agregue 1,5 miligramos por mililitro de ácido hialurónico no modificado y 30 miligramos por mililitro de gelatina a la mezcla.

Luego, agite la mezcla resultante en alto durante diez segundos antes de usarla. Antes de probar la biotinta en un dispositivo de bioimpresión, primero pruebe las características de extrusión en la mesa de laboratorio. Con una jeringa estándar, deje caer una muestra de biotinta y luego coloque una aguja de calibre 20 a 30 en la jeringa.

Deje que la biotinta se entrecruce y luego empuje la biotinta a través de la aguja para lograr filamentos de hidrogel extruidos suavemente. Si la formulación es capaz de crear un filamento con pocas o ninguna protuberancia, entonces está lista para la bioimpresión. Para cargar las preparaciones de biotinta en una bioimpresora, pipetee las biotintas en cartuchos de impresora esterilizados.

Déjelos reposar durante 30 minutos antes de la extrusión, ya que la biotinta se someterá a una reticulación espontánea de la primera etapa dentro del cartucho. A continuación, cargue el cartucho en la configuración de impresión y conecte una fuente de presión neumática al cartucho. Prepare un patrón simple, como esta cuadrícula de siete por siete milímetros de líneas paralelas, para imprimir con el fin de evaluar su compatibilidad de extrusión.

Mientras el cabezal de impresión se mueve en el plano XY a una velocidad de aproximadamente 300 milímetros por minuto, aplique una presión de 20 kilopascales al cartucho para extruir la biotinta. Si los materiales extruidos son grumosos o irregulares, reduzca la cantidad de reticulante agregado para ablandar el material reticulado de la etapa uno. Una formulación de biotinta debidamente preparada debe extruirse suavemente, lo que permite una deposición y arquitecturas precisas.

Prepare esferoides hepáticos de células primarias en 3D en una placa de 96 pocillos utilizando el método de gota colgante como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de tres días en cultivo, recoja los esferoides hepáticos de la placa colgante con una pipeta y transfiérelos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Deje que los esferoides se asienten en el fondo del tubo cónico durante uno o dos minutos.

A continuación, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta. Transfiera del 110 al 125 por ciento del volumen de construcción impreso en 3D deseado de la solución de biotinta de hidrogel recién preparada al tubo cónico que contiene los esferoides. A continuación, pipetee con cuidado los esferoides hacia arriba y hacia abajo para volver a suspenderlos en la solución de biotinta de hidrogel.

Una vez suspendida uniformemente, transfiera la solución esferoide a un cartucho de bioimpresora con una pipeta y deje que la solución se someta a la primera etapa de reticulación durante 30 minutos. Después de la etapa de reticulación, utilice un dispositivo de bioimpresión para crear las estructuras de hidrogel deseadas que contengan los esferoides hepáticos primarios. Después de cada capa de deposición, exponga la biotinta impresa a la luz ultravioleta durante dos a cuatro segundos para iniciar el mecanismo de reticulación secundario.

Esto estabilizará las construcciones y aumentará la rigidez al nivel deseado. La concentración de alquino PEG en la solución es lo que controla la densidad general de reticulación y, por lo tanto, controla principalmente la rigidez de la construcción final. Después de la bioimpresión, se observó una alta viabilidad celular en las construcciones hepáticas mediante microscopía confocal.

En condiciones ambientales óptimas, la viabilidad debe estar por encima del 85%Además, cuando los constructos se tiñeron para marcadores indicativos de tejido hepático, se observó la expresión positiva de CYP3A4, una isoforma del citocromo P450, albúmina intracelular, E-cadherina, una proteína de adhesión epitelial célula-célula, y DPP4, una proteína altamente expresada en el hígado. Cuando se analizaron los niveles de urea y albúmina en los medios de cultivo, se encontró que el constructo secretaba urea y albúmina a niveles constantes durante el curso de 14 días. Esto sugiere además que las biotintas de hidrogel específicas de cada tejido ayudan a mantener la función de las células hepáticas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas dos horas de principio a fin si se realiza correctamente. Sin embargo, esto a menudo depende del dispositivo de bioimpresión particular que se emplee. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los pasos demostrados a menudo deben adaptarse para que sean compatibles con otros tipos de tejidos o dispositivos de bioimpresión.

Siguiendo este procedimiento, se pueden crear otras formulaciones de biotintas de hidrogel para apoyar la bioimpresión de otros tipos de tejidos. El desarrollo de estas tecnologías ayudó a allanar el camino para la creación de plataformas multiorganoides de cuerpo en un chip para la detección de fármacos y el modelado de enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comenzar a diseñar materiales que se pueden usar para bioimprimir construcciones de tejido 3D mediante el uso de reticulación de varios pasos.

No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso para la visión, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas protectoras contra los rayos UV al realizar este procedimiento.