Summary
We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn verschillende technologieën beschikbaar komen die de behoefte aan alternatieve functionele organen en weefsels richt door te trachten vervaardigen of biofabricate, hen. Bioprinting heeft ontpopt als een van de meest veelbelovende van deze technologieën. Bioprinting kan worden gezien als een vorm van robotachtige additieve vervaardiging van biologische onderdelen, die kunnen worden gebruikt voor het in patroon levensvatbare orgelachtige of weefselachtige structuren op te bouwen of in 3 dimensies. 1 Meestal bioprinting gebruik van een 3-dimensionaal (3 D) drukinrichting die wordt bestuurd door een computer om cellen en biomaterialen in specifieke posities deponeren, waardoor recapituleren anatomisch lijkende fysiologische architecturen. 2 Deze inrichtingen druk een "bioink", in de vorm van cel aggregaten nemen cellen ingekapseld in hydrogels of viskeuze vloeistoffen of cel geplaatste microdragers, en celvrije polymeren die mechanische structuur of handeling verschaffen celvrije placeholders. 3,4 Na de bioprinting proces kan de resulterende structuur worden gerijpt in functionele weefsel of orgaan structuren, en worden gebruikt voor het beoogde doel applicatie. 5,6 Tot op heden, een complete volledig functionele human-sized orgel niet is afgedrukt, maar blijft de belangrijkste doelstelling op lange termijn van bioprinting onderzoek en ontwikkeling. 2 echter kleinschalige "organoïde" weefselconstructen momenteel in een aantal toepassingen, waaronder pathologie modellering, geneesmiddelenontwikkeling en toxicologische screening uitgevoerd.
Een van de belangrijkste obstakels dat onderzoekers hebben bij de toepassing bioprinting technologie is dat zeer weinig materialen zijn ontwikkeld voor de uitdrukkelijke bedoeling bioprinting. Om effectief te kunnen slagen in bioprinting, moet een biomateriaal voldoen 4 basisvereisten. Het biomateriaal moet 1) de passende mechanische eigenschappen afzetting mogelijk te maken (hetzij extrusie door een spuitmond van een gel of een inkjet als druppel), 2) het vermogen om zijn vorm als een component van een 3-D structuur na depositie houden, 3) de mogelijkheid voor handmatige instelling van de 2 voorgaande kenmerken, en 4) een cel vriendelijke en ondersteunende omgeving helemaal fasen van de bioprinting procedure. 7 Historisch gezien bioprinting werk is vaak geprobeerd om bestaande traditionele biomaterialen in bioprinting apparatuur worden zonder rekening te houden voor de verenigbaarheid ervan, in plaats van het ontwerpen van een biomateriaal om de eigenschappen die noodzakelijk zijn voor bioprinting en de daaropvolgende post-printing toepassingen.
Verschillende bioinks zijn recentelijk ontwikkeld om betere interface met de afzetting en fabricage hardware. Standard hydrogel systemen vormen grote problemen, omdat zij over het algemeen bestaan als hetzij voorloper vloeistof oplossingen met onvoldoende mechanische eigenschappen, of polymeriseren hydrogels die als ze worden geprint kunnen sproeiers verstopt raken of worden opengebroken op het extrusieproces. Ons team, evenals others, hebben verschillende hydrogel formuleringen om deze bioprinting problemen aan te pakken, zoals mobiele spheroïde afdrukken in hydrogel substraten, 5,8 cel en hydrogel filament extrusie uit microcapillaire buizen, 9-11 extrudeerbare hyaluronzuur (HA) -gold nanodeeltjes hydrogels met dynamische verknoping eigenschappen onderzocht , 12 temporele controle hydrogel stijfheid gebruik fotopolymeriseerbare gemethacryleerd HA en gelatine, 13 fibrinogeen trombine-gebaseerde verknoping, 14,15 ionenuitwisseling alginaat-collageen gels, 16 en recente snelle polymerisatie ultraviolet licht (UV) geïnitieerde verknoping, 17
Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van het genereren van materialen die effectief kan door bioprinted. Echter, naast integratie met hardware, succesvol genereren levensvatbare en functionele 3-D weefselconstructen moeten biomaterialen biochemische en mechanische signalen bevatten die helpen bij het handhaven cellulairelevensvatbaarheid en functie. Deze andere factoren, biochemische en mechanische profielen kunnen een significante invloed hebben op de succesvolle werking van bioprinted weefselconstructen hebben.
Zowel de natieve cellen en extracellulaire matrix (ECM) verantwoordelijk voor het presenteren van een groot aantal signaalmoleculen, zoals groeifactoren en andere cytokines naar andere cellen. De combinatie van deze signalen varieert van weefsel tot weefsel, maar uiterst krachtig en invloedrijk bij het reguleren cellen en weefsels gedrag. 18 Gebruikmakend weefselspecifiek ECM componenten van verschillende organen en uitvoeren als een hydrogel of als onderdeel van een hydrogel is verkend succes. 19-21 Deze benadering, die bestaat uit decellularizing een bepaald weefsel, verpulveren, en te lossen, kan worden gebruikt om weefsel-specifieke biochemische signalen produceren van elk weefsel en 3-D hydrogel constructen kunnen worden opgenomen. 22
DaarnaastHet is uitvoerig gedocumenteerd dat weefsels in het lichaam innemen uiteenlopende stijfheden. 23 Als zodanig is de mogelijkheid om af te stemmen de mechanische eigenschappen van biomaterialen, zoals elasticiteitsmodulus E 'of shear elasticiteitsmodulus G', is een nuttig hulpmiddel weefselmanipulatie . Zoals hierboven beschreven controle bioink mechanische eigenschappen maakt extruderen gebaseerde biofabrication met een zachte gel, die dan verder door secundaire crosslinking kan gemanipuleerd op een later tijdstip, waarop elasticiteitsmodulus niveaus kunnen worden bereikt die overeenkomen met dat van het doelorgaan. Bijvoorbeeld zou biomaterialen worden aangepast om een stijfheid van 5-10 kPa passen als een native lever 23 of pas een stijfheid van 10-15 kPa zoals natief hartweefsel, 24,25 theoretisch verhogen van het vermogen van deze organoids in functioneren op soortgelijke wijze als hun eigen weefsel tegenhangers. De invloed van de stijfheid van het milieu op cel fenotype heeft exp geweestlored afgelopen jaren, met name wat betreft stamcellen. Engler et al. Toonden aan dat substraat elasticiteit geholpen bij het stimuleren mesenchymale stamcellen (MSC) naar lineages met weefsel elasticiteit als dat van het substraat. 25 Dit concept is verder onderzocht differentiatie in spieren, hartfunctie, lever fenotype, hematopoietische stamcel proliferatie en onderhoud van stamcellen therapeutisch potentieel. 24,26-29 Het kunnen afstemmen op een hydrogel verschillende elasticiteitsmoduli is een belangrijk kenmerk van een biomateriaal die wordt gebruikt om weefselconstructen biofabricate. 30
Hier beschrijven we een protocol dat een veelzijdige benadering in ons laboratorium een hydrogel systeem extrusie kan worden bioprinted formuleren voorstelt, en 1 maat) bevatten biochemische profiel van een bepaald type weefsel en 2) bootsen de elastische modulus van deze weefseltype . Door het aanpakken van deze eisen, willen we provide een materiaal dat de fysiochemische en biologische eigenschappen van in vivo kan herhalen weefsel. 31 De modulaire hydrogel samengesteld dat hierin wordt beschreven maakt gebruik van een multi-verknopende benadering extrudeerbaar bioinks geven, en houdt een tweede verknoping te stabiliseren en verhoogt de stijfheid van de eindproducten verschillende weefseltypen passen. Biochemical maatwerk wordt voldaan door met behulp van weefsel-specifieke ECM componenten. Als een demonstratie, in dienst nemen we een lever-specifieke verscheidenheid van deze hydrogel systeem om functionele lever organoïde constructen Bioprint. De beschreven protocol maakt gebruik van een aangepaste 3-D bioprinting apparaat. In het algemeen kan dit protocol worden aangepast aan de meeste extrusie gebaseerde printers, printvereisten parameters variëren sterk voor alle typen inrichtingen en vereisen onderzoek door de gebruiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel Bioink formuleringen en Voorbereiding
- Om weefselspecifieke biochemische bieden bereiden weefselspecifieke ECM verteren oplossingen zoals eerder beschreven voor de lever. 20
Opmerking: In het algemeen zal deze ECM digest 40% van het uiteindelijke hydrogel bioink volume dat wordt gebruikt omvatten. Honderden ml ECM digest oplossing kan worden bereid, in porties verdeeld en ingevroren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. - Vóór formulering hydrogel lossen een foto-initiator, 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiofenon, in water van 0,1% w / v.
Opmerking: De volumes in de 50-100 ml bereik kan van tevoren worden voorbereid en opgeslagen afgeschermd van licht bij 4 ° C gedurende enkele maanden. - Om hydrogel bioinks te vormen, eerst op te lossen het basismateriaal componenten uit de hyaluronzuur (HA) hydrogel kits in het water-foto-initiator-oplossing.
- Los de gethioleerde HA en gethioleerde gelatine afzonderlijk in water-photoinitiator oplossing (stap 1,2) tot 2% te w / v oplossing.
- Ontbinden polyethyleenglycoldiacrylaat (PEGDA), de crosslinker in de hydrogel kits, in water-fotoinitiator oplossing (stap 1,2) een 8% w / v oplossing.
- Ontbinden polyethyleenglycol (PEG) 8-Arm alkyn (10 kDa) in water-fotoinitiator oplossing (stap 1,2) een 8% w / v oplossing.
- In het algemeen vormen hydrogels met behulp van het volgende schema, hoewel er meer maatwerk mogelijk is.
- Combineer 4 delen 2% gethioleerde HA, 4 delen 2% gethioleerde gelatine, 1 deel crosslinker 1, 1 deel crosslinker 2 met 8 delen weefsel ECM-oplossing en 2 delen hepatocyt cultuur media (HCM) (of 10 delen water als een generieke non-weefsel -specifieke hydrogel).
Let op: Extra ongewijzigde HA of gelatine kan worden toegevoegd aan de bioink extruderen soepeler te maken. Dit wordt hieronder beschreven.
- Combineer 4 delen 2% gethioleerde HA, 4 delen 2% gethioleerde gelatine, 1 deel crosslinker 1, 1 deel crosslinker 2 met 8 delen weefsel ECM-oplossing en 2 delen hepatocyt cultuur media (HCM) (of 10 delen water als een generieke non-weefsel -specifieke hydrogel).
- Vortex het verkregen mengsel op hoge (snelheid 10 van 10) gedurende 10 seconden te mengen voor gebruik. </ Li>
- Gebruik van hydrogel bioink
- Voor extrusie of bioprinting testen, breng het mengsel in een spuit of printer cartridge en laat deze spontaan verknopen gedurende 30 minuten (stap 1 verknoping) bij 37 ° C.
- Voor reologische metingen, breng het mengsel in een 35 mm petrischaal en laat het verknopen gedurende 30 min.
Opmerking: Het mengsel begint onmiddellijk verknopen door de vorming thiol-acrylaat binding en zal beginnen te stijgen viscositeit. Het mengsel dient binnen 10 minuten overgebracht naar een injectiespuit, inktpatroon of doellocatie verstopping van een pipet of spuitje tijdens de overdracht te voorkomen. - Als secundaire crosslinking (fase 2) is gewenst, bestralen het stadium 1-verknoopte gels met ultraviolet licht (365 nm, 18 W / cm 2) een thiol-alkyn polymerisatiereactie te initiëren.
Opmerking: duur van de bestraling is afhankelijk van het oppervlak van het materiaal. In het algemeen een vierkante centimeter materiaal vereist slechts 1-2 sec UV blootstelling bij deze UV energie.
2. Printer Compatibility Testing
- Voorafgaand aan integratie testen met bioprinting apparaten, test-extrusie-eigenschappen op het laboratorium bank met eenvoudige extrusie testen met behulp van standaard spuiten en kleine naald tips (20-30 meter).
- Duw de bioink via een standaard injectiespuit soepel geëxtrudeerde filamenten van hydrogel met weinig of geen oneffenheden bereiken. Extruderen van lijnen of eenvoudige patronen is voldoende om succes te bepalen.
- Voor bioprinter integratie, laadt bioink voorbereidingen door pipetteren ze in printer cartridges en laat 30 min voor de bioink spontane fase 1 verknoping binnen de cartridge te ondergaan.
Opmerking: volume van bioink afhankelijk van de specifieke toepassing en moet worden bepaald door de gebruiker. Printer cartridges kunnen lijken op of zijn injectiespuiten die compatibel zijn met de bioprinter apparaat. - Evalueer extrusie compatibiliteitvoor bioprinting door het afdrukken van een eenvoudig patroon met behulp van de bioink. Zo drukt u een 7 x 7 mm patroon bestaat uit parallelle lijnen. Toepassen druk (bijvoorbeeld 20 kPa pneumatische druk) terwijl de printkop beweegt in het XY-vlak met een snelheid van ongeveer 300 mm / min.
Opmerking: Printkop nozzle diameters van verschillende afmetingen kan worden gebruikt, maar kegelvormige mondstukken met 400-500 pM diameter openingen zijn optimaal voor het afdrukken van sferoïden in het bereik 250-350 urn.- Als de geëxtrudeerde materialen zijn klonterig of onregelmatig, zie stap 2.4, of het bedrag van PEGDA terug te brengen tot het stadium 1 verknoopte materiaal te verzachten. Goed voorbereid bioink formuleringen extruderen soepel, waardoor nauwkeurige afzetting in de gewenste patronen of architecturen.
Opmerking: De bioprinting procedures beschreven een aangepaste 3-D bioprinting inrichting uitgevoerd huis speciaal voor weefselconstruct afdrukken 32 Als zodanig printvereisten parameters variëren sterk voor alle typen inrichtingen en vereisen testin.g Door de gebruiker.
- Als de geëxtrudeerde materialen zijn klonterig of onregelmatig, zie stap 2.4, of het bedrag van PEGDA terug te brengen tot het stadium 1 verknoopte materiaal te verzachten. Goed voorbereid bioink formuleringen extruderen soepel, waardoor nauwkeurige afzetting in de gewenste patronen of architecturen.
- Ter verbetering extrusie-eigenschappen, vullen ongemodificeerde gelatine HA en de bioinks (1,5 mg / ml en 30 mg / ml).
3. Validatie van Bioprinting met primaire leverkanker constructen
- Bereid 3-D bolletjes primaire cel lever door opknoping druppel methoden zoals de mobiele component 33
Opmerking: Bioprinting kan worden uitgevoerd zonder sferoïden, maar met individuele cellen gesuspendeerd in de hydrogel bioinks ook. Sferoïden worden hier gebruikt om cel-cel interacties versnellen en construeren functionaliteit. Het aantal sferoïden of cellen gebruikt afhankelijk van de specifieke toepassing en moet worden bepaald door de gebruiker. Deze stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden met steriele levering.- HCM bereiden door de ontdooide inhoud van de HCM supplement componentenkit toevoegen aan de hepatocyten basale media (HBM) en steriele filtering.
- Ontdooi het supplement componenten until vloeistof.
- Voeg het supplement componenten (ascorbinezuur, 0,5 ml; runderserumalbumine [vetzuurvrij], 10 ml; gentamicinesulfaat / amfotericine B, 0,5 ml, hydrocortison 21-hemisuccinaat, 0,5 ml, insuline, 0,5 ml; humane recombinante epidermale groeifactor , 0,5 ml; doorvoeren, 0,5 ml) aan de 500 ml HBM.
- Steriel filter door middel van een 0,45 pm of 0,22 pm filter met behulp van een fles-top filter eenheid of een spuit tip filter.
- Bepaal de celdichtheid van primaire humane hepatocyten, Kupffer cellen en stellaatcellen door telling op een hemocytometer na elk celtype werd ontdooid volgens de instructies van de fabrikant.
- Combineer primaire humane hepatocyten, Kupffer cellen en stellaatcellen per 80:10:10 verhouding van het aantal cellen in HCM media die is verwarmd tot 37 ° C in een conische buis.
Opmerking: De hoeveelheid te gebruiken media afhankelijk van het totale aantal cellen die specifiek zijn voor de toepassing en moet worden bepaald door The gebruiker. - Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 520 x g bij 20 ° C.
- Zuig het supernatant met achterlating de celpellet.
- Resuspendeer de celpellet in HCM media een celsuspensie met 1000 cellen per 40 ul medium werd verkregen. Totale volume is afhankelijk van het aantal sferoïden geproduceerd.
- Breng de celsuspensie 96 putjes hangende druppel platen. Voeg een totaal van ongeveer 1000 cellen per putje in HCM en handhaven op 37 ° C in 5% CO2 gedurende 3 dagen waarin multicellulaire sferoïden te vormen.
- Verzamel lever sferoïden van de opknoping druppel plaat met behulp van een pipet. Transfer naar een steriele 15 ml conische buis.
- HCM bereiden door de ontdooide inhoud van de HCM supplement componentenkit toevoegen aan de hepatocyten basale media (HBM) en steriele filtering.
- Bioprint lever sferoïden in de lever-specifieke hydrogel bioink
- Bereid een preparaat van lever-ECM bevattende hydrogel bioink zoals beschreven in stap 1, in dienst 8% PEGDA en 8% 8-arm PEG alkyn als verknopingsmiddelen. Gebruik deze combinatie voor zijn vermogen in resulting in een hydrogel dicht in shear elasticiteitsmodulus om native leverweefsel.
- Laat de bolletjes naar de bodem van de conische buis waarin deze in stap 3.1.7 werd geplaatst. Dit is afhankelijk van bolvormige grootte en dichtheid, maar in het algemeen plaatsvindt binnen 1-2 min. Verwijder alle media door voorzichtig opzuigen of met een pipet.
- Breng de gewenste hoeveelheid vers bereide hydrogel bioink oplossing van het conische buis met de sferoïden. In het algemeen, een geschikt volume 10% -25% groter dan het volume van de 3-D construct te drukken. pipet voorzichtig op en neer om de bolletjes opnieuw in suspensie in de hydrogel bioink oplossing. Overdragen aan een bioprinter cartridge met behulp van een pipet of serologische pipet.
- In de bioprinter cartridge, laat de oplossing de eerste trap verknoping (thiol-acrylaat reactie) ondergaan 30 min.
Opmerking: Afhankelijk van sferoïde grootte kan de patroon moet langzaam worden geroteerd of de inhoud moet worden gemengd meteen steriele spatel om de sferoïden verspreid over het bioink tijdens de fase 1 verknoping houden. Dit is minder noodzaak bioinks bereid met gesuspendeerde cellen in plaats van sferoïden.
Opmerking: Na stadium 1 verknoping, gebruikers een werkvenster van enkele uren. Echter, is het raadzaam om de bioprinting proces snel uit te voeren om levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. - Na stadium 1 verknoping, gebruikt een inrichting bioprinting gewenste hydrogel structuren die de primaire lever sferoïden (of andere cellen) te creëren.
Opmerking: Deze technologie verschaft een systeem voor biofabricating uiteenlopende structuren. Parameters zoals het totale volume, aantal cellen of sferoïden, de gedrukte structuur geometrie en substraat waarop constructen zijn gedrukt zijn sterk afhankelijk van de doelen van de gebruiker. - Na afzetting in de gewenste configuratie toedienen UV licht gedurende 2-4 seconden om de secundaire crosslinking mechanisme initiëren, stabiliserende constructs en verhogen de stijfheid op het gewenste niveau.
Opmerking: De concentratie van PEG-alkyn, en dus tot de totale verknopingsdichtheid, regelt voornamelijk de eindconstructie stijfheid. - Herhaal de stappen 3.2.4 en 3.2.5 om meerlaagse constructies maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer de bovenbeschreven procedures correct worden gevolgd, hydrogels een biochemisch profiel specifiek het doelweefsel, behelzen, 20 zorgen voor een hoge mate van controle over bioprinting en laatste elasticiteitsmodulus, 34 en steunen functionele levensvatbare cellen in weefselconstructen.
hydrogel Customization
Om zo goed mogelijk na te bootsen natieve lever, werd de hydrogel bioink aangevuld met lever ECM oplossingen en een groeifactor Array, 20 ECM oplossingen bevatten een groot aantal groeifactoren en cytokinen (in pg / ml, Figuur 1A). Deze omvatten BDNF (BDNF), bFGF, bot morfogenetisch proteïne 5 (BMP-5), FGF-4, insuline-achtige groeifactor bindend eiwit 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF , FGF-7, groeihormoon (GH), heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HB-EGF), HGF en neurotrophin 3 (NT-3). Daarnaast ECM-oplossingen bevatten aanvullende structurele componenten, die worden geanalyseerd door colorimetrische assays. 20 Want lever ECM-oplossingen, totale collageen inhoud van de lever ECM-oplossingen was 91,33 ± 0,58 mg / ml, de elastine inhoud was 189,33 ± 48,40 mg / ml, en de glycosaminoglycan (GAG) gehalte bedroeg 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figuur 1B).
Hydrogel bioink mechanische eigenschappen kunnen worden gekarakteriseerd met een afschuifspanning sweep-test (0,6-10 Pa, trillingsfrequentie 1 Hz) reometer. 10,12,13,34 Doordat spontane fase 1 thiol-acrylaat chemie optreedt bij een neutrale pH, een zachte hydrogel met een G 'van 113,66 ± 22,59 Pa gevormd. Na aanvang van de etappe 2 thiol-alkyn verknoping door UV fotopolymerisatie, G 'stijgt tot ongeveer 10 kPa (10.637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), nabootsen leverweefsel elasticiteit. Extra manipulatie van de concentraties, molecuulgewichten en geometrieën van crosslinkers kunnen uiteenlopende fase 2 G "-waarden te bereiken. 34
Kwaliteit van bioprinted hydrogel
Chemische strategie en implementatie van fase 1 en fase 2 verknoping van de hydrogel bioinks is beschreven in figuur 2. In het algemeen verknopingsmiddelen zoals Extralink, die gebaseerd zijn op geacryleerde PEG polymeren spontaan reageren met thiolgroepen op de HA- en gelatine ketens in neutrale pH (stap 1) in aanwezigheid van cellen aan een zachte extrudeerbare hydrogel. Deze zachte hydrogel kan worden bioprinted als bioink, waarna UV licht gebruikt om fotopolymerisatie ongereageerde thiolen en de secundaire crosslinkers op basis van PEG-alkyn gemodificeerde polymeren initiëren. De bijzondere molecuulgewichten en geometrie van de crosslinkers gaanvern het einde stijfheid van de bioprinted construct. A 7 x 7 mm patroon werd geïmplementeerd voor testdoeleinden (figuur 3A). Aanvankelijke tests toonden aan dat de initiële formuleringen extrudeerbare, maar leek onregelmatig en samengeklonterd tijdens en na extrusie (Figuur 3B). Extrusie eigenschappen te verbeteren, HA-gemodificeerde gelatine en aangevuld tot de bioinks (1,5 mg / ml en 30 mg / ml). De verbeterde soepele gedrukte structuur wordt getoond in figuur 3C.
Levensvatbaarheid en de basisfunctie van bioprinted primaire menselijke lever constructies
Met de 3-D bioprinter de bioactieve levergerichte hydrogel bioink gebruikt te integreren en primaire menselijke lever sferoïden, vooraf bereid door opknoping druppel culturen op plastic dekglaasjes deponeren. Afgedrukt op plastic dekglaasjes toegestaan robuuste hantering en transfer naar verschillende celkweek omgevingen. Na bioprinting, high levensvatbaarheid van de cellen in de lever constructen werd waargenomen na Live / DEAD de levensvatbaarheid / cytotoxiciteit kleuring en confocale microscopie (Figuur 4A). Onder optimale omgevingsomstandigheden levensvatbaarheid moet hoger zijn dan 85%. Primaire humane hepatocyten algemeen als gevoelig voor mechanische en chemische belasting die enkele optimalisatie omgevingsvariabelen vereist.
Na bioprinting en verificatie van levensvatbaarheid kan extra lever constructen die in cultuur gebracht worden beoordeeld door het analyseren functionaliteit media monsters verwijderd op dag 3, dag 7, dag 10 en dag 14 voor analyse van uitgescheiden ureum en albumine. Ureum colorimetrische assays wijzen op een betrekkelijk constant niveau van ureum secretie uit de lever constructen via 14 dagen tijdsverloop en bleef tussen 15 en 20 ng / ml (Figuur 4B). Geconstateerd ureum niveaus waren niet significant verschillend van elkaar op de verschillende tijdstippenpunten. Het menselijke albumine ELISA-test blijkt dat albumine productie van de constructen blijft relatief constant over tijd stabiel blijven tussen 125 en 140 ng / ml (Figuur 4C). Bovendien, wanneer gekleurd voor merkers indicatief leverweefsel, positieve expressie van intracellulaire albumine, CYP3A4 (een cytochroom P450-isovorm betrokken op het metabolisme), E-cadherine (epitheliale cel-celadhesie eiwit) en dipeptidylpeptidase-4 (een proteïne uitgedrukt hoogst in de lever) worden waargenomen (Figuur 4D-F). Samengevat, deze leefbaarheid en functionele gegevens suggereren dat de weefselspecifieke hydrogel bioink helpt bij het handhaven van de levensvatbaarheid en functie van bioprinted primaire cellen gebaseerde constructen lever.
Figuur 1. Hydrogel component karakterisering en stijfheid beoordeling. A) Groeifactor encytokine analyse van proteomics arrays voor ECM-oplossingen bereid uit lever. B) Colorimetrische assay kwantificering van collageen, glycosaminoglycan en elastine inhoud in de lever ECM-oplossingen. C) Demonstratie van de mogelijkheid om bioink stijfheid te beheersen. Na stadium 1 verknoping, de gel is relatief zacht en kunnen vlot worden geëxtrudeerd. Na stap 2 verknoping door UV-licht, elasticiteitsmodulus stijgt met meer dan een orde van grootte, nabootsen leverweefsel elasticiteitsmodulus. Fout balken geven de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. gebruikmakend van meerdere PEG-gebaseerde vernetters voor de extrusie bioprinting en controle over weefsel construeren mechanische eigenschappen. Strategie formulering van afdrukbare bioinks bestaat uit acrylaat gebaseerde vernetters (crosslinker 1), alkyn-gebaseerde crosslinkers (crosslinker 2), gethioleerde HA, gethioleerde gelatine, tissue ECM materialen, en niet-gemodificeerde HA en gelatine. De bioink wordt bereid en spontaan verknoopt door middel van thiol-acrylaat binding, wat resulteert in een zacht, extrudeerbaar materiaal. Bioprinting wordt uitgevoerd. Tenslotte worden de bioprinted lagen gesmolten gestabiliseerde en de lever elasticiteitsmodulus gebracht. Dit proces kan worden herhaald om multi-gelaagde structuren te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Bioprinting testen van bioinks. A) een 7 x 7 mm wikkelpatroon werd voor bioink extrusietestING in de bioprinter. B) De eerste formulering van een PEGDA en 8-arm PEG alkyn bioink resulteerde in onregelmatige afzetting. C) Het toevoegen van rauwe HA en gelatine verbeterde extrusie, wat resulteert in een soepele extrusie van de bioink. Schaal bar -. 1 mm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Demonstratie van de levensvatbaarheid en de functie van de lever sferoïden bioprinted in de lever-specifieke hydrogel bioink. A) De uitvoering van de lever bioink voor bioprinting, resulteerde in hoge levensvatbaarheid van constructies. Green - calceïne AM-gekleurde levensvatbare cellen; Rood - ethidiumhomodimeer gekleurde dode cellen B) Ureum en C) albumine uitgescheiden door de lever constructen meer dan 14 d.ays in cultuur, gekwantificeerd door colorimetrische en ELISA assays, respectievelijk. Error bars geven de standaarddeviatie. Immunokleuring van markers geassocieerd met leverweefsel: D) CYP3A4, E) Intracellulaire albumine en F) DPP4 en E-cadherine. Groen of rood - aangegeven vlek; Blue -. DAPI Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende componenten die essentieel zijn om te overwegen wanneer u probeert om biofabricate 3-D weefsel constructies, voor eventuele toepassing bij de mens of voor in vitro screening toepassingen. Onder toepassing van de geschikte cellulaire componenten bepaalt het einde mogelijke functionaliteit, terwijl de biofabrication apparaat zelf bepaalt de algemene methode voor het bereiken van het einde construct. De derde component, het biomateriaal, is net zo belangrijk, omdat het dient dubbele rol. Specifiek dient het biomateriaal component verenigbaar met zowel de biofabrication hardware (bijv bioprinters) en ondersteunt de potentieel kwetsbare biologische cel componenten. Optimaliseren beide eisen kan moeilijk zijn, zo bioprintable materialen dienen verschillende belangrijke parameters aan: 1) beschikken over voldoende chemische, mechanische en temporele eigenschappen efficiënte en onbelast printing vergemakkelijken; 2) levensvatbaarheid steun cel tijdens de voorbereiding etappes en bioprinTing procedure; 3) en een gastvrije omgeving die levensvatbaarheid van de cellen en de uiteindelijke weefsel construct functie na de bioprinting beste verbetert. Wij gebruiken de modulaire hydrogel bioink systeem de hier beschreven voldoen aan deze eisen beschreven methode. Ten eerste door het opnemen groeifactoren, collagenen, GAG en elastins afgeleid van de ECM van een bepaald weefseltype, we kunnen een biochemisch profiel doet denken aan het type doelweefsel bereiken. Ten tweede, door gebruik 2 vergelijkbare, maar onafhankelijk verknopingsreacties kunnen wij een zachte extrudeerbaar materiaal dat compatibel is met de meeste extrusie gebaseerde, die verder kan worden gewijzigd terwijl de tweede verknopingsstap een bepaald materiaal elasticiteitsmodulus die overeenkomt met een doel te bereiken bereiken weefsel van de keuze. 34
De kritische eigenschap van dit systeem dat het nuttig maakt, is de mogelijkheid om meerdere chemische reacties die kunnen worden aangewend om de polyme manipuleren ondersteunenrization kinetiek en mechanische eigenschappen van het bioink systeem. Door toepassing van 2 onafhankelijke reactietype, thiol-acrylaat en thiol-alkyn bereiken we de mogelijkheid om een fase 1 thiol-acrylaat reactie die resulteert in een zacht materiaal dat kan worden geëxtrudeerd door een injectiespuit of bioprinting apparaat en een fase 2 thiol voeren -alkyne reactie, die alleen bij UV belichting wordt geïnitieerd in aanwezigheid van een fotoinitiator, waarbij de elastische modulus van het uiteindelijke construct bioprinted bepaalt. Deze meerdere stappen tot een bioprintable materiaal. Daarom, teneinde een stabiele bioink die extrusie en daaropvolgende elasticiteitsmodulus voorbeeld ondersteunt, onderhouden deze afzonderlijke reactietypen bereiken is belangrijk.
De primaire loting voor het gebruik van het systeem voor de biofabrication is het gemak op maat, dat door wordt gedaan, hetzij het manipuleren van het einde elasticiteitsmodulus via de secundaire crosslinker, of door middel van integratie van de verschillende weefsel afgeleide ECM materialen of groeifactor cocktails. De ECM in weefsels bevat verschillende groeifactoren en andere cytokines, die vaak variëren globale verdeling tussen weefseltypen. Wij geloven dat deze factoren integraal te handhaven functie van bepaalde celtypen, zoals primaire humane hepatocyten. Toepassing van dit concept is eerder aangetoond dat de levensvatbaarheid en functie van primaire humane hepatocyten in gehepariniseerde hyaluronzuur sandwich culturen. 20 toenemen Door heparine ketens in de hydrogel met heparine-bindende groeifactoren en andere ECM componenten uit de lever ECM konden we deze lever-specifieke biochemische profiel primaire humane hepatocyten, behoud levensvatbaarheid en functie in vitro gedurende langere tijd te presenteren. Deze benadering kan eenvoudig worden uitgebreid tot andere weefseltypes, waardoor onderzoekers herhaling van deze weefselspecifieke factoren bereiken door decellularizing solubiliseren en andere weefsels.
tent "> Gebruikers moeten zich ervan bewust dat terwijl de basis componenten van dit bioink systeem in bioprinting geïmplementeerd eerder, 10,12,17 maar in minder genuanceerd, weefsel specifieke benaderingen, evenals een aantal andere regeneratieve geneeskunde toepassingen, 35- 45 biofabrication niet geprobeerd voor alle weefseltypen. Daarom kan er enige verdere ontwikkeling en probleemoplossing nodig zijn om dergelijke aanvullende weefselconstructen creëren. kan echter een modulair systeem zoals hier beschreven, zeer goed kunnen worden aangepast. Andere potentiële beperkingen omvatten natuurlijke affiniteit dat sommige celtypen vermoedelijk richting specifieke biomaterialen. over het algemeen hebben we gevonden dat het hyaluronzuur, gelatine en PEG-gebaseerde basiscomponenten van het hydrogel systeemondersteuning levensvatbare kweken van diverse celtypes, maar er kunnen sommige typen cellen die beter gemanipuleerde omgevingen met verschillende samenstelling, zoals collageen, die als intrinsieke vezelachtige na heeft uitgevoerdtuur, of elastine, die van nature meer elastisch. Als zodanig tegenprestatie voor de optimale materiaal voor een bepaald weefseltype en eindtoepassing belangrijk, en de hydrogel bioink systeem hier beschreven ongeschikt voor gebruik zijn. Bovendien is het belangrijk de omstandigheden waaronder bioprinting uitgevoerd overwegen. Tijdens de ontwikkeling van dit protocol, we overgestapt uit de buurt van de omgevingstemperatuur (kamertemperatuur) omstandigheden met behulp van bioinks zonder mobiele media, die leiden tot een slechte levensvatbaarheid als de voorbereiding en het afdrukken tijd ook, tot een snellere protocollen onder 37 ° C met behulp van bioinks werd uitgesponnen met mediacomponent die cellevensvatbaarheid enorm toegenomen.Tot voor kort werden enkele materialen of materiaal systemen speciaal ontwikkeld om te communiceren met bioprinting systemen. Hierdoor meeste materialen zijn simplistisch, benutten hetzij de biologische kenmerken van cellen te ondersteunen, of hun verenigbaarheid met biofabricationhardware. Er zijn maar weinig materialen zijn optimaal in beide gebieden. De in deze methode beschreven systeem ontkoppelt deze kenmerken, waardoor de aanpassing van de biologische karakterisering toestaan, terwijl het vergemakkelijken van de mechanische eigenschappen die nodig zijn voor de extrusie bioprinting. Een extra onderscheid van het hydrogel bioink systeem is dat het zowel biochemische en fysische parameters van de doelweefsels wordt het gebruikt biofabricating kunnen nabootsen. Dit ondersteunt een indrukwekkende flexibiliteit, waardoor herhaling van de biochemische factoren bijna elk weefsel, alsook bijbehorende de elastische modulus van elke zacht weefsel. De aandacht voor deze beide aspecten van een weefsel zijn zelden onderzocht in tandem.
De modulaire aard van deze technologie verschaft een flexibiliteit in een breed scala aan toepassingen worden uitgevoerd. De mogelijkheid om verschillende weefseltypen nabootsen biedt de mogelijkheid om niet alleen lever constructen als voorbeeld in dit werk biofabricate, maar constructs die veel van de andere weefsels in het lichaam. Misschien wel de meest duidelijke brede toepassing met deze parameters is de mogelijkheid om beide aspecten koppelen aan een bepaald weefsel de tastend gemanipuleerde constructen optimaliseren echte toepassingen zoals implantatie of geneesmiddel en toxicologische screening. Terwijl genereren van humane formaat weefsels voor implantatie in patiënten is het einddoel vele onderzoekers vanwege wettelijke barrières, cel inkoop en beperkingen van het vermogen om functionele vasculatuur fabriceren in weefsel gemanipuleerde organen, dit verheven doel verdere ontwikkeling en tijd vergen te realiseren. Maar technologieën zoals hier beschreven methode moment beginnen te worden uitgevoerd voor het genereren van "organoids" in vitro platforms. Ons team, evenals anderen, momenteel gebruik organoïde biofabrication om modelsystemen waarin toxicologische studies worden uitgevoerd creëren. Bovendien kunnen dergelijke organoids worden ombestuderen pathologieën en progressie van de ziekte, zoals kanker, 46 en testen potentiële therapeutische behandelingen. Tenslotte ondersteunt het systeem ook andere belangrijke toepassing. Door het manipuleren van deze parameters onafhankelijk van elkaar kunnen onderzoekers fundamentele wetenschappelijke experimenten uit te voeren om het relatieve belang van de biochemische versus mechanische factoren bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs dankbaar financiering door de Defense Threat Reduction Agency (DTRA) onder Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Contract No. N6601-13-C-2027 te erkennen. De publicatie van dit materiaal niet de goedkeuring door de regering van de bevindingen of conclusies hierin vormen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
