Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Resumen

Este manuscrito proporciona el procedimiento detallado de la inyección de la arteria ilíaca (IIA), una técnica para administrar células cancerosas específicamente a los tejidos de las extremidades posteriores, incluidos los huesos, para establecer metástasis óseas experimentales. Aunque inicialmente se estableció con modelos de tumores de mama, este protocolo puede extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer.

Resumen

La inyección intra-ilíaca (AII) es un enfoque eficiente para introducir lesiones metastásicas de diversas células cancerosas en animales. En comparación con las inyecciones intracardíacas e intratibiales ampliamente utilizadas, la inyección de IIA aporta varias ventajas. En primer lugar, puede administrar una gran cantidad de células cancerosas específicamente a los huesos de las extremidades traseras, proporcionando así eventos de colonización en etapa temprana sincronizados espacio-temporalmente y permitiendo una cuantificación robusta y una detección rápida de las células tumorales diseminadas. En segundo lugar, inyecta células cancerosas en la circulación sin dañar los tejidos locales, evitando así los procesos inflamatorios y de cicatrización de heridas que confunden el proceso de colonización ósea. En tercer lugar, la inyección de IIA causa muy poco crecimiento metastásico en los órganos no óseos, lo que evita que los animales sucumban a otras metástasis vitales y permite la monitorización continua de las lesiones óseas indolentes. Estas ventajas son especialmente útiles para la inspección de la progresión de células cancerosas individuales a micrometástasis multicelulares, que ha sido en gran medida difícil de alcanzar en el pasado. Cuando se combina con enfoques de vanguardia de imágenes biológicas e histología ósea, la inyección de IIA se puede aplicar a diversos fines de investigación relacionados con las metástasis óseas.

Introducción

Metástasis representan más del 90% de las muertes causadas por tumores sólidos. El hueso es el órgano más frecuentemente afectado por la metástasis de varios tipos de cáncer, especialmente de mama y de próstata. Cuando se diagnostica en la clínica, las metástasis óseas por lo general ya han entrado en etapas avanzadas, ya sea con o osteolíticas osteoblásticas alteraciones en el hueso, a menudo acompañadas con síntomas neurológicos.

Los estudios anteriores se centraron principalmente en las metástasis óseas osteolíticas abiertas ^1-3, sin embargo, actualmente hemos comprensión de micrometástasis en los huesos limitado antes de la aparición del proceso de osteolítica. Esto es al menos en parte debido a la falta de modelos y enfoques experimentales apropiadas. Modelos de ratones genéticamente modificados de cáncer de mama a menudo metástasis a los pulmones, pero mucho menos eficientemente a los huesos ^4. Del mismo modo, los tumores trasplantados ortotópicamente raramente desarrollan metástasis óseas espontáneas, con un poco de 4T1 carcinom mamaria hueso-tropicaluna sub-clones y MSP sobreexpresa PYMT modelo de ratón transgénico como excepciones ^5-7. Perforación Intra-tibial puede entregar las células del cáncer a los huesos ^8-10, sino que también incurre en el daño y la inflamación de los tejidos locales. Actualmente inyección intracardiaca de líneas celulares de cáncer de mama ha sido el enfoque principal para investigar la colonización hueso ^11-13. Sin embargo, después de las células cancerosas se introducen en ventrículo izquierdo sólo una proporción limitada finalmente alcanzará hueso y médula ósea, lo que hace difícil realizar un seguimiento de metástasis microscópicas de una forma cuantificable.

En este estudio, hemos establecido una técnica, a saber, la arteria intra-ilíaca (IIA) de inyección ^14, para entregar selectivamente las células cancerosas en los tejidos de las extremidades traseras, enriqueciendo así las células cancerosas en la médula y la médula ósea sin causar daño a los tejidos locales. Debido a la especificidad de hueso, este enfoque también permite tiempo suficiente para que las células de cáncer indolente para colonizar el tiempo antes de la unaimals sucumben a los tumores primarios o metástasis en otros órganos vitales. Cuando se combina con una variedad de otras técnicas, tales como imágenes de bioluminiscencia, la tinción de inmunofluorescencia y la histomorfometría ósea, la inyección IIA es potencialmente útil para una amplia gama de fines de investigación relacionadas con la metástasis en los huesos, especialmente el seguimiento de la progresión de las células cancerosas individuales a múltiples celdas micrometástasis. En particular, hemos demostrado que la inyección IIA nos permite visualizar las interacciones entre las células de cáncer y varios tipos de células que rodea en el microambiente de la médula.

Protocolo

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo a las directrices del cuidado de animales de la Facultad de Medicina Baylor.

1. Preparación de la célula

Nota: Las diferentes líneas celulares de cáncer se pueden utilizar para la inyección IIA dependiendo de los propósitos de investigación. Hemos utilizado líneas celulares de cáncer de mama MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 y línea celular de cáncer de próstata C4-2 en nuestra investigación. Utilizamos típicamente tanto las buenas prácticas agrarias y las células de cáncer de luciferasa de luciérnaga marcado para nuestro estudio y mostramos aquí algunos datos de la línea celular MCF7 marcado con GFP-luciferasa.

1. Mantener las células en DMEM que contenía 10% de FBS y 0,1 mg / ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO _2.
2. Antes de la inyección IIA, trypsinize células en 80 a 90% de confluencia con una solución / EDTA 0,25% de tripsina. Utilice PBS fría para lavar las células dos veces, y volver a suspender las células en 10 ml de PBS para el recuento celular. Para eliminar de PBS, centrifugar las células a 800 xg durante 5 min.
3. células resuspendera una concentración de 5 x 10 ⁶ células / ml en PBS enfriado en hielo.
4. Utilice 100 l GFP y las células de cáncer de luciferasa de luciérnaga marcado para la inyección de AII de un ratón.
   Nota:. Por lo tanto, el número de células recibidas por cada animal es 5 x 10 ⁵ puede necesitar ser modificado en base a la agresividad de las líneas celulares de este número.
5. Mantenga las suspensiones de células en hielo.
   Las vibraciones pueden ser necesarios para evitar la agregación de células cada pocos minutos hasta que esté listo para la inyección: nota. Para algunas líneas celulares (tales como MDA-MB-231), pueden ser necesarios procedimientos más estrictos (por ejemplo, pasan a través de 45 micras filtro de células) para evitar la agregación. Tenga en cuenta que la obstrucción de los vasos puede causar necrosis de los tejidos, y por lo tanto confundiendo a los experimentos.

2. Preparación de los animales

1. Para el tratamiento del dolor de los animales, dar 5 mg / kg / día carprofeno (u otro analgésico) con suplemento dietético para los ratones no menos de 24 horas antes de la cirugía. Administraruna dosis de 0,1 mg / ml de buprenorfina por vía subcutánea 60 minutos antes de la cirugía. Nota: es un procedimiento opcional para implantar palet estradiol en la parte posterior de animales para proporcionar estradiol adicional. Esto acelerará el cultivo de células ER + cáncer (por ejemplo, las células MCF-7) ^9.
2. Anestesie A 4 - 6 semanas de edad de ratón (aproximadamente 20 g) con ketamina (80 - 100 mg / kg) y xilazina (10 -12,5 mg / ml) mediante inyección intraperitoneal.
3. Para confirmar el nivel adecuado de sedación de un ratón de 20 g por pizca dedo del pie y la observación de una reducción del 50% en la frecuencia respiratoria y rosa membranas mucosas (por ejemplo, la piel de oreja de ratón y la piel de la pata). Mantener el seguimiento de estos signos vitales cada 15 minutos durante la cirugía. Nota: No movimiento del animal indica que el animal es suficientemente anestesiado y listo para la cirugía.
4. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
5. Afeitar el ratón en el bajo vientre, en especial la zona de la ingle derecha, donde la cirugía y la inyeccióntener lugar.
   Nota: Esto no es necesario si se utilizan ratones desnudos atímicos.
6. Ponga el ratón sobre su espalda, separar las patas en sus posiciones naturales y se adhieren a los dedos de los pies de cartón disección móvil con cinta.
7. Limpie el área de la ingle derecha con hisopos de algodón estériles empapadas etanol isopropílico 70%, seguido con betadine lavado quirúrgico varias veces.

3. La vena ilíaca común y la arteria Localización y Separación

1. Hacer una incisión en la piel de 1,0 - 1,2 cm de largo entre el 4 ^y 5 ^de los pezones en el abdomen inferior derecho utilizando Nº 10 de carbono cuchillas de bisturí de acero estériles, celebrada en un mango Nº 3. A continuación, utilice un paño quirúrgico estéril para cubrir el cuerpo de un animal, excepto el sitio de la incisión.
2. Mover el animal al estándar del banco microscopio de disección de la parte superior. Utilice un aumento de 4X para inyección.
3. Bajo 4X aumento del microscopio de disección, insertar unas pinzas romas de separación entre el tejido adiposo y el peritoneum, y empujar los tejidos hacia el exterior en ambos lados para exponer los vasos ilíacos y nervios (ver Figura 1).
   Nota: La arteria aorta entre de la línea media y la parte inferior de ramas de la arteria se denomina arteria ilíaca común. Aquí es donde la inyección se lleva a cabo.
4. Utilice un par de pinzas finas rectas de romper el tejido conectivo (como una membrana) entre los vasos y el nervio, más cerca de los vasos.
5. Cambiar las pinzas finas directamente a la mano izquierda. Coge un par de pinzas finas en ángulo utilizando la mano derecha. Inserte las pinzas mano derecha en misma posición en la que los tejidos conectivos se han roto. Y luego pegar las pinzas de la mano derecha a través, por debajo de los vasos.
6. Al mismo tiempo, insertar la pinza de la mano izquierda en los tejidos conectivos en el lado izquierdo de los vasos para guiar la pinza de la mano derecha pasando.
7. Una vez que la pinza de la mano derecha coge por debajo de los vasos, tratar de separar los vasos de la TI que rodeaN ú mero un poco más, y luego mantenerlos en la parte superior de la pinza de la mano derecha.
8. El uso de fórceps de la mano izquierda para entregar la punta de una sutura de seda 4-0 a la pinza de la mano derecha, y luego tirar de la sutura suave y lentamente, por debajo de los vasos. Nota: Ahora los dos vasos arteriales y venosos comunes son levantados por la sutura (ver Figura 2).

4. La inyección y post-inyección de Cuidado

1. Preparar las células para la inyección en una jeringa de insulina 31G. Utilice 100 l de suspensión celular en PBS por inyección. Asegúrese de que la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las células y evitar la agregación de modo que las células inyectadas no va a obstruir y bloquear el flujo de sangre.
2. Con las pinzas en ángulo en la mano izquierda, coloque la pinza por debajo de los vasos a lo largo de la dirección de la sutura, y luego abrir las dos ramas de la pinza, que tiene los vasos mantenidas con cuidado de las pinzas.
   Nota: El intervalo entre los dos brazos de la pinza será el iEl sitio njection.
3. Mantenga la aguja de 31 G con 100 l de suspensiones celulares en la mano derecha, con el bisel de la aguja hacia arriba, listo para la inyección.
4. Insertar la aguja en la luz de la arteria (sangre entrará en la punta de la aguja). A continuación, empuje suspensión celular lentamente en inyectar las células. La suspensión celular se alejar la sangre roja en el recipiente. Trate de no romper los vasos o escape, la suspensión de células a cabo.
5. Una vez finalizada la inyección, tire suavemente la aguja y mantener la celebración de los vasos sobre la pinza de la mano izquierda para detener el sangrado. Luego de alejarse de la sutura.
6. Apartarse del fórceps de la mano izquierda, y utilizar rápidamente un hisopo de algodón para presionar el área de la incisión de la arteria para detener el sangrado.
   Nota: Por lo general, de 5 - 10 min presión continua es suficiente para detener el sangrado.
7. Cuando el sangrado se detiene, el uso de pegamento de piel para cerrar los bordes de la piel de la zona de la cirugía. Hacer una marca auricular, y comprobar si hay señalización para examinar la distribución de las células inyectadas bioluminiscencia.
   Nota: Una inyección con éxito dará lugar a una imagen similar a la Figura 3.
   1. Compruebe señalización bioluminiscencia mediante la inyección de 100 l 15 mg / luciferina ml en PBS a 75 mg / kg de concentración del ratón a través del seno intra-orbital.
      1. Para la inyección intra-orbital, coloque los dedos en ambos lados de los ojos del ratón, use presión para hacer que la bola del ojo poco se salga del marco ojo, insertar 28 g agujas de jeringas de insulina entre la bola del ojo y la nariz, y luego empujar lentamente la jeringa para inyectar luciferina .
         Nota: en la posición correcta, la aguja debe ser capaz de alcanzar una profundidad de 2 - 3 mm antes de golpear los tejidos duros (hueso).
      2. Coloque el ratón en el sistema de formación de imágenes para formación de imágenes in vivo todo animal para el 10 - 60 seg dentro de 5 min (véase la figura 3).
         Nota: Un procedimiento opcional es la implantación de pellets de estradiol en la parte posterior de animales para proporcionar estradiol adicional. Esto acelerará el crecimiento de células ER + cáncer (por ejemplo, MCF-7células) ^15.
8. Deje el ratón sobre una almohadilla térmica caliente hasta que despierte. Supervisar el sangrado, hinchazón, signos de dehiscencia y el dolor durante el período post-quirúrgico. Ponga los ratones de nuevo a la jaula con cobertura analgésica (suplemento dietético carprofin sugirió) dada para el manejo del dolor hasta que no haya signos de dolor. Prestar mucha atención y cuidado de los animales durante 7 días después de la cirugía.

5. Control de Crecimiento metastásico

1. histomorfometrıa:
   1. Cosecha del tumor que lleva tejidos óseos, fijar los huesos en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, luego se descalcifica en pH de la solución de EDTA 7,0 14% durante 3 - 5 días, y someterlas a parafina incrustación como se ha descrito previamente ^14.
   2. Sección de los tejidos óseos en parafina incrustar en el espesor de 3 micras y realizar método histológico estándar de tinción con hematoxilina / eosina como se ha descrito previamente ^14.
2. Immunohistochemistratar:
   1. Asunto hueso portador de un tumor embebidos en parafina se desliza a inmunohistoquímica tinción para diversos fines, como se describe anteriormente ^14. Brevemente, las células de cáncer immunostain MCF7 por los anticuerpos anti-GFP, y las células osteogénicas inmunotinción (pre-osteoblastos y osteoblastos) por anticuerpos anti-osterix y anticuerpos anti-fosfatasa alcalina (ALP), respectivamente.

Resultados

La Figura 1 ilustra la localización anatómica y la relación de la arteria ilíaca común (rojo) y la vena (azul).

La figura 2 muestra la posición relativa de los vasos ilíacos y nervios en el microscopio de disección. Como se representa en la figura 2A, los vasos y los nervios están justo debajo de la pared peritoneal y pueden ser reveladas después de la incisión de la piel se h...

Discusión

Aunque sólo la arteria ilíaca es el objetivo de la inyección de las células cancerosas, se recomienda la separación de ambos vena iliaca y la arteria de los tejidos circundantes, y para levantarlos juntos como un paquete. Esto se debe a la vena y la arteria ampliamente contacto entre sí, y la pared del vaso venoso es delgada y es fácil de romper. Por lo tanto, para que una inyección de éxito, que ahorra tiempo y esfuerzo para sostener los dos vasos juntos, aunque se inyectan células cancerosas sólo a la arteria. Una sut...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Estreptococo Anvatirina B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Solución de tripsina/EDTA	HyClone	SH30042.01
45 y mu; Filtro de células M	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF con carprofeno	Artículo controlado de la atención veterinaria en BCM		Para el manejo del dolor
Buprenorfina	Artículo controlado de la atención veterinaria en BCM		Para el manejo del dolor
Pellet de estradiol	Investigación innovadora de América	SE-121
Ketamina y xilacina	Artículo controlado de la atención veterinaria en BCM
Ungüento veterinario	Artículo controlado de la atención veterinaria en BCM		Evite la sequedad de los ojos
Afeitadora	Oster	78005-050	Para ratones peludos
etanol isopropílico	ACROS	67-63-0
Betadine exfoliante quirúrgico	Artículo controlado de atención veterinaria en hojas de
#10	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Mango
múltiple n.º 3	Ted Pella, Inc	541-31	Necesita ser esterilizado en autoclave
Paño quirúrgico estéril	de infusión	SaiPSS-SD1
Pinzas rectas	Instrumento quirúrgico Roboz	RS-5132	Necesita ser esterilizado en autoclave
Pinzas finas rectas	Fine Science Tools	11253-20	Necesita ser esterilizado en autoclave
Pinzas finas con bordes	Fine Science Tools	11253-25	Necesita ser esterilizado en autoclave
4-0 Sutura de seda Vicryl	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G jeringas de insulina	BD	328418	Hisopos múltiples
algodón con hisopos (estériles)	VWR International Laboratory	89031-272
Pegamento para la piel	Henry Schein Animal Health	31477	Para el cierre de la piel en el lugar de la cirugía
Aplicador de crotales	Fine Science Tools	24220-00
Crotales	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferina	Gold Biotechnology	LUCK	Evite la luz y ponga en hielo
Jeringas de insulina de 28 g	BD	329410	Para inyección intraorbital
Paraformadehído	Alfa Aesar	30525-89-4	Para la fijación de tejidos
EDTA	OmniPur	4050	Para la decalcificación de tejido óseo
< strong>Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Dissection Microscopio		Leica Leica S6E estéreo
IVIS Lumina II	Visión
Molecular AvanzadaName	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Anticuerpos
Anticuerpos anti-GFP (JL-8)	Clontech	632381
Anticuerpos anti-ALP	Abcam	ab108337
Anti-Osterix anticuerpos	Abcam	ab22552