Introduction
حساب الانبثاث لأكثر من 90٪ من الوفيات الناجمة عن الأورام الصلبة. العظم هو الجهاز الأكثر شيوعا تتأثر الانبثاث من أنواع السرطان المختلفة، وخاصة سرطان الثدي وسرطان البروستات. عندما تم تشخيصها في العيادة، الانبثاث العظام عادة قد دخلت مراحل متقدمة مع إما الحالة للعظم أو بانية العظم تغيرات في العظام، وغالبا ما يترافق مع أعراض عصبية.
الدراسات السابقة ركزت في معظمها على العلنية الانبثاث العظام عظمية 1-3، ولكن نحن حاليا محدودة فهم micrometastases في العظام قبل بداية عملية الحالة للعظم. هذا هو على الأقل جزئيا بسبب عدم وجود نماذج والنهج التجريبية المناسبة. نماذج الماوس المعدلة وراثيا من سرطان الثدي غالبا ما metastasize إلى الرئتين، ولكن بكفاءة أقل بكثير من العظام 4. وبالمثل، فإن الأورام المزروعة orthotopically نادرا ما تتطور الانبثاث العظام عفوية، مع بعض العظام الاستوائية 4T1 carcinom الثدييةلاستنساخ الفرعية وMSP overexpressed PyMT نموذج الفأر وراثيا كما استثناءات 5-7. داخل عظام الساق الحفر يمكن أن يحقق الخلايا السرطانية في العظام 10/08، لكنها تتحمل أيضا الضرر والتهاب الأنسجة المحلية. حاليا تم الحقن داخل القلب من خطوط خلايا سرطان الثدي النهج الرئيسي تحقيق العظام الاستعمار 11-13. ومع ذلك، بعد أن يتم إدخال الخلايا السرطانية في البطين الأيسر فقط ونسبة محدودة تصل أخيرا العظام ونخاع العظام، مما يجعل من الصعب تتبع الانبثاث المجهري بطريقة قابلة للقياس الكمي.
في هذه الدراسة، ونحن إنشاء تقنية، وهي شريان داخل الحرقفي (IIA) حقن 14، لتقديم انتقائي الخلايا السرطانية في الأنسجة هند أطرافهم، وبالتالي إثراء الخلايا السرطانية في العظام ونخاع العظم دون أن تسبب الضرر لأنسجة المحلية. نظرا لخصوصية العظام، وهذا النهج أيضا يسمح الوقت الكافي لخلايا السرطان كسلان لاستعمار في نهاية المطاف قبل لimals تستسلم لالأورام الأولية أو الانبثاث في الأعضاء الحيوية الأخرى. عندما جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من التقنيات الأخرى، مثل التصوير تلألؤ بيولوجي، وتلطيخ المناعي وhistomorphometry العظام، حقن IIA مفيد محتملة لنطاق واسع من أغراض البحوث المتعلقة الانبثاث العظام، وخاصة لتتبع التقدم من الخلايا السرطانية واحدة إلى متعددة الخلايا micrometastases. على وجه الخصوص، أثبتنا أن حقن IIA تمكننا من تصور التفاعلات بين الخلايا السرطانية وأنواع مختلفة من الخلايا المحيطة في المكروية العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم كل عمل الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من كلية بايلور للطب.
1. خلية التحضير
ملاحظة: خطوط الخلايا السرطانية مختلفة يمكن استخدامها لحقن IIA باختلاف أغراض البحث. وقد استخدمنا خطوط خلايا سرطان الثدي MCF7، 4T1، 4T07، MDA-MB-361، MDA-MB-231، MDA-MB-436 وسرطان البروستاتا خط الخلية C4-2 في بحثنا. ونحن عادة استخدام كل GFP- واليراع الخلايا السرطانية المسمى وسيفيراز لدراستنا وتظهر بعض البيانات هنا من خط خلية MCF7 المسمى GFP-luciferase المراسل.
- الحفاظ على الخلايا في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.1 ملغ / مل البنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- قبل الحقن IIA، يعرض للتريبسين الخلايا في 80-90٪ التقاء مع 0.25٪ التربسين حل / EDTA. استخدام برنامج تلفزيوني البارد لغسل خلايا مرتين، وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني لمدة عد الخلايا. لإزالة برنامج تلفزيوني، وخلايا الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايابتركيز 5 × 10 6 خلية / مل في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- استخدام 100 ميكرولتر GFP- ويراعة الخلايا السرطانية المسمى وسيفيراز للحقن IIA من الماوس واحد.
ملاحظة: ولذلك، فإن عدد الخلايا التي كتبها كل حيوان تلقى هو 5 × 10 5 قد تحتاج إلى تغييرها بناء على عدوانية من خطوط الخلايا هذا العدد. - حافظ على تعليق خلية على الجليد.
قد تكون هناك حاجة الاهتزازات لمنع تراكم الخلايا كل بضع دقائق حتى انها مستعدة للحقن: ملاحظة. بالنسبة لبعض خطوط الخلايا (مثل MDA-MB-231)، قد تكون هناك حاجة إلى إجراءات أكثر صرامة (على سبيل المثال، ويمر من خلال 45 ميكرومتر مصفاة الخلية) لمنع التجميع. يرجى ملاحظة أن تسد الأوعية قد يسبب نخر الأنسجة، وبالتالي ارباك التجارب.
2. إعداد الحيوان
- لإدارة الألم الحيوان، وإعطاء 5 ملغ / كغ / يوم كاربروفين (أو غيرها من مسكن) مع المكملات الغذائية للفئران ما لا يقل عن 24 ساعة قبل الجراحة. إدارةجرعة من 0.1 ملغ / مل تحت الجلد البوبرينورفين 60 دقيقة قبل الجراحة. ملاحظة: إجراء اختياري هو زرع استراديول البليت في الجزء الخلفي من الحيوانات لتوفير استراديول إضافية. هذا وسوف تسريع تنمو من خلايا ER + السرطان (على سبيل المثال، قدم مكعبة-7 خلايا) 9.
- تخدير 4-6 الاسبوع الماوس القديم (حوالي 20 غراما) مع الكيتامين (80-100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 -12.5 ملغم / لتر) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
- تأكيد المستوى المناسب من التخدير على فأرة الحاسوب 20 غراما من قرصة أخمص قدميها، ومراقبة وتخفيض 50٪ في معدل التنفس وردي الأغشية المخاطية (مثل الجلد الماوس الأذن والجلد مخلب). حافظ على مراقبة هذه العلامات الحيوية كل 15 دقيقة أثناء الجراحة. ملاحظة: لا حركة الحيوانات تشير إلى أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية وعلى استعداد لإجراء عملية جراحية.
- استخدام البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف.
- حلق الماوس على أسفل البطن، وبخاصة في منطقة الفخذ اليمنى حيث سوف الجراحة وحقنتجري.
ملاحظة: هذا ليس من الضروري إذا تم استخدام الفئران عارية athymic. - ضع الماوس على ظهرها، ونشر الساقين في مواقعها الطبيعية والتمسك أصابع القدم إلى الكرتون تشريح المحمول مع الشريط.
- مسح منطقة الفخذ اليمنى مع 70٪ من الإيثانول الأيسوبروبيل غارقة قطعة قطن معقمة، ثم مع betadine فرك الجراحية عدة مرات.
3. الوريد الحرقفي المشترك والشريان الموقع والفصل
- جعل شق الجلد من 1،0-1،2 سم طويلة بين ال 4 و 5 تشرين الحلمات في البطن السفلي الأيمن باستخدام العقيمة، # 10 الكربون الصلب ريش مشرط الذي عقد في مقبض رقم 3. ثم استخدام ثنى الجراحية المعقمة لتغطية جسم الحيوان باستثناء موقع شق.
- نقل الحيوانات إلى مقاعد البدلاء القياسية كبار تشريح المجهر. استخدام التكبير من 4X للحقن.
- تحت 4X التكبير للمجهر التشريح، وإدراج ملقط فصل حادة بين الأنسجة الدهنية وperitoneuم، ودفع الأنسجة الخارج على كلا الجانبين لفضح الأوعية الحرقفية والأعصاب (انظر الشكل 1).
ملاحظة: يسمى الشريان الأبهر بين من خط الوسط والجزء السفلي من فروع الشريان الشريان الحرقفي المشترك. هذا هو المكان الذي يأخذ حقن مكان. - استخدام زوج واحد من ملقط غرامة على التوالي لاختراق النسيج الضام (مثل غشاء) بين السفن والأعصاب، وأقرب إلى السفن.
- تبديل ملقط غرامة على التوالي في اليد اليسرى. الاستيلاء على زوج من ملقط غرامة الزاوية باستخدام اليد اليمنى. إدراج ملقط اليد اليمنى في نفس الموقف حيث تم كسر الأنسجة الضامة. وبعد ذلك عصا ملقط اليد اليمنى من خلال، تحت السفن.
- في نفس الوقت، إدراج ملقط اليد اليسرى في الأنسجة الضامة على الجانب الأيسر من السفن لتوجيه ملقط اليد اليمنى يمر بها.
- مرة واحدة ملقط اليد اليمنى يحصل تحت السفن، في محاولة للفصل بين السفن من منظمة الشفافية الدولية المحيطةssue أكثر قليلا، ثم الاحتفاظ بها على رأس ملقط اليد اليمنى.
- استخدام ملقط اليد اليسرى لتقديم غيض من خياطة 4-0 الحرير إلى ملقط اليد اليمنى، ثم سحب الخيط بلطف وببطء من خلال تحت السفن. ملاحظة: الآن يتم رفع كل من الوريد والشريان السفن المشتركة من قبل خياطة (انظر الشكل 2).
4. حقن وبعد حقن العناية
- إعداد الخلايا لحقن الأنسولين في حقنة 31 G. استخدام 100 ميكرولتر من تعليق خلية في برنامج تلفزيوني في الحقن. تأكد من ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لفصل الخلايا وتجنب التجميع بحيث حقن الخلايا لا تسد ومنع تدفق الدم.
- مع ملقط الزاوية في اليد اليسرى، ووضع ملقط تحت السفن على طول توجيهات خياطة، ثم قم بفتح الأسلحة اثنين من ملقط، وجود سفن عقد بلطف على ملقط.
ملاحظة: ستكون الفترة الزمنية الفاصلة بين أحضان ملقط يكون طموقع njection. - عقد إبرة G 31 مع 100 تعليق خلية ميكرولتر في اليد اليمنى، مع شطبة من الإبرة إلى أعلى، وعلى استعداد للحقن.
- ادخال الإبرة في تجويف الشريان (لن يدخل الدم طرف الإبرة). ثم دفع تعليق خلية ببطء في لحقن الخلايا. سوف تعليق خلية دفع بعيدا الدم الحمراء في وعاء. ليس محاولة لكسر الأوعية أو تسرب تعليق خلية بها.
- عند الانتهاء من الحقن، وسحب بلطف الى الوراء الإبرة وإبقاء السفن التي تصل على ملقط اليد اليسرى لوقف النزيف. ثم سحب بعيدا خياطة.
- سحب بعيدا ملقط اليد اليسرى، وبسرعة استخدام قطعة من القطن للضغط على منطقة شق الشريان لوقف النزيف.
ملاحظة: عادة 5-10 دقيقة الضغط المستمر هو ما يكفي لوقف النزيف. - عندما يتوقف النزيف، استخدام الغراء الجلد لإغلاق حواف الجلد من منطقة الجراحة. جعل الأذن علامة، والتحقق من تلألؤ بيولوجي يشير إلى دراسة توزيع حقن الخلايا. <ر /> ملاحظة: حقن ناجحة سيؤدي في صورة مشابهة الشكل 3.
- تحقق تلألؤ بيولوجي الإشارات عن طريق الحقن من 100 ميكرولتر 15 ملغ / مل وسيفيرين في برنامج تلفزيوني في 75 ملغم / كغم من تركيز الماوس عن طريق الجيوب الأنفية داخل المداري.
- للحقن داخل المداري، وضع الأصابع على جانبي العين الفأر، واستخدام الضغط لجعل كرة العين البوب قليلا الخروج من إطار العين، إدراج 28 G إبر حقنة الأنسولين بين كرة العين والأنف، ثم دفع حقنة لحقن وسيفيرين ببطء .
ملاحظة: في الموضع الصحيح، وينبغي أن تكون الإبرة قادرة على الوصول إلى عمق 2-3 ملم قبل أن تصل الأنسجة الصلبة (العظام). - ضع الماوس في نظام التصوير في الجسم الحي التصوير الحيوانية كامل ل10-60 ثانية في 5 دقائق (انظر الشكل 3).
ملاحظة: لإجراء اختياري هو زرع استراديول بيليه في الجزء الخلفي من الحيوانات لتوفير استراديول إضافية. هذا وسوف تسريع نمو الخلايا ER + السرطان (على سبيل المثال، قدم مكعبة-7خلايا) 15.
- للحقن داخل المداري، وضع الأصابع على جانبي العين الفأر، واستخدام الضغط لجعل كرة العين البوب قليلا الخروج من إطار العين، إدراج 28 G إبر حقنة الأنسولين بين كرة العين والأنف، ثم دفع حقنة لحقن وسيفيرين ببطء .
- تحقق تلألؤ بيولوجي الإشارات عن طريق الحقن من 100 ميكرولتر 15 ملغ / مل وسيفيرين في برنامج تلفزيوني في 75 ملغم / كغم من تركيز الماوس عن طريق الجيوب الأنفية داخل المداري.
- ترك الماوس على وسادة التدفئة الحارة حتى يستيقظ. مراقبة النزيف، تورم، علامات تفزر والألم خلال فترة ما بعد الجراحة. وضع الفئران إلى قفص مع تغطية مسكن (اقترح المكملات الغذائية carprofin) نظرا لإدارة الألم حتى لا علامات الألم. إيلاء اهتمام وثيق والرعاية لهذه الحيوانات خلال 7 أيام بعد الجراحة.
5. رصد النقيلي النمو
- Histomorphometry:
- حصاد الورم تحمل أنسجة العظام، وإصلاح العظام في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة، ثم يزيل الكلس عليها في الرقم الهيدروجيني 7.0 14٪ حل EDTA لمدة 3 - 5 ايام، ويعرضهم لالبارافين تضمين كما سبق وصفه (14).
- قسم الأنسجة العظمية تضمين البارافين في سمك 3 ميكرون وتنفيذ طريقة النسيجي القياسية من الهيماتوكسيلين / يوزين تلطيخ كما هو موضح سابقا (14).
- Immunohistochemisمحاولة:
- يخضع جزءا لا يتجزأ من البارافين الورم تحمل العظم الشرائح لالمناعية تلطيخ لأغراض مختلفة كما هو موضح سابقا (14). لفترة وجيزة، immunostain الخلايا السرطانية MCF7 بواسطة أضداد GFP، والخلايا المكونة للعظم immunostain (قبل بانيات وبانيات) بواسطة أضداد Osterix وأضداد الفوسفاتيز القلوية (ALP)، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل 1 الموقع التشريحي وعلاقة الشريان الحرقفي المشترك (الأحمر) والوريد (الأزرق).
ويبين الشكل 2 الموقف النسبي للسفن الحرقفي والأعصاب تحت المجهر تشريح. كما هو مبين في الشكل 2A، والأوعية والأعصاب هي حق تحت الجدار البريتوني ويمكن كشفت بعد إجراء شق الجلد ويتم الضغط على الغشاء البريتوني بعيدا. الوريد الحرقفي المشترك على اليسار، وأكبر وأكثر قتامة مقارنة الشريان. الشريان هو في الوسط، وتبدو وردية اللون. ومن أرق من الوريد ولكن لديه أكثر سمكا الجدار العضلي. الوريد والشريان موازية ومرتبطة بشكل وثيق مع بعضها البعض. أبعد على اليمين هو العصب قطني عجزي الأبيض. الشكل 2B يظهر الأوعية الحرقفية المشتركة فصلها عن الأنسجة المحيطة الضام والعضلات والأعصاب، ورفعت من قبل 4-0 الحرير خياطة. وأشار أيضا الحرقفي المشترك الوريد، الشريان، وقطني عجزي العصبية.
ويبين الشكل 3 ممثل في الجسم الحي وخارج الحي الصور تلألؤ بيولوجي من حيوانات بعد حقن الشريان الحرقفي البينية. كانت تدار خمسة × 10 5 خلايا MCF7 المسمى GFP-وسيفيرين في 100 ميكرولتر من أطرافهم هند الأيمن من الماوس عن طريق حقن الشريان الحرقفي البينية. ثم تدار D-وسيفيرين من داخل المدار حقن الجيوب الأنفية، وتليها في الجسم الحي كله التصوير تلألؤ بيولوجي الحيوان. وقد أثرى الخلايا MCF7 حقن في أطرافهم هند الأيمن للفأرة كما يتضح من الإشارات تلألؤ بيولوجي (الشكل 3A). تم تعقب في الجسم الحي إشارات تلألؤ بيولوجي الحيوان كله كل 3 أيام أو كل أسبوع، وبعد ذلك تم حصاد أنسجة العظام الماوس في اليوم 14 بعد الحقن عندما وصلت كلها إشارة تلألؤ بيولوجي الحيوان عتبة معينة (الفوتون تدفق> 10 4). بعد تناوله-D وسيفيرين، وأنسجة العظام من الشريان الحرقفي داخل الماوس حقنه تم حصاد بسرعة ومغمورة في برنامج تلفزيوني لخارج الجسم الحي التصوير. إشارة تلألؤ بيولوجي قوية من الشريان الحرقفي داخل ضخت العظام الخلفية اليمنى ولكن ليس من العظام السيطرة الأيسر أظهرت توطين معين من حقن الخلايا (الشكل 3B).
ويبين الشكل 4 صور تمثيلية من تلطيخ النسيجي ومناعي. عندما كانت تحصد الورم تحمل العظام، أنهم تعرضوا لتثبيت امتصاص العرق، EDTA زوال الكلس، ثم البارافين التضمين. تم إعداد ثلاثة ميكرون شرائح العظام وأجريت معيار H & E تلطيخ. كانت مثل حصاة كبيرة خلايا التعاقد مع نواة أكبر MCF7 المجهري الآفات المنتشر في أنسجة العظام بعد 14 يوما حقن الشريان الحرقفي البينية، كما يتبين من السهام الحمراء. نخاع العظم (BM ) وكبيرة الوردي العظام تربيقية مسطحة (TB) مع نواة متفرق وذلك المسمى (الشكل 4A). ويبين الشكل 4B خلايا MCF7 GFP المسمى (الأخضر)، وبانيات المسمى ALP (أحمر في الصورة اليسرى)، وOsterix المسمى قبل بانيات (الحمراء في الصورة على اليمين) بعد تلوين مناعي. يشير اللون الأزرق تلطيخ دابي النواة.
وتظهر تشريح الشريان الحرقفي المشترك (الأحمر) والوريد (الأزرق) في الماوس الشريان الأورطي البطني، الشريان الحرقفي المشترك، خارجي الشريان الحرقفي، والشريان الفخذي على النحو المبين: الشكل 1. يتم تنفيذ الحقن في الشريان الحرقفي المشترك من الشريان الأورطي نحو الاتجاه الشريان الفخذي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن الصفحات = "1"> 
الشكل 2: الأوعية والأعصاب الحرقفي تحت المجهر تشريح القياسية مع التكبير 4X (أ) صورة من السفن سليمة والأعصاب. (ب) صورة من السفن رفعت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الممثل في الجسم الحي وخارج الحي الصور تلألؤ بيولوجي من الماوس بعد حقن الشريان الحرقفي البينية. (أ) في الجسم الحي إشارة تلألؤ بيولوجي من حق كل الحيوانات بعد الحقن. (ب) خارج الجسم الحي إشارة تلألؤ بيولوجيمن العظام سيطرة اليسار واليمين حقن العظام من الحيوانات المحقونة التي تم حصادها بعد 14 يوما. تم قياس كل من إشارات تلألؤ بيولوجي باتباع الإجراء والإعدادات الموصى بها الشركة المصنعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور الممثل تلطيخ النسيجي ومناعي. (أ) الممثل H & E صورة تلطيخ الورم MCF7 تحمل أنسجة العظام بعد حقن الشريان الحرقفي البينية. شريط النطاق = 25 ميكرون. ملاحظة: سعادة تلطيخ ليست وسيلة فعالة للكشف عن الأورام. في أقل التكبير، سعادة تلطيخ ليست حساسة بما يكفي للتمييز بين الأورام. في أعلى التكبير، فإنه ليست فعالة لمسح كل لرياس. (ب) مناعي الصور تلطيخ من MCF7 ورم الأنسجة تحمل العظم. الخضراء: خلايا MCF7 GFP المسمى، الأحمر في الصورة اليسرى: بانيات المسمى ALP، الأحمر في الصورة الصحيحة: Osterix المسمى قبل بانيات. يشير اللون الأزرق تلطيخ دابي النواة. شريط النطاق = 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن فقط الشريان الحرقفي هو الهدف من حقن للخلايا السرطانية، ونحن نوصي فصل كل من الوريد الحرقفي والشريان من الأنسجة المحيطة بها، ورفع لهم معا كحزمة واحدة. وذلك لأن الوريد والشريان الاتصال على نطاق واسع مع بعضها البعض، وجدار الوعاء الدموي الوريدي رقيقة وسهلة للكسر. ولذلك، من أجل حقن ناجحا، فإنه يوفر الوقت والجهد لاستيعاب ما يصل السفينتين معا، على الرغم من أن يتم حقن الخلايا السرطانية فقط إلى الشريان. ويستخدم خياطة 4-0 الحرير للمساعدة في هذه العملية كما هو موضح في الشكل (2). وخياطة قد تساعد أيضا في وقف النزيف في حال حدوثه.
معظم خطوات حقن IIA تحتاج إلى أن يقوم تحت المجهر تشريح. الأوعية الماوس ناعمة وصغيرة، مما يجعل إجراءات صعبة. ومع ذلك، بعد ممارسة كافية، يمكن أن نسبة النجاح تصل إلى 90-100٪ في تجربتنا.
مع هذه التقنية، قد يكون الباحثونبلي لإنشاء نماذج الاستعمار العظام من نماذج الخلايا السرطانية المفضلة لديهم، بما في ذلك تلك التي يعتقد تقليديا "غير النقيلي". تمثل MCF-7 الخلايا، مثال على ذلك. في الواقع، عند وصوله إلى المكروية العظام، MCF-7 الخلايا الخضوع لالسكون قصيرة قبل أن تقلع لاستعمار. وقد تم الكشف عن عدد قليل جدا من الانبثاث العظام عفوية في الحيوانات التي تحمل مثلي قدم مكعبة-7 xenografts. ومع ذلك، الفشل قد يؤدي أيضا من كمية المتبقية من الخلايا السرطانية نشرها، والشروع البطيء للاستعمار، ونمو أكثر عدوانية من الأورام مثلي (التي تقتل الحيوانات قبل العظمية يمكن تأسيس). وبالتالي، عدم الكشف لا يمكن أن يؤخذ كدليل ضد القدرة MCF-7 الخلايا على metastasize. في الواقع، قد يكون كسلان أو حتى نائمة micrometastases العظام أكثر انتشارا في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي البشري، كما اقترح السكون التي كتبها سنوات إلى العقود التي غالبا ما ينظر في العيادة.
حقن IIA يمكن تطبيقها ليس فقط للومينال أو خلايا سرطان الثدي القاعدية، ولكن أيضا لأنواع السرطان الأخرى مثل سرطان البروستاتا. عندما جنبا إلى جنب مع خيارات مختلفة من أمراض العظام مراقبة التقنيات، يمكن حقن الشريان الحرقفي داخل إسهاما كبيرا في العديد من الأغراض البحثية. نحن عادة استخدام تلألؤ بيولوجي يشير إلى تتبع الانبثاث العظام التقدم بعد حقن الشريان الحرقفي البينية، ثم الحصاد العظام الحاملة للورم لتلطيخ المناعية الفلورسنت لتحديد التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمحيطة منافذ المكروية العظام. histomorphometry العظام 16-17 و18-20 μCT يمكن استخدامها لتقييم التغيرات بنية العظام وغيرها من التفاصيل التشريحية للعظام التي تنتج عن تلقيح خلايا السرطان. وينبغي تحديد اعتبارات الملائمة ومجموعات كل مجموعة لغرض الأبحاث الخاصة بها.
على غرار داخل عظام الساق 8-10 وداخل القلب التلقيح 11-13، والتحذير من داخل ايلIAC حقن الشريان هو أنه لا ألخص الخطوات الأولى في عملية المنتشر قبل الانسداد ودخول الخلايا السرطانية في الدورة الدموية. من الناحية المثالية، وهي عملية الانبثاث عفوية بدءا من الأورام مثلي ستكون هناك حاجة إلى تلخيص كامل شلال ورم خبيث. ومع ذلك، فإن هذه العملية غير فعالة للغاية في معظم النماذج، مع استثناءات قليلة مثل بعض العظام مدار 4T1-استنساخ الفرعية 5-6 وMSP overexpressed PyMT نموذج الفأر وراثيا 7. نأمل أن حقن IIA تقديم رؤى جديدة في عملية الاستعمار العظام، والتي يمكن بدورها أن تيسر تصميم وتطوير كفاءة حقا نماذج الانبثاث العظام عفوية لدراسات ما قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Ell, B., Kang, Y.
- Kretschmann, K. L., Welm, A. L. Mouse models of breast cancer metastasis to bone. Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).
- Rose, A. A., et al. Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone. Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).
- Welm, A. L., et al. The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).
- Li, X., et al. Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions. Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).
- Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice. PLoS ON. 8 (9), e68103 (2013).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).
- Simmons, J. K., et al.
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).
- Xiang, J., et al. CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer. Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Hoffmann, J., et al. Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer. J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).
- Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice. Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).
- Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J.
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).
- Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
