Summary
For å forstå patofysiologien for slag, er det viktig å benytte pålitelige modeller. Denne oppgaven vil beskrive en av de mest brukte slag modeller i mus, betegnet tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) modell (også kalt den intraluminale filament sutur eller modell) med reperfusjon.
Abstract
Hjerneslag er en ledende dødsårsaken i verden og fortsetter å være en av de viktigste årsakene til langtids voksne funksjonshemninger. Om 87% av slag er iskemisk opprinnelse og forekommer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA). I dag den eneste Food and Drug Administration (FDA) godkjente legemiddelet for behandling av denne ødeleggende sykdommen er vevsplasminogenaktivator (tPA). Imidlertid har tPA en liten terapeutisk vindu for administrasjon (3-6 timer), og er bare effektiv i 4% av pasientene som faktisk får det. Dagens forskning fokuserer på å forstå patofysiologien av slag for å finne potensielle terapeutiske mål. Dermed pålitelige modeller er avgjørende, og MCA okklusjon (MCAO) modell (også kalt intraluminal filament eller sutur modell) anses for å være den mest klinisk relevant kirurgisk modell for iskemisk slag, og er ganske ikke-invasiv og lett reproduserbar. Typisk MCAO-modellen brukes sammen med gnagere, spesielt med mus grunntil alle de genetiske varianter tilgjengelig for denne arten. Her beskriver vi (og til stede i videoen) hvordan du lykkes utføre MCAO modellen (med reperfusjon) i mus for å generere pålitelige og reproduserbare data.
Introduction
Hjerneslag er den femte største dødsårsaken i verden, med en person dør av sykdommen hvert 4. minutt. Over 800.000 amerikanere lider et hjerneslag hvert år, noe som ikke bare ødeleggende for pasienten, men også for deres familier. Hjerneslag er den viktigste årsaken til uførhet og den årlige utgifter er anslått til å være i størrelsesorden $ 36500000000 1 til tross for svært få behandlingstilbud blir tilgjengelige.
Vevsplasminogenaktivator (tPA) er den eneste Food and Drug Administration (FDA) lisensiert narkotika for hjerneinfarkt. Det er imidlertid bare effektivt dersom administrert til pasienter i løpet av 3-6 timer fra starten av slaget, og i slike tilfeller den fordeler bare 4% av pasientene 2. Derfor er det viktig at reproduserbare, klinisk relevante dyremodeller for slag brukes for å hjelpe til i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier og behandlingene for denne sykdommen. Det er viktig å merke seg at in vitro in vivo-modeller er avgjørende.
Den vanligste typen av hjerneslag er iskemisk opprinnelse, sto for 87% av totalt antall slag. Andre slag er intracerebral blødning (9%) og subaraknoid blødning (4%), og skyldes som oftest av en emboli til den midtre cerebrale arterie (MCA). Dette skyldes den fremtredende kurve ved roten av MCA, noe som fører til laminær blodstrømmen inn i hjernen til å bli forstyrret. MCA oppstår fra arteria carotis interna (ICA) og ruter langs side sulcus, der det grener og prosjekter til basalgangliene og sideflatene av frontal, parietal og tinninglappene, inkludert den primære motoriske og sensoriske cortex. The Circle of Willis er skapt av posteriore cerebrale arterier blirkoblet til cerebrale arterier og de bakre kommunisere arteriene.
Den intraluminale filament sutur eller modell av MCAO er en av de mest utbredt i strøk forskning. Det finnes imidlertid et par forskjellige variasjoner av denne modellen, og disse er basert på hvorvidt den fila settes inn i den ytre halsarterie (ECA, betegnet Longa metoden) 3, eller om det er satt inn i ICA (betegnet Koizumi metode) 4. I Koizumi metode, må den felles halsarterie (CCA) på siden av operasjonen blir permanent bundet dersom filamentet er fjernet for å forhindre blødning fra innsnitt i CCA, mens i Longa metode er det ECA som skal være permanent bundet 5 . Her Longa metoden vil bli brukt som vi føler at dette er en langt bedre og mer klinisk relevant kirurgisk modell av hjerneinfarkt. Videre er anvendelse av en silisium spiss monofilament, spesielt med Longa fremgangsmåten, produserer megetreproduserbar MCAO i motsetning til de flamme avstumpet monofilamenter, som ofte gir ufullstendig okklusjon og / eller subaraknoidalblødning 6.
Den intraluminale filament-metoden kan brukes som en modell for permanent eller forbigående okklusjon 4,6. For å utføre transient-modellen, blir filamentet fjernet etter en periode med ischemi (f.eks, 30 min, 60 min, eller 2 timer), og reperfusjon tillates å skje. Denne modellen, til en viss grad, simulerer den gjenopprettelse av blodstrøm etter spontan eller terapeutisk intervensjon (for eksempel, tPA administrering) til å lysere en tromboembolisk blodpropp i mennesker. For permanent modell, blir filamentet bare igjen på plass for en tidsperiode (for eksempel 24 timer), slik at ingen reperfusjon inntreffer. En annen fordel ved intraluminal filament-metoden er det faktum at en kraniotomi ikke trenger å bli utført, slik at hodeskallen til å være intakt og å unngå eventuelle endringer i intrakranielt trykk og temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen og forsøkene rapportert i videoen ble godkjent av LSUHSC-S Institutional Animal Care og bruk Committee og er i samsvar med retningslinjene fra NIH.
MERK: Mann C57BL / 6-mus som veide 25-29 g, ble anvendt i denne studien. Musene ble opprettholdt på et standard chow pellet kosthold med fri tilgang til vann, under en 12 timers lys / mørke syklus individuelt ventilerte bur. Prosedyren vil bli utført under sterile forhold ved hjelp av sterile teknikker (f.eks, sterile hansker, sterile instrumenter).
1. Pre-kirurgiske Forberedelser
- Indusere anestesi ved hjelp av en kombinasjon av ketamin (150 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert intraperitonealt (ip). Overvåke anestesidybden ved foten klype utgangspunktet hver 3-5 min og hvert 10 min når anestesi er oppnådd. Mens dyret er under narkose, administrere en steril okulær salve for å hindre tørrhet. Den første dosen av ketamin / xylazin varer vanligvis abut 30-40 minutter. En ytterligere dose kan bli administrert hvis nødvendig, noe som er bekreftet ved dyrets respons på en fot klemme.
- Plasser mus i en liggende stilling på en temperatur regulert varmematte og opprettholde kroppstemperaturen på 36,5 ± 0,1 ° C, som er bekreftet ved hjelp av en rektal probe.
- Barbere nakken og desinfisere huden med 70% etylalkohol.
2. Okklusjon av MCA (figur 1)
- Lag en midtlinjen halsen snitt bruker Iris rette saks og trekke (med haker) mykt vev for å avsløre skipene.
- Dissekere CCA og ECA fra omkringliggende vev ved hjelp Dumont tang uten å skade vagus nerve.
- Lag en midlertidig sutur ved å binde en løs knute rundt CCA bruker 6-0 silke.
- Lag en permanent sutur rundt ECA og de mindre fartøyene som strekker seg fra det ved tett ligere fartøyene (distale til forgreningen av CCA).
- Lag en sutur around ECA proksimalt for CCA delinger.
- Plasser en microvessel klipp rundt arteria carotis interna (ICA) og pterygopalatine arterie (PPA).
- Lag et lite snitt i ECA ved hjelp av mikro dissekere våren saks og sette inn en 180 mikrometer silisium-tipped monofilament. Gjøre kuttet så nær den permanente sutur som mulig for enklere manipulering av filamentet.
- Stram den midlertidige sutur rundt ECA med innsatt filament og fjern microvessel klippet.
- Skjær ECA mellom permanent, distal sutur og inngangspunkt av filamentet ved hjelp av mikro dissekere våren saks.
- Guide filament gjennom ICA til du kjenner motstand (ca. 9 -. 10 mikrometer utover delinger av CCA) i MCA.
MERK: I tilfelle for mye føler motstand mens flertallet av filamentet er fortsatt synlig, kan filament har angitt PPA. Hvis dette skjer, trekker filament tilbake til forgreningen, forsiktig pust forover inn i ICA bruker Dumont tang, og avansere til filament før det kan visualiseres i ICA.
3. Reperfusjon
- Etter en 30-minutters okklusjon periode, fjerne filament ved å trekke det forsiktig tilbake ved hjelp Dumont pinsett og sikre sutur rundt den åpne enden av ECA.
- Fjern den midlertidige sutur rundt CCA ved forsiktig å løsne ligaturen ved hjelp Dumont pinsett og blodstrøm er gjenopptatt gjennom CCA.
- Lukk snittet med en kontinuerlig kirurgisk sutur. Lukking av huden kan oppnås ved enten kontinuerlig eller avbrutt suturer. Hud stifter er også en akseptabel metode.
- Injisere mus med 1 ml saltvann subkutant som volum etterfylling og med smertestillende carprofen (5 mg / kg, sc) for lindring av smerte og ubehag fra den kirurgiske prosedyren, Tegn som indikerer ytterligere smertelindring trengs inkluderer krum rygg, ungroomed frakk, redusert aktivitet, unormalskuespill, og redusert appetitt.
- Legg merke til mus i løpet av utvinningen fra anestesi i et oppvarmet 30 ° C bur ved hjelp av en varmelampe reguleres ved hjelp av en temperaturregulator og plassere most chow i en petriskål på gulvet i buret for å oppmuntre til spising. Musene vil bli plassert en per bur under reperfusjon periode.
4. Sham Surgery
- Lagt mus til den samme prosedyre uten at monofilamentet innsetting.
5. Post-operative Nevrologiske Poeng (tabell 1, figur 2)
- Nevrologisk evaluere mus etter passende reperfusjon periode ved hjelp av en 18-poengssystem vurdere Generelt; Motor; sensorisk; Propriosepsjon. En høyere nevrologisk poengsum tilsvarer nedsatt nevrologisk funksjon.
MERK: Mus som er dømt for ikke svarer og ute av stand til å gå skal avlives. Andre kriterier for human avliving vil inneholde et vekttap på mer enn 20%, respiratorisk distress, infeksjon og rundt det kirurgiske området. En CO 2 kammer skal brukes til aktiv dødshjelp og den fysiske metoden for å bekrefte død vil være halshugging eller Thoracotomi.
6. Måling av Brain infarktvolum (figur 3)
- Indusere anestesi ved hjelp av en kombinasjon av ketamin (150 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert ip Monitor anestesidybden ved foten klemme innledningsvis hver 3 - 5 min og 10 min hver gang anestesi er oppnådd.
- Plasser mus i en liggende stilling og kutt i huden fra magen til halsen, etterfulgt av bukhinnen hjelp iris rette saks.
- Løft opp brystbenet ved hjelp Dumont pinsett og kutte ribbeina å avsløre hjertet.
- Åpne venstre og høyre side av brystkassen ved hjelp av to par av hemostatene, eksponere hjertet.
- Sett inn en 26 G nål festet til en 5 ml sprøyte inn i venstre hjertekammer og kutt i høyre atrium. Perfuse med romtemperatur vanlig saltvann eller fosfatte bufret saltvann (PBS) til væsken blir klar (vanligvis 3 - 5 min).
- Fjern skallen forsiktig bort fra hjernen ved hjelp av iris rette saks og Dumont tang.
- Skjær av olfactory pærer og lillehjernen ved hjelp av et barberblad, slik at hjernen får plass i matrisen. Bruk denne matrisen til skjære hjernen i like segmenter. Chill matrisen før bruk for å holde vevet kult. Sett hjernen i matrisen og sette den på is.
- Skjær hjernen til 2 mm koronale segmenter ved hjelp av to barberblad. Gjør det første kuttet ved hjelp av et barberblad begynner 2 mm fra toppen og la denne barberblad på plass. Gjør ytterligere 2 mm kutt bak den første. Ta av første barberblad med vevet vedlagt. Gjenta denne prosessen til alle vev har vært skiver.
MERK: Det skal være 4 - 5 segmenter når du er ferdig. - Plassere segmentene i 24-brønners plate inneholdende 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium klorid (TTC), som deretter plasseres i et grunt vann-bad ent 37 ° C i 20 min. Plassere hvert segment i en enkelt brønn bidrar til å holde dem i den rekkefølgen de ble kuttet. Sørg for at TTC løsningen helt dekker vev segmenter. Etter 10 minutter slår alle skivene over.
- Plassere en liten mengde av 10% formalin inn i brønnene i en ny 24-brønners plate og overføre segmentene til denne platen i den rekkefølge som de ble kuttet.
- Skann segmentene inn i datamaskinen og analysere infarktstørrelsen som en prosentandel av hele hjernen skive 6 bruker ImageJ analyseprogramvare (NIH 1,57 Bilde programvare) 6.
- Skissere infarktområdet for å generere en arealmåling. Neste måle hele kontralaterale halvkule for å bestemme området. Fordel infarktområdet ved det området av den kontralaterale hemisfære og multiplisere med 100 for å bestemme infarktvolum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus som gjennomgikk 30-min MCAO-indusert hjerne ischemi (figur 1), etterfulgt av en periode med reperfusjon (24 hr, og en wk er presentert her, men lengden av reperfusjon kan varieres). Den dødelighet under MCAO var minimal (ca. 2%). Post iskemi, dødeligheten (innen de første 24 timer) var rundt 26%.
Laser Doppler-strømningsmåling ble benyttet for å bekrefte blodstrøm perfusjon i MCA område før og etter MCAO / reperfusjon. Figur 4 viser klart at når den midlertidige CCA båndet frigjøres etter 30 minutter av ischemi for fjerning av glødetråd og reperfusjon for å forekomme, er det en bølge i perfusjon, som nådde <100% av utgangsverdien perfusjon (dvs. før kirurgi) 5 min til reperfusjon.
24 timer etter symptomdebut (før måling av infarktvolum) Neurological score knyttet til generell, sensoriske, motoriske og proprioseptive underskudd ble vurdert (tabell 1). Dette scoring system er ment å gi objektiv ( 'ja eller nei') kriterier for vurdering. Figur 2 viser at resultatet for mus (n = 27) på 24 timer var 12,56 ± 0,7, og holdt seg høy en uke senere (11,50 ± 1,5 ). En høyere nevrologisk poengsum tilsvarer nedsatt nevrologisk funksjon.
Infarktvolum speilet lignende mønstre til nevrologisk poengsum på 24 timer, dvs. større enn humbug dyr. 24 timer etter MCAO, mus hadde store infarktvolum (figur 3: 15,9 ± 2,6%), som ble forsterket en uke etter slag (28,5 ± 1,9%).
Figur 1: Skjematisk viser plasseringen av arteria cerebri media okklusjon(MCAO) Kirurgi og Large-fartøy vaskulatur av cerebral sirkulasjon. A. Kirurgisk MCAO oppnås via innsettingen av et filament i den ytre halsarterie og deretter inn i den proksimale midtre halsarterie. BG. Fremgangsmåte for å indusere MCAO. Anterior kommunikasjon arterie (ACA); midten cerebral arterie (MCA); posterior kommunikasjon arterie (PcomA); posterior cerebral arterie (PCA); basilaris arterie (BA); arteria carotis interna (ICA); ekstern arteria carotis (ECA); pterygopalatine arterie (PPA); arteria carotis interna (ICA). (Modifisert med tillatelse fra Smith et al., Henvisning # 5.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Den 18-punkts Stroke Score Dette comprehensive slag stillingen vurderer funksjonelle forbedringer i sin alminnelighet, og sensoriske, motor og proprioseptive aspekter av mus oppførsel etter et slag. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05. n = 3 mus / gruppe. Dataene ble analysert ved hjelp av ANOVA pluss en Bonferroni post hoc test. (Modifisert med tillatelse fra Smith et al., Henvisning # 5.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Infarkt Volumene av C57BL / 6 mus 24 timer etter MCAO Musene ble utsatt for 30-min MCAO og 24 timer eller en uke av reperfusjon A) Brains ble fjernet, seksjonert og farget med 2% 2,3,5-. trifenyltetrazoliumklorid (TTC). I levende vev, dehydrogenases enzymatisk redusere TTC til 1,3,5-turhenylformazaon (TPF), som er en rød farge, men i ischemisk vev enzymet er ikke funksjonell, slik at vevet forblir hvite. B) Grafen viser en økning i infarktvolum i mus som har hatt et slag. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. ** P <0,002, **** P <0,0001 versus humbug; n = 4 mus / gruppe. Dataene ble analysert ved hjelp av ANOVA pluss en Bonferroni post hoc test. Scale bar = 1 cm (modifisert med tillatelse fra Smith et al., Henvisning # 5.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Perfusjons av MCA Territory Gjennom MCAO og reperfusjon Musene ble utsatt for 30-min MCAO, og <5 min reperfusjon. Linjene ble normalisert til 100%. som erfacted, perfusjon 5 min inn i reperfusjon periode var høyere enn MCAO, dvs. når ingen perfusjon av vev inntraff. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05. n = 3 mus / gruppe. Dataene ble analysert ved hjelp av ANOVA pluss en Bonferroni post hoc test. (Modifisert med tillatelse fra Smith et al., Henvisning # 5.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Neurological Skårer System Ett poeng gitt for en ja svar til hver av testene.. Marks av 18 7,8.
| Test | Kort beskrivelse | Hva vil teste den for? | Referanser |
| Morris vann labyrint | En åpen-field vann-labyrint prosedyre der gnagere lære å flykte fra vann på en skjult plattform | Romlige hukommelse, bevegelseskontroll, og kognitiv kartlegging | 19 |
| Rotarod | En horisontal roterende stang der gnagere må gå frem for ikke å falle av | Motorisk koordinasjon, balanse og grep styrke | 20 |
| Stang | Gnagere plassert på en stang og observert for skli eller falle som de gjør sin vei ned i et bur | Bevegelsesforstyrrelser forårsaket av kortikal skade | 21, 22 |
| ganganalyse | Som gnagere krysse en glassplate sine labb utskrifter fanges å undersøke deres bevegelser | Walking mønstre (pote trykk, skrittlengde, bredde og frekvens, tå spredning, ganglag vinkel, og kroppen rotasjon)og motorisk koordinasjon | 23, 24 |
| Klistrelappen test | Strimler av tape brukes på den hårløse delen av forpoten av gnagere å registrere tid til å kontakte hver pote, for kontakt, tidspunkt for fjerning, og rekkefølgen av fjerning | Forpotens følsomhet og sensorimotor underskudd | 25, 26 |
| Hjørne | Gnagere plassert mellom to planker som danner en 30 graders vinkel; når du går inn dypt inn i hjørnet på begge sider av vibrissae blir stimulert og gnager steiler og slår tilbake til ansikt den åpne enden | Nevrologiske lidelser og repeterende atferd (overvåking svinger i en retning mot motsatt retning) | 27, 28 |
| Sylinder | Gnagere er plassert i en glass-sylinder med forbena aktivitet mens oppdrett mot av veggen er registrert | Locomotor asymmetri og evaluere Poststroke lem bruk | 28 |
| trapp | Gnagere plassert på en plattform i en boks med en agnet dobbel trapp; gnagere mat begrenset til fremme bevegelse opp trappene for å samle agn | Nå evner for hver forbena uavhengig krever sensoriske kapasiteter, fingerferdighet, og motorisk koordinasjon | 25, 29 |
| Stige | Gnagere gå over en horisontal stige for å nå sitt bur; foten glipper mens du går over stigen er registrert | Foot feil under bevegelse; forbena og bakbena funksjon og koordinering | 30 |
Tabell 2: Eksempler på Murine adferdstester.
| Forslag til GLP er som følger: |
| - Spesifikke detaljer som modell for slag har blitt valgt (f.eks Longa vs. Koizumi), og belastningen, alder, kjønn, vekt rapportert tydelig. |
| - Studier utført i en dobbel-blindet mote. |
| - Strøm analyse rapportert. |
| - Kriterier for inkludering og ekskludering i studien besluttet før studien, og rapporteres. |
| - Dyr overvåket daglig (grunnleggende utseende, kroppsvekt og atferd) for noen tegn til ubehag, smerte eller sykdom. |
| - Rapportering av dyr ekskludert fra studien. |
| - Randomisering av dyr i grupper. |
| - & #160; Rapportering av negative og positive resultater. |
| - Rapportering av lengden på kirurgi, anestesi, kroppstemperatur og blodgasser. |
| - Rapportering av miljøberikelse brukt, hvis noen. |
Tabell 3: Forslag til god laboratoriepraksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden unnfangelsen 20 år siden, har MCAO modell for menneskelig slag som involverer innsetting av et filament blitt brukt i et stort antall studier. Dette er hovedsakelig på grunn av det faktum at det etterligner det som skjer klinisk i den mest vanlige form for slag (dvs., iskemisk slag). Striatum er mer følsom overfor ischemi enn hjernebarken, og som sådan vil lengden av ischemisk tid slår ut om både striatum og dorsolateral cortex vil bli påvirket, eller bare striatum. Begge infarkt og reperfusjon ganger kan varieres tilsvarende, og dette gir forskeren mulighet til å være i stand til å studere patologiske effekter forbundet med forbigående iskemiske anfall (TIA) til mye større infarkter.
Gjennom årene modifikasjoner og feilsøking av filamentet metode for MCAO har vist betydningen av inngrepet blir utført i sterile forhold for å unngå risikoen for infeksjon 9. Resultatene kan varieremellom gnagerarter, belastningsskader (har anatomiske variasjoner vist) 10,11, vekt, og bedøvelsesmidler brukt, men utviklingen i de resultatene som presenteres her er sannsynlig å bli reflektert i andre laboratorier hvor MCAO utføres. Andre viktige skritt for å ta hensyn til, er kroppstemperatur, blodtrykk og blodgasser. Det er godt etablert at kroppstemperaturen påvirker nevrologiske skader, med mindre lesjoner assosiert med hypotermi 12 og mer alvorlige mangler som blir presentert i hypertermi 13. Som sådan bør temperaturen måles og kontrolleres, for eksempel ved bruk av dyret temperaturregulatorer med en varmepute, for derved å opprettholde kroppstemperatur ved 36,5 ° C. Volum påfyll og oppmuntring for å spise ved å plassere mykne chow på bunnen av buret er også flere faktorer for å observere. Blodtrykk og blodgasser 6,14 både kan lett måles og overvåkes ved hjelp av lett tilgjengelig utstyr fra commercial leverandører.
Begrensninger av MCAO teknikken inkluderer riktig dissekere vagus nerve fra blodårene uten skader og unngå å fremme filament inn i PPA, noe som kan påvirke ikke bare evnen til å indusere slag effektivt, men også overlevelsen av musen. Det viktigste betydning i forhold til alternative in vivo MCAO metoder er overlevelsesraten ved bruk av Longa metoden beskrevet her. Vi har også funnet at dette svarer til økte leukocytt endotelial-celle-interaksjoner og økt infarktvolum, noe som gjør denne modellen når de mestrer, et utmerket verktøy for å studere potensielle terapeutiske mål for behandling av slag.
Selv om vi ikke har rapportert her, kan en rekke atferdstester også utføres som Morris vann labyrint, Rotarod, pol test, ganganalyse, klistrelappen test, hjørne test, sylinder test, trapp test, og stige test (se tabell2 for detaljer og referanser). Sham dyr har ingen problemer med å fullføre disse atferdstester; Men hjerneslag dyrene utføre disse testene mye mindre hell. Etter på fra dette, er ett område av debatten om miljøberikelse påvirker ikke bare reproduserbarhet MCAO modellen, men også om det vil påvirke utfallet av atferdstester 15. Dette er uklar, men det er verdt å standardisere dette i laboratoriet, og gjennom hele undersøkelsen.
Det finnes en mengde forskjellige tester tilgjengelig for å måle slag utfallet. Vi har presentert ansettelsen av laser doppler for blodstrømsmåling, en grundig 18-punkts nevrologisk vurdering score, og også infarktvolum målinger. Men flere alternativer er også nyttig, for eksempel bildebehandling. Vi benytter rutinemessig bruk av intravital fluorescens mikroskopi for å studere cellulære interaksjoner (karakteristisk for en inflammatorisk respons) 6 inne i cereBral mikrosirkulasjonen i sanntid, i bedøvede dyr 5,6,16. MCAO og reperfusjon produserer en økt cerebral betennelsesreaksjon mot falske dyr 5,6,16. Andre bildediagnostikk som magnetic resonance imaging 17 og positronemisjonstomografi 18 kan også brukes, som de gir mulighet for longitudinelle studier som er klinisk relevant.
Histologisk analyse av hjernevevet, bør plasma- og serumprøver blir rutinemessig utført som de tillater ytterligere karakterisering av de patofysiologiske respons på slag, og de mekanismer som er involvert, men også, og kanskje enda viktigere, de tillater forskere for å studere effektene av forbindelsene på utfallet for slag, og dermed gi viktige data for potensielle terapeutiske mål for denne ødeleggende og ødeleggende sykdom. Til slutt, mener vi det er svært gunstig for forskere å vurdere ikke bare de mest hensiktsmessige strøk modell based på kravene for sin studie, men også at GLP ( "Good Laboratory praksis") er obligatorisk. Se tabell 3 for GLP forslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
