Summary
Con el fin de entender la fisiopatología del accidente cerebrovascular, es importante utilizar modelos fiables. En este trabajo se va a describir uno de los modelos de accidente cerebrovascular de uso más frecuente en los ratones, llamado el medio modelo de oclusión de la arteria cerebral (MCAO) (también llamado el filamento de sutura intraluminal o modelo) con reperfusión.
Abstract
El accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte en el mundo y sigue siendo una de las causas principales de discapacidad adultas a largo plazo. Alrededor del 87% de los accidentes cerebrovasculares son isquémicos en su origen y se producen en el territorio de la arteria cerebral media (ACM). Actualmente la única Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aprobado por la FDA para el tratamiento de esta enfermedad devastadora es el activador del plasminógeno tisular (tPA). Sin embargo, el tPA tiene una pequeña ventana terapéutica para la administración (3 - 6 horas), y sólo es eficaz en el 4% de los pacientes que lo reciben. La investigación actual se centra en la comprensión de la fisiopatología del accidente cerebrovascular con el fin de encontrar posibles dianas terapéuticas. Por lo tanto, los modelos fiables son cruciales, y el modelo (MCAO) oclusión de la ACM (también llamado modelo filamento o hilo de sutura intraluminal) se considera que es el modelo quirúrgico más clínicamente relevante de accidente cerebrovascular isquémico, y es bastante no invasivo y fácilmente reproducible. Típicamente, el modelo MCAO se utiliza con los roedores, especialmente con los ratones debidoa todas las variaciones genéticas disponibles para esta especie. Aquí se describe (y presente en el video) cómo llevar a cabo con éxito el modelo MCAO (con reperfusión) en ratones para generar datos confiables y reproducibles.
Introduction
El accidente cerebrovascular es la causa principal de muerte quinta a nivel mundial, con una persona morir de la enfermedad cada 4 minutos. Más de 800.000 estadounidenses sufren un ictus cada año, lo que no sólo es devastador para el paciente, sino también para sus familias. El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad en los adultos y los gastos anuales se estima que es del orden de $ 1 billón el 36,5 pesar de muy pocas opciones de tratamiento son disponibles.
activador del plasminógeno tisular (tPA) es la única Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de licencia de drogas para el accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, sólo es eficaz si se administra a los pacientes dentro de 3-6 horas desde el inicio de la carrera, y en estos casos se beneficia sólo el 4% de los pacientes 2. Por lo tanto, es imperativo que los modelos animales reproducibles, clínicamente relevantes de accidente cerebrovascular se utilizan para ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales y tratamientos para esta enfermedad. Es importante señalar que in vitro in vivo son esenciales.
El tipo más común de accidente cerebrovascular isquémico es en su origen, que representan el 87% de los accidentes cerebrovasculares totales. Otros trazos son hemorragia intracerebral (9%) y hemorragia subaracnoidea (4%), y son causadas con más frecuencia por una embolia de la arteria cerebral media (MCA). Esto es atribuible a la curva prominente en la raíz de la MCA, que hace que el flujo laminar de la sangre que entra en el cerebro se vuelva interrumpido. El MCA surge de la arteria carótida interna (ACI) y las rutas a lo largo del surco lateral, donde se ramifica y proyectos a los ganglios basales y las superficies laterales de los lóbulos frontal, parietal y lóbulos temporales, incluyendo el motor principal y la corteza sensorial. El Círculo de Willis es creado por las arterias cerebrales posteriores siendoconectado a las arterias cerebrales y las arterias posterior comunicación.
El filamento o sutura intraluminal modelo de MCAO es uno de los más ampliamente utilizado en la investigación del accidente cerebrovascular. Sin embargo, hay un par de diferentes variaciones de este modelo, y estos son en función de si el microfilamentos se inserta en la arteria carótida externa (ACE, denominado el método de Longa) 3, o si se inserta en el ICA (denominado el Koizumi método) 4. En el método de Koizumi, la arteria carótida común (CCA) en el lado de la cirugía debe estar ligada de forma permanente si se retira el filamento para prevenir el sangrado de la incisión en el CCA, mientras que en el método de Longa es TCE de que debe estar ligada de forma permanente 5 . Aquí, el método de Longa se utilizará como sentimos que este es un muy superior y un modelo quirúrgico más clínicamente relevante de accidente cerebrovascular isquémico. Además, el uso de un monofilamento de silicio con punta, especialmente con el método de Longa, produce muyreproducible MCAO en oposición a los monofilamentos de llama embotado, que a menudo producen oclusión incompleta y / o hemorragia subaracnoidea 6.
El método filamento intraluminal se puede utilizar como un modelo de 4,6 oclusión permanente o transitoria. Para llevar a cabo el modelo transitorio, el filamento se retira después de un período de isquemia (por ejemplo, 30 min, 60 min, o 2 hr) se permite, y la reperfusión a suceder. Este modelo, en cierta medida, simula la restauración del flujo sanguíneo después de la intervención espontáneo o terapéutico (por ejemplo, la administración de tPA) para lisar un coágulo tromboembólica en los seres humanos. Para el modelo permanente, el filamento es simplemente deja en su lugar durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas), por lo que no se produce la reperfusión. Otra ventaja del método de filamento intraluminal es el hecho de que una craneotomía no necesita ser realizada, lo que permite el cráneo que se deja intacto y evitando cualquier cambio en la presión y la temperatura intracraneal.
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Protocol
Este protocolo y los experimentos reportados en el video fueron aprobados por el Comité LSUHSC-S Institucional de Cuidado y Uso de Animales y están en conformidad con las directrices del NIH.
NOTA: Hombre ratones C57BL / 6 que pesaban 25 a 29 g se utilizaron en este estudio. Los ratones se mantuvieron en una dieta de pienso de pellets de serie con libre acceso al agua, en virtud de un 12 h luz / oscuridad ciclo en jaulas ventiladas por separado. El procedimiento se realiza bajo condiciones estériles usando técnicas estériles (por ejemplo, guantes estériles, instrumentos estériles).
Preparativos 1. Pre-quirúrgicos
- Inducir la anestesia utilizando una combinación de ketamina (150 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado por vía intraperitoneal (ip). Monitorear la profundidad de la anestesia a pie pizca inicialmente cada 3 - 5 min y 10 min cada vez que se consigue la anestesia. Mientras el animal está bajo anestesia, administrar una pomada ocular estéril para evitar la sequedad. La dosis inicial de ketamina / xilazina por lo general dura abcabo de 30-40 minutos. Una dosis adicional se puede administrar, si es necesario, que se verifica por la respuesta del animal a un pellizco pie.
- Coloque los ratones en una posición supina sobre una estera de calor de temperatura regulada y mantener la temperatura corporal a 36,5 ± 0,1 ° C, que se verifica por medio de una sonda rectal.
- Afeitar el cuello y desinfectar la piel con alcohol etílico al 70%.
2. La oclusión de la ACM (Figura 1)
- Hacer una incisión en la línea media del cuello utilizando tijeras iris rectas y retraer (utilizando retractores) los tejidos blandos para exponer los vasos.
- Diseccionar el CCA y el TCE del tejido circundante utilizando pinzas Dumont sin dañar el nervio vago.
- Hacer una sutura temporal atando un nudo flojo alrededor de la CCA con la seda 6-0.
- Hacer una sutura permanente alrededor de la ECA y los vasos más pequeños que se extienden desde al ligar fuertemente los vasos (distal a la bifurcación de la CCA).
- Hacer un aro de suturaund proximal del Tribunal de Cuentas de la bifurcación de la ACC.
- Colocar un clip de microvasos alrededor de la arteria carótida interna (ICA) y la arteria pterigopalatina (PPA).
- Hacer una pequeña incisión en la ECA utilizando micro disección tijeras de primavera e insertar un monofilamento de silicio con punta de 180 micras. Haga el corte lo más cerca a la sutura permanente como sea posible para facilitar la manipulación del filamento.
- Apriete la sutura temporal alrededor de la ECA con el filamento insertado y quitar la pinza microvascular.
- Cortar el ACE entre la sutura permanente, distal y el punto de entrada del filamento usando micro disección tijeras de primavera.
- Guiar el filamento a través del ICA hasta que se sienta resistencia (aprox. 9 - 10 m más allá de la bifurcación de la CCA) en el MCA.
NOTA: En caso de que se sentía demasiada resistencia, mientras que la mayoría del filamento es aún visible, el filamento puede haber entrado en el PPA. Si esto sucede, tirar del filamento de nuevo a la bifurcación, con cuidado de push hacia adelante en los utilizando unas pinzas Dumont ICA, y hacer avanzar el filamento hasta que pueda ser visualizado en el ICA.
3. La reperfusión
- Después de un periodo de oclusión de 30 minutos, retire el filamento, tirando de él hacia atrás utilizando pinzas Dumont y asegurar la sutura alrededor del extremo abierto de la ECA.
- Retire la sutura temporal alrededor de la CCA soltando con cuidado la ligadura utilizando unas pinzas Dumont y el flujo sanguíneo se reanuda a través de la CCA.
- Cerrar la incisión con una sutura quirúrgica continua. Cierre de la piel se puede lograr por cualquiera de las suturas continuas o interrumpidas. grapas de piel son también un método aceptable.
- Inyectar ratones con 1 ml de subcutáneamente solución salina como la reposición de volumen y con los carprofeno analgésicos (5 mg / kg, sc) para el alivio del dolor y el malestar de la intervención quirúrgica, los signos que indican que se necesita alivio del dolor también cuentan con su espalda encorvada, capa sin aplanar, disminución de la actividad, anormalpostura y disminución del apetito.
- Observar los ratones a través de la recuperación de la anestesia en una jaula C 30 ° calienta usando una lámpara de calor regulada mediante un controlador de temperatura y colocar Chow puré en una placa de Petri en el suelo de la jaula para fomentar la alimentación. Los ratones se aloja uno por jaula durante el período de reperfusión.
4. Cirugía Sham
- los ratones sometidos al mismo procedimiento sin la inserción de monofilamento.
5. postoperatorias Scores neurológicos (Tabla 1; Figura 2)
- Neurológicamente evaluar los ratones después del período de reperfusión pertinente mediante un sistema de puntuación de 18 puntos para evaluar la general; Motor; Sensorial; La propiocepción. Una puntuación neurológica más alta corresponde a una disminución de la función neurológica.
NOTA: Los ratones que se consideran que no responde y no podía caminar serán sacrificados. Otros criterios para la eutanasia humanitaria incluirán una pérdida de peso de más de 20%, di respiratoriael estrés y la infección alrededor del área quirúrgica. Una cámara de CO 2 será utilizado para la eutanasia y el método para confirmar la muerte física será dislocación cervical o toracotomía.
6. Medición de infarto cerebral de volumen (Figura 3)
- Inducir la anestesia utilizando una combinación de ketamina (150 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado ip Monitor de profundidad de la anestesia por pellizco pie inicialmente cada 3 - 5 min y cada 10 min una vez que se consigue la anestesia.
- Coloque los ratones en una posición supina y cortar la piel del abdomen en el cuello, seguido por el peritoneo usando tijeras iris rectas.
- Levante el esternón utilizando pinzas Dumont y cortar las costillas para exponer el corazón.
- Abra la izquierda y el lado derecho del pecho, utilizando dos pares de pinzas hemostáticas, exponer el corazón.
- Inserte una aguja 26 G unida a una jeringa de 5 ml en el ventrículo izquierdo y cortar la aurícula derecha. Perfusión con solución salina normal temperatura ambiente o fosfate solución salina tamponada (PBS) hasta que el líquido se convierte en claro (por lo general 3-5 min).
- Retire cuidadosamente el cráneo lejos del cerebro usando tijeras iris rectas y pinzas Dumont.
- Cortar los bulbos olfatorios y el cerebelo utilizando una hoja de afeitar para que el cerebro se adaptará en la matriz. Utilice esta tabla para cortar el cerebro para que incluso los segmentos. Enfriar la matriz antes de su uso para mantener el tejido fresco. Coloque el cerebro en la matriz y la puso en hielo.
- Cortar el cerebro en 2 mm segmentos coronales utilizando dos hojas de afeitar. Haga el primer corte usando una hoja de afeitar a partir de 2 mm desde la parte superior y dejar esta hoja de afeitar en su lugar. Hacer otras 2 mm, cortado detrás del primero. Retire la primera cuchilla de afeitar con el tejido adjunto. Repita este proceso hasta que todo el tejido ha sido cortado.
NOTA: No debe ser de 4 - 5 segmentos cuando haya terminado. - Coloque los segmentos en placa de 24 pocillos que contienen cloruro de 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium (TTC), que se coloca luego en un baño de agua poco profunda unat 37 ° C durante 20 min. La colocación de cada segmento en un pozo individual ayuda a mantenerse en el orden en que fueron cortados. Asegúrese de que la solución TTC cubre completamente los segmentos de tejido. Después de 10 minutos se convierten todas las rodajas sobre.
- Colocar una pequeña cantidad de 10% de formalina en los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos y transferir los segmentos a esta placa en el orden en el que fueron cortados.
- Analiza los segmentos en el ordenador y analizar el tamaño del infarto como porcentaje de todo el corte de cerebro 6 utilizando software de análisis ImageJ (NIH Image Software 1,57) 6.
- Delinear el área infartada para generar una medición de área. Siguiente medir todo el hemisferio contralateral para determinar el área. Se divide el área de infarto por el área del hemisferio contralateral y se multiplica por 100 para determinar el volumen de infarto.
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Representative Results
Los ratones se sometieron a una isquemia de 30 min inducida por MCAO cerebro (Figura 1), seguido de un período de reperfusión (24 hr y 1 sem se presentan aquí, pero la duración de la reperfusión puede ser variada). La mortalidad durante MCAO era mínima (aproximadamente 2%). isquemia posterior, la tasa de mortalidad (dentro de las primeras 24 horas) fue de alrededor de 26%.
Laser Doppler flujometría se utilizó para confirmar la perfusión de flujo sanguíneo en el territorio de la ACM antes y después de MCAO / reperfusión. La Figura 4 demuestra claramente que cuando el lazo temporal CCA se libera después de 30 min de isquemia para la eliminación de filamento y reperfusión que se produzca, hay un aumento en la perfusión, que alcanzó <100% de la perfusión de línea de base (es decir, antes de la cirugía) 5 min en la reperfusión.
24 horas después de la aparición del accidente cerebrovascular (antes de la medición del volumen de infarto) neurological puntuaciones relativas a lo general, sensoriales, motoras y los déficits propioceptivos fueron evaluados (Tabla 1). Este sistema de puntuación está destinado a proporcionar una información objetiva ( 'sí o no') criterios para la evaluación. La Figura 2 muestra que la puntuación para los ratones (n = 27) a las 24 horas fue de 12,56 ± 0,7, y se mantuvo alta después de 1 semana (11,50 ± 1,5 ). Una puntuación neurológica más alta corresponde a una disminución de la función neurológica.
Los volúmenes de infarto reflejan patrones similares a la puntuación neurológica a las 24 horas, es decir, mayor de animales de simulación. 24 horas después de la MCAO, los ratones tenían grandes volúmenes de infarto (Figura 3: 15,9 ± 2,6%), que se acentuaron 1 semana después del accidente cerebrovascular (28,5 ± 1,9%).
Figura 1: Esquema que muestra la localización de la oclusión de la arteria cerebral media(MCAO) La cirugía y la vasculatura de los grandes vasos de la circulación cerebral. A. MCAO quirúrgico se logra a través de la inserción de un filamento en la arteria carótida externa y luego en la arteria carótida media proximal. BG. Pasos para inducir MCAO. arteria de comunicación anterior (ACA); arteria cerebral media (ACM); posterior de la arteria de comunicación (PcomA); arteria cerebral posterior (ACP); arteria basilar (BA); arteria carótida interna (ACI); arteria carótida externa (ACE); arteria pterigopalatino (PPA); arteria carótida interna (ACI). (Modificado con permiso de Smith et al., Referencia # 5.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. El 18 puntos de carrera Score Esta comprehensive puntuación de accidente cerebrovascular evalúa mejoras funcionales en general, y sensoriales, motoras y propioceptivas aspectos de comportamiento del ratón después de una apoplejía. Los datos son la media ± SEM. * P <0,05. n = 3 ratones / grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA más una prueba post hoc de Bonferroni. (Modificado con permiso de Smith et al., Referencia # 5.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Volúmenes de infarto de C57BL / 6 ratones 24 horas después de la MCAO Los ratones se sometieron a 30 min-MCAO y 24 hr o 1 semana de reperfusión) Brains A se eliminaron, se seccionaron y se tiñeron con 2% 2,3,5-. cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). En el tejido vivo, deshidrogenasas enzimáticamente reducir TTC de 1,3,5-viajehenylformazaon (TPF), que es un color rojo, pero en el tejido isquémico la enzima no es funcional, por lo que el tejido permanece blanco. B) El gráfico muestra un aumento en el volumen del infarto en ratones después de haber tenido un accidente cerebrovascular. Los datos son la media ± SEM. ** P <0,002, **** p <0,0001 frente farsa; n = 4 ratones / grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA más una prueba post hoc de Bonferroni. Barra de nivel = 1 cm (modificado con autorización de Smith et al., Referencia # 5.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. La perfusión de territorio de la ACM A lo largo de la MCAO y reperfusión Los ratones fueron sometidos a 30 minutos MCAO, y <5 min de reperfusión. Las líneas de base se normalizaron a 100%. como expected, la perfusión 5 min en el período de reperfusión fue mayor que MCAO, es decir, cuando no se produjo la perfusión del tejido. Los datos son la media ± SEM. * P <0,05. n = 3 ratones / grupo. Los datos se analizaron mediante ANOVA más una prueba post hoc de Bonferroni. (Modificado con permiso de Smith et al., Referencia # 5.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: sistema de puntuación neurológica Un punto dado para una respuesta de sí a cada una de las pruebas.. Marcas de las 18 7,8.
| Prueba | Breve descripción | ¿Qué es la prueba? | referencias |
| Laberinto acuático de Morris | Un campo abierto procedimiento laberinto de agua donde los roedores aprenden a escapar de agua sobre una plataforma escondida | La memoria espacial, control de movimiento, y la cartografía cognitiva | 19 |
| el cilindro giratorio | Una barra giratoria horizontal donde los roedores tienen que caminar hacia adelante para que no se caiga | la coordinación motora, el equilibrio y la fuerza de prensión | 20 |
| Polo | Roedores colocados en un poste y observados para deslizarse o caerse ya que hacen su camino hacia abajo en una jaula | Trastornos del movimiento causados por el daño cortical | 21, 22 |
| análisis de la marcha | Dado que los roedores se cruzan una placa de vidrio sus huellas son capturados para examinar sus movimientos | patrones de caminata (presión de la pata, la longitud del paso, el ancho y la frecuencia, dedo del pie propagación, el ángulo de la marcha, y la rotación del cuerpo)y la coordinación motora | 23, 24 |
| Prueba de etiqueta adhesiva | Tiras de cinta aplicables a la parte sin pelo de la pata delantera de los roedores para registrar el tiempo de contacto con cada pata, orden de contacto, momento de la retirada, y el orden de retirada | sensibilidad de sus patas delanteras y sensoriomotoras déficit | 25, 26 |
| Esquina | Roedores colocados entre dos placas que forman un ángulo de 30 °; al entrar profundamente en la esquina se estimulan ambos lados de las vibrisas y las traseras de roedores y se vuelve de nuevo hacia el extremo abierto | trastornos del neurodesarrollo y comportamientos repetitivos (monitoreo gira en una dirección frente a la dirección opuesta) | 27, 28 |
| Cilindro | Los roedores se colocan en un cilindro de vidrio con la actividad de la extremidad anterior, mientras que la cría contra de la pared se registra | asimetría del aparato locomotor y evaluar Poststrel uso del miembro oke | 28 |
| Escalera | Roedores colocados sobre una plataforma en una caja con una escalera doble cebo; los roedores son los alimentos restringidos a promover el movimiento por las escaleras para recoger el cebo | Alcanzar habilidades que requieren para cada extremidad anterior de forma independiente las capacidades sensoriales, la destreza y la coordinación motora | 25, 29 |
| Escalera | Los roedores a pie a través de una escalera horizontal para llegar a su jaula; pie se desliza mientras camina por la escalera, se registran | faltas de pie durante la locomoción; la extremidad anterior y la función de las extremidades posteriores y coordinación | 30 |
Tabla 2: Ejemplos de pruebas de comportamiento murinos.
| Sugerencia para el GLP es el siguiente: |
| - Los detalles específicos de los cuales se ha elegido el modelo de accidente cerebrovascular (por ejemplo, frente a Koizumi Longa), y la cepa, edad, sexo, peso informado con claridad. |
| - Estudios realizados en un diseño doble ciego. |
| - Informó Análisis de poder. |
| - Criterios de inclusión y exclusión en el estudio decidieron antes del estudio, e informaron. |
| - Animales monitoreados diariamente (aspecto básico, el peso corporal y el comportamiento) para detectar cualquier signo de malestar, dolor o enfermedad. |
| - Notificación de los animales excluidos del estudio. |
| - La asignación al azar de los animales en grupos. |
| - & #160; Notificación de los resultados negativos y positivos. |
| - Notificación de duración de la cirugía, anestesia, la temperatura corporal y los gases en sangre. |
| - Notificación de enriquecimiento ambiental utilizado, en su caso. |
Tabla 3: Sugerencias para buenas prácticas de laboratorio.
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Discussion
Desde su concepción hace 20 años, el modelo MCAO para el accidente cerebrovascular humano que implica la inserción de un filamento se ha utilizado en un gran número de estudios. Esto es principalmente debido al hecho de que imita lo que ocurre clínicamente en la forma más común de accidente cerebrovascular (es decir, ictus isquémico). El cuerpo estriado es más sensible a la isquemia de la corteza cerebral, y como tal, la longitud del tiempo de isquemia se traducirá en si tanto el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral se verán afectados, o sólo el cuerpo estriado. En ambas ocasiones infarto y reperfusión pueden variarse en consecuencia, y esto ofrece al investigador la posibilidad de poder estudiar los efectos patológicos asociados con un ataque isquémico transitorio (AIT) a infartos mucho más grandes.
A través de los años modificaciones y solución de problemas del método de filamentos de MCAO ha demostrado la importancia del procedimiento que se lleva a cabo en condiciones estériles para evitar el riesgo de infección 9. Los resultados pueden variarentre las especies de roedores, de deformación (anatómica variaciones se han mostrado) 10,11, el peso y los anestésicos utilizados, pero las tendencias en los resultados presentados aquí son probable que se refleja en otros laboratorios donde se realiza la MCAO. Otros pasos críticos a tener en cuenta son la temperatura corporal, la presión arterial y los gases en sangre. Está bien establecido que la temperatura del cuerpo afecta a daño neurológico, con lesiones más pequeñas asociadas con hipotermia 12 y los déficit más graves que se presentan en la hipertermia 13. Como tal, la temperatura debe ser medida y controlada, por ejemplo, mediante el uso de los controladores de temperatura de los animales con una almohadilla de calor, a fin de mantener la temperatura corporal a 36,5 ° C. la reposición de volumen y el fomento de la alimentación mediante la colocación de Chow se ablandan a la parte inferior de la jaula son también factores adicionales que observar. La presión arterial y los gases sanguíneos 6,14 pueden fácilmente tanto poder cuantificar y supervisar el uso de equipos fácilmente disponibles de comercproveedores ial.
Limitaciones de la técnica MCAO incluyen disección correctamente el nervio vago de las arterias sin daño y evitar el avance del filamento en la PPA, lo que puede afectar no sólo a la capacidad de inducir eficazmente accidente cerebrovascular, sino también la tasa de supervivencia del ratón. El significado más importante con respecto a la alternativa en métodos MCAO in vivo es la tasa de supervivencia cuando se utiliza el método de Longa se describe aquí. También hemos encontrado que esto corresponde a un aumento de las interacciones leucocito-endotelial y el aumento de los volúmenes de infarto, que hacen de este modelo, una vez dominado, una excelente herramienta para el estudio de posibles dianas terapéuticas para el tratamiento del accidente cerebrovascular.
Aunque no hemos reportado ningún aquí, una serie de pruebas de comportamiento también se puede realizar como laberinto de Morris, de Rotarod, prueba de polo, análisis de la marcha, prueba de etiqueta adhesiva, prueba de la esquina, la prueba del cilindro, ensayo de la escalera, y la prueba de escalera (véase la tabla2 para detalles y referencias). Los animales de simulación no tienen problemas con completar estas pruebas de comportamiento; Sin embargo, los animales de accidente cerebrovascular realizan estas pruebas con mucho menos éxito. A raíz de esto, un área de debate es si el enriquecimiento ambiental no sólo afecta a la reproducibilidad del modelo de MCAO, sino también si va a afectar el resultado de las pruebas de comportamiento 15. Esto no está claro, pero es digno de la normalización de esto dentro del laboratorio y durante todo el estudio.
Hay una plétora de diferentes pruebas para medir los resultados del accidente cerebrovascular. Hemos presentado el empleo de láser doppler para mediciones de flujo sanguíneo, una puntuación de valoración neurológica de 18 puntos en profundidad, y también las mediciones de volumen del infarto. Sin embargo, las opciones adicionales son también útiles, tales como formación de imágenes. Nosotros habitualmente emplean el uso de microscopía de fluorescencia intravital para estudiar las interacciones celulares (características de una respuesta inflamatoria) 6 dentro del ceremicrocirculación bral en tiempo real, en los animales anestesiados 5,6,16. MCAO y reperfusión produce una respuesta inflamatoria cerebral aumentada en comparación con animales de simulación 5,6,16. Otras técnicas de imagen como la resonancia magnética y la tomografía de 17 por emisión de positrones 18 también se pueden utilizar, ya que proporcionan la oportunidad para que los estudios longitudinales que son clínicamente relevantes.
El análisis histológico del tejido cerebral, las muestras de plasma y suero se deben realizar de forma rutinaria, ya que permiten una caracterización adicional de las respuestas fisiopatológicas a los accidentes cerebrovasculares y los mecanismos involucrados, sino también, y quizás más importante, permiten a los investigadores estudiar los efectos de los compuestos sobre el resultado de accidente cerebrovascular, lo que proporciona datos importantes para posibles dianas terapéuticas para esta enfermedad debilitante y devastadora. Por último, creemos que es altamente recomendable que los investigadores consideren no sólo los ba modelo de carrera más adecuadossed en los requisitos para su estudio, sino también que el GLP ( "buenas prácticas de laboratorio") se hace obligatoria. Véase la Tabla 3 para obtener sugerencias de GLP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
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