Summary
rigidità arteriosa rappresenta un fattore chiave per la velocità della malattia e di impulso onda cardiovascolare (PWV) può essere considerato come un indice surrogato per la rigidità arteriosa. Questo protocollo descrive un algoritmo di elaborazione delle immagini per il calcolo PWV nei topi a base di ultrasuoni di elaborazione delle immagini che è applicabile in diversi siti arteriosi.
Abstract
Rigidità arteriosa può essere valutata calcolando velocità dell'onda di polso (PWV), cioè, la velocità con cui l'onda impulso viaggia in un recipiente condotto. Questo parametro è sempre più studiato in modelli di roditori di piccole dimensioni in cui viene utilizzato per valutare alterazioni nella funzione vascolare relativi a particolari genotipi / trattamenti o per caratterizzare la progressione della malattia cardiovascolare. Questo protocollo descrive un algoritmo di elaborazione delle immagini che conduce alla misurazione arteriosa PWV non invasiva in topi usando solo immagini ultrasuoni (US). La tecnica proposta è stata utilizzata per valutare addominale PWV aortica in topi e valutare le sue modifiche associate all'età.
aorta addominale scansioni degli Stati Uniti sono ottenuti da topi in anestesia gassosa utilizzando un dispositivo US specifico dotato di sonde ad alta frequenza degli Stati Uniti. B-mode e immagini Pulse-Doppler (PW-Doppler) vengono analizzati al fine di ottenere il diametro e velocità media valori istantanei, rispettivamente,. A questo scopo, le tecniche di rilevamento dei bordi e tracking contorno sono impiegati. Il singolo battito significa diametro e velocità forme d'onda sono ora allineati e combinati per ottenere il diametro-velocity (lnD-V) loop. valori PWV sono ottenuti dalla pendenza della parte lineare del ciclo, che corrisponde alla fase sistolica anticipo.
Con l'approccio attuale, anatomica e funzionale informazioni relative al mouse aorta addominale può essere non invasivo raggiunto. Richiedono l'elaborazione di immagini ecografiche solo, può rappresentare un utile strumento per la caratterizzazione non invasiva di diversi siti arteriosi nel topo in termini di proprietà elastiche. L'applicazione della presente tecnica può essere facilmente estesa ad altri distretti vascolari quali l'arteria carotide, fornendo così la possibilità di ottenere una valutazione rigidità arteriosa multi-site.
Introduction
I modelli murini sono sempre più utilizzati per lo studio di malattie cardiovascolari (CVD) e particolarmente utilizzati in studi longitudinali che consentono la caratterizzazione delle diverse fasi di sviluppo della malattia 1. Proprietà elastiche di grandi arterie sono riportate diverse condizioni patologiche; da un punto di vista tecnico, rigidità arteriosa può essere valutata misurando la velocità dell'onda di polso (PWV), che rappresenta la velocità con cui l'onda impulso viaggia in un recipiente condotto 2. A causa del suo significato clinico, è sempre più misurata anche in piccoli modelli animali preclinici 3.
Diverse tecniche sono disponibili per la valutazione della velocità dell'onda di polso nei topi. approcci invasive sono basate sull'uso di trasduttori di pressione catetere punta. PWV è valutata mediante l'acquisizione di segnali di pressione in due differenti siti arteriosi e dividendo la distanza tra i due misurazioni sITES per lo sfasamento temporale tra i segnali di 4. Il principale svantaggio relativo a questi tipi di tecniche è che richiedono sacrificio animale per la valutazione della distanza tra i due siti di misura e, pertanto, non possono essere utilizzate in studi longitudinali. Per superare questa limitazione, approcci non invasivi, basati su differenti tecniche di imaging, sono state sviluppate. Studi precedenti hanno riportato valutazioni PWV nei topi ottenuti applicando il metodo del tempo di transito sulla risonanza magnetica dati di imaging di velocità con codifica 5 e segnali Pulsed-Doppler 6. Tuttavia, il valore PWV ottenuto con questi metodi è una valutazione regionale della rigidità arteriosa. Infatti, esso rappresenta un valore medio, che rappresentano differenti arterie in termini di proprietà elastiche e dimensioni. Inoltre, questi tipi di valutazioni richiedono la valutazione della distanza tra i due siti di misurazioni che è una fonte di errore che potrebbe influence il risultato finale.
PWV può essere valutata utilizzando il diametro-velocity (lnD-V) ciclo 7. Questo metodo si basa sulla valutazione simultanea dei valori di diametro e velocità del flusso in un vaso selezionato. Secondo questo approccio, il ciclo lnD-V viene ottenuta riportando valori di diametro logaritmo naturale vs significa valori di velocità e PWV è stimato calcolando la pendenza della parte lineare del cerchio ottenuto corrispondente alla fase sistolica anticipo. Per quanto riguarda l'attuazione pratica di questo metodo, lavori precedenti hanno riportato risultati circa la sua applicazione in un sistema in vitro set-up 7 e il suo utilizzo per la valutazione sia carotidea e femorale PWV nell'uomo 8.
Lo scopo principale del presente studio è fornire una descrizione dettagliata di un algoritmo di elaborazione delle immagini che fornisce una misurazione PWV arteriosa non invasiva in topi utilizzando Usolo immagini S. L'approccio proposto permette la valutazione della rigidità arteriosa locale mediante trasformazione di entrambi B-mode e Pulsed-Wave Doppler (PW-Doppler) immagini e può essere applicato sulle arterie di importanza fondamentale, come l'aorta addominale.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Direttiva Europea (2010/63 / UE) e la legge italiana (D.Lvo 26/2014), e seguiva principi di cura degli animali da laboratorio. Il pannello di approvazione etica locale ha approvato lo studio.
1. Procedura Imaging
- Posizionare il mouse in una camera di induzione di anestesia riempita con 2,5% isoflurano in 1 L / min ossigeno puro. Verificare la profondità dell'anestesia per mancanza di risposta a pizzico punta.
- Posto l'animale su un bordo temperatura controllata in posizione supina. Bagnare occhi dell'animale con collirio, per evitare il funzionamento a secco. Fornire flusso di gas anestetico (1,5% isoflurano) mettendo il naso del mouse nella cono dedicato. Se necessario, regolare la percentuale di isoflurano da caso a caso, a seconda che l'animale in fase di studio. Fissare la temperatura della scheda a 40 ° C.
- Coat i quattro arti dell'animale con pasta conduttiva e incollate sugli elettrodi ECG incorporati neltavola. Misurare la temperatura corporea con una sonda rettale lubrificato con vaselina. Verificare che tutte le misurazioni fisiologiche (ECG e il segnale della respirazione e la temperatura) vengono acquisiti e visualizzati correttamente.
- Rimuovere i capelli chimicamente con l'addome con crema depilatoria e ricoprirlo con gel di accoppiamento acustico.
- Posizionare il (13-24 MHz) della sonda degli Stati Uniti nel braccio meccanico.
- Fissare la sonda US parallelamente all'animale e regolarne la posizione in modo da ottenere immagini longitudinali dell'aorta addominale con la regione di interesse si trova nella zona focale.
- Raccogliere informazioni anatomiche.
- Fare clic sul pulsante che consente l'elevato frame rate di acquisizione 9 ECG-gated, scegliere una acquisizione frame rate pari a 700 fps e avviare l'acquisizione. Nota: In questo modo le immagini anatomiche della nave relativa a un singolo ciclo cardiaco possono essere acquisite.
- Raccogliere informazioni velocità di flusso. </ Strong>
- Utilizzando la stessa proiezione scansione, fare clic sul pulsante PW-Doppler, posizionare il volume del campione al centro della nave e acquisire immagini assicurando che il cine loop non è inferiore a 3 s. Ottenere questi dati mantenendo la correzione angolare più piccolo possibile, adeguandolo da caso a caso sulla base della proiezione US ottenuto.
- Rimuovere l'animale dalla scheda a temperatura controllata ed attendere il completo recupero.
NOTA: Nella nostra esperienza questo richiede circa 10 min. Non lasciare incustoditi e animali fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
2. Post-Processing
- Export B-mode e immagini PW-Doppler come file DICOM e salvarli su un personal computer. Trasforma file PW-Doppler DICOM per immagini TIFF.
- Immagini B-mode processo.
- Importare il file DICOM corrispondente utilizzando l'interfaccia grafica utente dedicato (GUI).
- Per inizializzare i contorni, tracciare una linea vicino alla parete di fondo del recipiente (singolo click per avviare e fare doppio clic per porvi fine) e fare doppio clic vicino al muro vicino. Una linea parallela a quella in prossimità della parete di fondo apparirà automaticamente. Applicare l'algoritmo su un singolo fotogramma premendo il tasto "Analyse".
- Controllare il risultato. Se i bordi sono stati identificati correttamente (ie., L'evoluzione dei punti inizializzati hanno rilevato sia il posteriore e la parete anteriore), applicare l'algoritmo sull'intero cine-loop cliccando sul tasto "GO". Se i bordi non vengono identificati correttamente, rimuoverli cliccando su "Cancella profilo" e inizializzare di nuovo dal punto 2.2.2 ripetendo.
NOTA: L'algoritmo è basato sul rilevamento dei bordi e contorno tecniche di monitoraggio ed è stata precedentemente descritta in dettaglio 10. - Ottenere il risultato finale premendo il tasto "RECORD" e salvare il corrispondendo .mat file che contiene i valori di diametro istantanei relativi ad un singolo ciclo cardiaco.
- Aprire la GUI per l'implementazione del ciclo lnD-V.
- Fare clic sul pulsante "Velocity" al fine di avviare PW-Doppler di elaborazione delle immagini che porta ad un unico battito significare curva di velocità.
- Identificare la traccia PW-Doppler e la riga corrispondente ad un valore di velocità pari a zero premendo il tasto "LINE BIANCA".
- Eseguire la calibrazione della velocità e la taratura tempo utilizzando i tasti "TIME" "Velocity" e (nel pannello di calibrazione), rispettivamente. Premendo su questi pulsanti permette di disegnare una linea la cui lunghezza corrisponde al fattore di calibrazione inserito.
- selezionare manualmente una ROI contenente i segnali fisiologici utilizzando il pulsante "ROI PHYSIO".
- selezionare manualmente una ROI contenente la traccia PW-Doppler premendo il tasto "ROI SIGNAL".
- Click sul tasto "Analyse" e verificare se la busta è identificata. Se il risultato non è soddisfacente, modificare la soglia (digitando il nuovo valore nel campo "Velocity Threshold" modificabile testo) e premere nuovamente il tasto "Analyse". Tune la soglia da caso a caso, a seconda della qualità delle immagini. Premere il pulsante "elaborazione".
- Individuare R picchi del segnale ECG e dividere il segnale di inviluppo di velocità di conseguenza facendo clic sul pulsante "Aggiorna". Scegli battute che non siano danneggiati dal rumore o trovano nella fase di inspirazione facendo clic sul pulsante "Scegli BEATS". In questo modo, ottenere un singolo battito velocità media della forma d'onda.
- Utilizzare il Fast Fourier Transform metodo per interpolare i battiti selezionati nel dominio della frequenza e renderli tutti composti dallo stesso numero di punti, come descritto in riferimento 11. Eseguire questa operazione automaticamente premendo semplicemente il retchiave urna sulla tastiera del PC una volta che i battiti sono stati selezionati. Se la casella di controllo "velocità media" è selezionata il singolo battito significare segnale di velocità si ottiene dividendo la curva di velocità massima per due, ipotizzando un profilo di velocità parabolica 12. Premere il tasto "OK".
- Fare clic sul pulsante "DIAMETRO". Interpolare il diametro della forma d'onda a singolo battito nel dominio del tempo al fine di ottenere un segnale di diametro singolo battito con la stessa frequenza di campionamento del segnale di velocità singolo battito premendo il tasto "INTERPOLATE". Fare clic sul pulsante "OK".
NOTA: Per avere il diametro singolo battito e media curve di velocità con la stessa frequenza di campionamento e lo stesso numero di punti di dati, vengono interpolati nel dominio della frequenza. - Selezionare l'approccio "Secondo derivato", come il metodo di allineamento (sopra il grafico che visualizza le forme d'onda di diametro e velocità) e cliccare sul butto "UPDATE"n. Le due curve saranno automaticamente allineato temporalmente con il secondo metodo derivata 14.
- Costruire il ciclo finale lnD-V tracciando il logaritmo naturale dei valori di diametro singolo-beat contro il singolo battito significare valori di velocità. Questo viene fatto automaticamente quando le due forme d'onda sono allineati. Nota: i punti compresi tra il 5% ed il 90% del valore massimo del singolo battito significano curva di velocità si trovano automaticamente l'interpolazione lineare su questi punti viene applicata per valutare la pendenza della parte lineare del ciclo.
- Calcola PWV secondo la seguente equazione 7
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Representative Results
L'approccio proposto è stato applicato a topi dell'aorta addominale in un precedente studio 11. Le seguenti figure mostrano i risultati dell'applicazione del metodo descritto sulle immagini topi reali. Questi dati sono da un singolo animale (topo wild type, 13 settimane, ceppo: C57BL6, peso: 33 g) In particolare, la figura 1 rappresenta il risultato dell'analisi delle immagini ecografiche. rilevamento dei bordi e tracking contorno tecniche applicate alle immagini B-mode acquisite con il frame rate elevato ECG-gated modalità fornisce la forma d'onda di diametro; d'altra parte, l'identificazione del segnale di inviluppo PW-Doppler conduce al singolo battito significa valutazione curva di velocità. La valutazione del singolo battito significa forme d'onda di velocità comprende la media dei dati da diversi cicli cardiaci. Per riportati i dati, la deviazione standard delle curve di velocità (calcolato come media della deviazione standard ottenuta aogni punto di tempo) è 0,0137 m / sec.
Diametro e significare singolo battito forme d'onda di velocità vengono interpolati sia nel dominio della frequenza e del tempo e quindi allineati temporalmente (Figura 2A). Il ciclo lnD-V viene ottenuta riportando i valori di diametro logaritmo naturale contro le misure di velocità media, come mostrato nella figura 2B. PWV è valutata calcolando la pendenza della parte lineare del ciclo, che è noto per corrispondere alla fase sistolica anticipo. Questa porzione viene automaticamente identificato come quello corrispondente alla curva ascendente della curva di velocità media. Questi dati indicano che le operazioni di elaborazione delle immagini necessarie per l'attuazione della tecnica proposta porta ad un ciclo finale lnD-V che è simile a quelle ottenute negli uomini utilizzando un approccio simile 7. Ciò suggerisce che questa tecnica potrebbe rappresentare una valida alternativa per la valutazione PWV non invasiva nei topi.
Figura 1: Lavorazione dei B-mode e immagini PW-Doppler. Immagini B-mode (a) sono trattati con tecniche di rilevamento dei bordi e di monitoraggio di contorno. Immagini PW-Doppler (b) vengono elaborati per l'identificazione del segnale di inviluppo da cui significa singolo battito velocità della forma d'onda si ottiene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Implementazione di lnD-V Loop per PWV Calcolo. Diametro e significare forme d'onda di velocità ottenuti da B-mode e PW-Doppler di elaborazione delle immagini. (A). Il ciclo lnD-V si ottiene tracciando la logari naturaleTHM dei valori di diametro contro i valori medi di velocità (b). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, un algoritmo di elaborazione delle immagini basato sul ciclo lnD-V per la valutazione PWV nei topi è stata descritta in dettaglio. L'approccio proposto si basa sulla trasformazione di immagini ecografiche solo e, quindi, potrebbe rappresentare una valida alternativa alle tecniche esistenti 6, 13 per la valutazione della rigidità arteriosa in modelli murini. Infatti, al contrario di metodi invasivi 6 che si basano sul rilevamento di segnali di pressione intra-arteriosa e richiedono l'animale da sacrificare, questa tecnica è completamente non-invasivo e, pertanto, può essere particolarmente adatta nel caso di studi longitudinali. Inoltre, esso fornisce una valutazione della rigidità arteriosa che è locale e non regionale. Anche se il metodo proposto è noto per essere influenzato da l'onda riflessa 15, può fornire una valutazione più precisa PWV rispetto ad altri approcci basati negli Stati Uniti per PW localeValutazione V, come quello basato sulla tecnica flusso area 13 che richiede l'acquisizione dei dati di colore flusso in proiezione trasversale. Il valore PWV mostrato nella sezione "Risultati rappresentativi", pari a 1,69 m / sec, è in linea con quanto riportato in riferimento 11: infatti, in questo studio, addominale dell'aorta PWV era pari a 1,91 ± 0,44 m / sec in topi adulti e 2.71 ± 0.63 m / sec in animali vecchi.
Al fine di ridurre al minimo gli errori nelle valutazioni PWV, grande attenzione deve essere pagato quando l'acquisizione di immagini degli Stati Uniti. In particolare, le immagini B-mode devono essere acquisiti con chiare pareti anteriori e posteriori per ottenere una curva di diametro che non è corrotto da rumore. Per quanto riguarda le immagini PW-Doppler, la correzione angolare dovrebbe essere minimizzato. Il valore di 60 gradi può rappresentare, nella maggior parte dei casi, un buon compromesso tra una buona vista asse lungo e una buona approssimazione di componenti di velocità. Furthermore, nel caso di studi longitudinali con misurazioni ripetute, occorre prestare attenzione nell'imaging recipiente nello stesso modo, cioè con la stessa proiezione scansione.
Il principale limite dell'approccio presentato riguarda il fatto che le immagini necessarie per il diametro e significano valutazioni di forme d'onda di velocità non vengono acquisiti contemporaneamente. Questa mancanza di simultaneità può rappresentare una fonte di errori di valutazione PWV e rendere la misura meno precisa. Inoltre, un vero acquisizione contemporanea garantirebbe un allineamento migliore tempo tra le due curve ed evitare problemi legati alla variabilità della frequenza cardiaca. Da un punto di vista pratico, un'altra limitazione potrebbe essere la mancanza di disponibilità della modalità frame rate elevato ECG-gated. Questo problema può essere superato parzialmente acquisizione di immagini in B-mode modalità e regolando i parametri di acquisizione al fine di ottenere la massima risoluzione temporale. In questo caso, il segnale di diametro dovrebbeessere diviso per la base ECG e trattati nello stesso modo del segnale di velocità, al fine di ottenere una singola forma d'onda di diametro battito. Tuttavia, in alcune condizioni, la risoluzione temporale ottenuto non sarà adeguato per raggiungere un segnale di diametro valida. modificazioni future della catena di elaborazione dell'immagine scopo di superare queste limitazioni migliorerebbe la tecnica e portare a una valutazione più precisa della rigidità arteriosa locale.
Le future applicazioni dell'approccio presentato riguarderebbero altri distretti arteriosi. Effettivamente, grazie al fatto che essa richiede l'acquisizione di B-mode e solo le immagini PW-Doppler, questo metodo possono essere facilmente applicati ad altri siti arteriosi, come l'arteria carotide, fornisce quindi una valutazione rigidità arteriosa multi-site. Una sonda maggiore frequenza dovrebbe essere scelto per le arterie più superficiali come carotide comune; in ogni caso, la scelta della sonda deve garantire la corretta visualizzazione dell'arteria per donnalui gli animali dello studio. In conclusione, il sistema descritto potrebbe offrire un modo semplice per valutare le proprietà funzionali di varie arterie in modelli murini.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
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