Summary
Arteriel stivhed er en nøglefaktor i hjertekarsygdomme og Pulsbølgehastigheden (PWV) kan betragtes som et surrogat indeks for arteriel stivhed. Denne protokol beskriver en billedbehandling algoritme til beregning PWV i mus baseret på ultralyd billedbehandling, der er gældende på forskellige arterielle sites.
Abstract
Arteriel stivhed kan vurderes ved at beregne Pulsbølgehastigheden (PWV), dvs. den hastighed, hvormed pulsbølgen rejser i en ledning fartøj. Denne parameter i stigende grad undersøgt i små gnaver modeller, hvor det bruges til at vurdere ændringer i vaskulær funktion relateret til bestemte genotyper / behandlinger eller til karakterisering hjertekarsygdomme progression. Denne protokol beskriver et billedbehandlingssystem algoritme, der fører til ikke-invasiv arteriel PWV måling i mus kun bruger ultralyd (US) billeder. Den foreslåede teknik er blevet anvendt til at vurdere abdominale aorta PWV i mus og evaluere sine aldersbetingede ændringer,.
Abdominal aorta Amerikanske scanninger opnås fra mus under gasformig anæstesi ved hjælp af en bestemt amerikansk enhed udstyret med højfrekvente amerikanske sonder. B-mode og Pulse-Wave Doppler (PW-Doppler) billeder analyseres for at opnå diameter og betyder velocity øjeblikkelige værdier henholdsvis. Til dette formål er kant afsløring og kontur sporing teknikker anvendt. Den fælles-slag middeldiameter og hastigheds bølgeformer er tidsjusteret og kombineret for at opnå diameteren-hastighed (LND-V) sløjfe. PWV værdier opnået fra hældningen af den lineære del af sløjfen, som svarer til den tidlige systoliske fase.
Med den foreliggende fremgangsmåde, anatomisk og funktionel information om musen abdominale aorta kan være ikke-invasivt opnået. Krav om behandlingen af amerikanske kun billeder, kan det udgøre et nyttigt redskab for den ikke-invasiv karakterisering af forskellige arterielle steder i musen i form af elastiske egenskaber. Anvendelsen af den foreliggende teknik kan let udvides til andre vaskulære distrikter, såsom halspulsåren, hvilket giver mulighed for at få en multi-site arteriel stivhed vurdering.
Introduction
Musemodeller er i stigende grad anvendt til undersøgelse af hjerte-kar-sygdom (CVD) og især anvendt i longitudinelle studier, der tillader karakterisering af forskellige faser af sygdommen udvikling 1. Elastiske egenskaber af store arterier er relateret til forskellige patologiske tilstande; fra et teknisk synspunkt, kan arteriel stivhed vurderes ved at måle puls bølge hastighed (PWV), som repræsenterer den hastighed, hvormed den puls bølge rejser i en kanal beholder 2. På grund af sin kliniske signifikans, er det i stigende grad måles selv i prækliniske små dyremodeller 3.
Forskellige teknikker er tilgængelige til at vurdere PWV i mus. Invasive metoder er baseret på anvendelsen af kateter-tip tryktransducere. PWV vurderes ved at erhverve tryksignaler ved to forskellige arterielle steder og dividere afstanden mellem de to målinger sites ved tidsforskydningen mellem signalerne 4. Den største ulempe forbundet med disse typer af teknikker er, at de kræver dyreoffer for evalueringen af afstanden mellem de to målesteder og således ikke kan anvendes i longitudinelle studier. For at overvinde denne begrænsning, ikke-invasive metoder, baseret på forskellige billeddannelsesteknikker, er blevet udviklet. Tidligere undersøgelser har rapporteret PWV vurderinger i mus opnået ved at anvende transittiden metode på velocity-kodet magnetisk resonans data 5 og Pulserende-Doppler-signaler 6. Imidlertid PWV værdi opnået med disse metoder er en regional evaluering af arteriel stivhed. Faktisk repræsenterer en gennemsnitsværdi, der tegner sig for forskellige arterier med hensyn til størrelse og elastiske egenskaber. Desuden er disse typer af evalueringer kræve, at vurderingen af afstanden mellem de to målinger lokaliteter, som er en kilde til fejl, som kunne influence det endelige resultat.
PWV kan vurderes ved hjælp af diameteren-hastighed (LND-V) loop 7. Denne metode er baseret på den samtidige vurdering af værdier diameter og strømningshastighed i en udvalgt beholder. Ifølge denne fremgangsmåde er LND-V loop opnået ved afbildning værdier diameter naturlige logaritme vs betyde hastighedsværdier og PWV estimeres ved at beregne hældningen af den lineære del af den opnåede sløjfe svarende til den tidlige systoliske fase. Med hensyn til den praktiske gennemførelse af denne metode, har tidligere værker allerede rapporteret resultater om dens anvendelse i en in vitro set-up system 7 og dets anvendelse til vurdering af både carotis og femoralis PWV hos mennesker 8.
Hovedformålet med denne undersøgelse er at give en detaljeret beskrivelse af et billede algoritme, der giver en ikke-invasiv arteriel PWV måling i mus ved hjælp af US billeder kun. Den foreslåede fremgangsmåde tillader evaluering af lokal arteriel stivhed ved hjælp af behandling af både B-mode og Pulsed-Wave Doppler (PW-Doppler) billeder og kan anvendes på arterier af central betydning, såsom den abdominale aorta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med det europæiske direktiv (2010/63 / UE) og den italienske lov (D.Lvo 26/2014), og det fulgte principper for forsøgsdyr pleje. Den lokale Etisk godkendelse Panel godkendt undersøgelsen.
1. Imaging Procedure
- Placer musen i en anæstesi induktion kammer fyldt med 2,5% isofluran i 1 l / min rent oxygen. Kontroller dybden af anæstesi ved passivitet til tå knivspids.
- Placer dyret på en temperatur kontrolleret bord i rygleje. Fugt dyrets øjne med øjet salve, for at undgå dem køre tør. Levere bedøvelsesmiddel gasstrøm (1,5% isofluran) ved at placere musens næse i den dedikerede næsekegle. Om nødvendigt justeres den procentdel af isofluran fra sag til sag, afhængigt af dyret under studiet. Fastgør bestyrelsen temperaturen ved 40 ° C.
- Coat de fire lemmer af dyret med ledende pasta og tape dem på EKG-elektroder indlejret ibestyrelse. Mål kropstemperaturen med en rektal sonde smurt med vaseline. Kontroller, at alle de fysiologiske målinger (EKG og respiration signal samt temperatur) erhverves og vises korrekt.
- Fjern hår kemisk fra maven med rigtige spørgsmål fløde og pels det med akustisk gel.
- Placer (13-24 MHz) amerikanske sonde i den mekaniske arm.
- Fastgør amerikanske sonde parallelt til dyret og justere sin position for at opnå langsgående billeder af den abdominale aorta med området af interesse ligger i den fokale zone.
- Saml anatomiske oplysninger.
- Klik på knappen giver den høje billedfrekvens EKG-gated erhvervelse 9, vælge en erhvervelse billedhastighed svarende til 700 fps og starte købet. Bemærk: På denne måde kan erhverves anatomiske billeder af fartøjet knyttet til et enkelt hjertecyklus.
- Saml strømningshastighed information. </ Strong>
- Brug af samme scanning projektion, skal du klikke på knappen PW-Doppler, placere prøven volumen i midten af skibet og hente billeder, der sikrer, at cine loop er ikke kortere end 3 s. Fremskaffe disse data opretholde korrektionen vinkel så lille som muligt, tilpasser det fra sag til sag på grundlag af den amerikanske projektion opnået.
- Fjern dyret fra temperaturstyrede bord og vente på fuldstændig helbredelse.
BEMÆRK: Det er vores erfaring dette tager omkring 10 min. Lad ikke og dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
2. Efterbehandling
- Eksport B-mode og PW-Doppler billeder som DICOM-filer og gemme dem på en personlig computer. Transform PW-Doppler DICOM-filer til .tiff billeder.
- Proces B-mode billeder.
- Importer tilsvarende DICOM-fil ved hjælp af den dedikerede Graphical User Interface (GUI).
- Sådan initialiserer konturer, trække en linje tæt på langt væg af beholderen (enkelt klik for at starte den og dobbeltklik for slutter det) og dobbeltklik på tæt på nær væg. En linje parallelt med tæt på langt væg vises automatisk. Påfør algoritme på en enkelt ramme ved at trykke på "ANALYSE" knappen.
- Kontrollere resultatet. Hvis kanterne er blevet identificeret korrekt (dvs.., Har udviklingen af de initialiserede punkter registreres både den bageste og den forreste væg), gælder den algoritme på hele cine-loop ved at klikke på knappen "GO". Hvis kanterne ikke er korrekt identificeret, fjerne dem ved at klikke på "Clear Contour", og initialisere dem igen ved at gentage punkt 2.2.2.
BEMÆRK: Algoritmen er baseret på kant afsløring og kontur sporing teknikker og er blevet beskrevet tidligere i detaljer 10. - Få det endelige resultat ved at trykke på "RECORD" knappen og gemme corresponding .mat fil, der indeholder øjeblikkelige diameter værdier relateret til en enkelt hjertecyklus.
- Åbn GUI for LND-V loop gennemførelse.
- Klik på "VELOCITY" knappen for at starte PW-Doppler billedbehandling, som fører til en enkelt-beat betyder hastighed kurve.
- Identificer PW-Doppler spor og find den linje, der svarer til en hastighed værdi lig nul, ved at trykke på "WHITE LINE" knappen.
- Udfør hastighed kalibrering og tid kalibrering ved at bruge "VELOCITY" og "TIME" knapper (i Calibration panel), hhv. Ved at trykke på disse knapper gør det muligt at trække en linje, hvis længde svarer til kalibreringsfaktoren indsat.
- Vælg manuelt en ROI der indeholder de fysiologiske signaler ved at bruge "ROI PHYSIO" knappen.
- Vælg manuelt en ROI der indeholder PW-Doppler spor ved at trykke på knappen "ROI SIGNAL".
- Click på "ANALYSE" knappen og se om kuverten er identificeret. Hvis resultatet ikke er tilfredsstillende, ændre tærsklen (ved at skrive den nye værdi i "Velocity Threshold" redigerbart tekstfelt) og tryk på "ANALYSE" igen. Tune tærsklen fra tilfælde til tilfælde, afhængigt af kvaliteten af billederne. Tryk på "ELABORATION" knappen.
- Find R-toppe af EKG-signalet og dividere hastigheden kuvert signal i overensstemmelse hermed ved at klikke på knappen "Opdater". Vælg beats, der ikke er ødelagt af støj eller placeret i inspiration fase ved at klikke på "VÆLG BEATS" knappen. På denne måde opnå en enkelt-beat betyder hastighed bølgeform.
- Brug Fast Fourier Transform metode til at interpolere de valgte slag i frekvensdomænet og gøre dem alle består af det samme antal punkter, som beskrevet i henvisning 11. Udfør denne operation automatisk ved blot at trykke på rurn tast på PC-tastaturet, når beats er blevet udvalgt. Hvis afkrydsningsfeltet "MEAN VELOCITY" er markeret enkelt slag betyder hastighed signal opnås ved at dividere den maksimale hastighed kurve med to, hypoteser en parabolsk hastighedsprofil 12. Tryk på knappen "OK".
- Klik på "DIAMETER" knappen. Interpolere diameteren bølgeform single-beat i tidsdomænet for at opnå en enkelt-beat diameter signal med den samme prøve frekvens som single-beat hastighed signal ved at trykke på "interpolere" -knappen. Klik på "OK" knappen.
BEMÆRK: For at få det indre-beat diameter og betyde hastighedskurverne med den samme prøve frekvens og det samme antal datapunkter, er de interpolerede i frekvensdomænet. - Vælg "Andet derivat" tilgang som tilpasningen metode (over grafen viser kurver diameter og hastighed), og klik på "Opdater" knap en. De to kurver vil automatisk blive tid alliancefrie ved hjælp af den anden afledede metode 14.
- Byg den endelige LND-V loop ved at plotte den naturlige logaritme af værdier de enkelt-beat diameter mod den single-beat betyder velocity værdier. Dette bliver automatisk gjort, når de to kurver er justeret. Bemærk: De punkter indbefattet mellem 5% og 90% af den maksimale værdi af det indre-beat betyder Anslagsdynamikken automatisk placeret og en lineær interpolation på disse punkter anvendes til at vurdere hældningen af den lineære del af løkken.
- Beregn PWV ifølge følgende ligning 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreslåede strategi er blevet anvendt til mus abdominale aorta i en tidligere undersøgelse 11. De følgende figurer viser resultaterne af anvendelsen af den beskrevne fremgangsmåde på rigtige mus billeder. Disse data stammer fra et enkelt dyr (vild type mus, 13 uger gamle, stamme: C57BL6, vægt: 33 g) Især figur 1 repræsenterer resultatet af analysen af de amerikanske billeder. Edge detection og kontur sporing teknikker, der anvendes til B-mode billeder erhvervet med den høje billedhastighed EKG-gated modalitet giver bølgeform diameter; på den anden side identifikationen af PW-Doppler signal kuvert fører til den enkelt-beat betyde vurdering hastighed kurve. Evalueringen af single-beat betyder hastighed kurver omfatter gennemsnit af data fra forskellige hjerte-cyklusser. For vist dataene, standardafvigelsen hastighedskurverne (beregnet som gennemsnittet af standardafvigelsen fås ved henvendelse tilhvert tidspunkt) er 0,0137 m / sek.
Single-beat diameter og middelhastighed bølgeformer er interpoleret i både frekvens og tid domæne og derefter tidsjusteret (figur 2A). Den LND-V loop fås ved at afsætte den naturlige logaritme diameter værdier vs. de gennemsnitlige hastighedsmålinger, som vist i figur 2B. PWV vurderes ved at beregne hældningen af den lineære del af løkken, som er kendt for at svare til den tidlige systoliske fase. Denne del er automatisk identificeret som den, der svarer til toppens forside af den gennemsnitlige hastighed kurve. Disse tal viser, at de billedbehandlingsfunktioner operationer er nødvendige for gennemførelsen af den foreslåede teknik fører til en endelig LND-V loop som ligner den, der opnås i mennesker ved hjælp af en lignende fremgangsmåde 7. Dette antyder, at denne teknik kunne udgøre et gyldigt alternativ for ikke-invasiv PWV vurdering i mus.
Figur 1: Behandling af B-mode og PW-Doppler-billeder. B-tilstand billeder (a) behandles ved hjælp af kant afsløring og kontur sporing teknikker. PW-Doppler-billeder (b) behandles til identifikation af konvolutten signal, hvorfra single-beat betyder opnås hastighed bølgeform. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Gennemførelse af LND-V Loop for PWV Beregning. Diameter og betyder velocity kurver opnået fra B-mode og PW-Doppler billedbehandling. (A). Den LND-V loop fås ved at afsætte den naturlige logariTHM værdier diameteren mod middelhastigheden værdier (b). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse har et billedbehandlingssystem algoritme baseret på LND-V loop for PWV vurdering i mus blevet beskrevet i detaljer. Den foreslåede tilgang er baseret på behandling af de amerikanske kun billeder og dermed kunne udgøre et gyldigt alternativ til eksisterende teknikker 6, 13 til evaluering af arteriel stivhed i musemodeller. Faktisk omvendt til invasive metoder 6 som er baseret på erhvervelse af intra-arterielle tryksignaler og kræver dyret, der skal aflives, denne teknik er fuldstændig ikke-invasiv og derfor kan være særligt egnet i tilfælde af langsgående undersøgelser. Desuden giver det en vurdering af arteriel stivhed, som er lokal og ikke regionalt. Selv om den foreslåede metode er kendt for at være påvirket af den reflekterede bølge 15, kan det give en mere præcis PWV vurdering med hensyn til andre USA-baserede tilgange til lokal PWV vurdering, som den, der er baseret på flow-området teknik 13, som kræver erhvervelse af farve-flow data i tværsnit projektion. Den PWV værdi vist i afsnittet "Repræsentative resultater", svarende til 1,69 m / sek, er på linje med, hvad der er rapporteret i henvisning 11: i virkeligheden, i denne undersøgelse, abdominale aorta PWV var lig med 1,91 ± 0,44 m / sek i voksne mus og 2,71 ± 0,63 m / sek i gamle dyr.
For at minimere fejl i PWV vurderinger, stor opmærksomhed skal betales ved erhvervelse amerikanske billeder. Især bør B-mode billeder erhverves med meget klare anteriore og posteriore vægge for at opnå en diameter kurve, som ikke er beskadiget af støj. Med hensyn til PW-Doppler billeder, skal korrektionen vinkel minimeres. Værdien på 60 grader kan repræsentere, i de fleste tilfælde et godt kompromis mellem en god lang akse visning og en god tilnærmelse af hastighedskomponenter. Furthermore i tilfælde af langsgående undersøgelser med gentagne målinger, skal man passe på at afbilde fartøjets på samme måde, dvs. med samme scanning projektion.
Den væsentligste begrænsning af den præsenterede fremgangsmåde vedrører det forhold, at de billeder der kræves til diameter og middelhastigheden bølgeform beregningerne, ikke erhverves samtidig. Denne mangel på samtidighed kan udgøre en fejlkilde for PWV vurdering og gøre målingen mindre præcis. Desuden vil en reel samtidige erhvervelse garantere et bedre tidspunkt alignment mellem de to kurver og undgå problemer i forbindelse med hjertefrekvens variabilitet. Fra et praktisk synspunkt, kunne en anden begrænsning være manglen på tilgængeligheden af den høje billedfrekvens EKG-gated modalitet. Dette problem kan delvis overvindes ved at erhverve billeder i B-mode modalitet og justering af parametrene erhvervelse for at opnå den højeste tidsopløsning. I dette tilfælde bør signal diameterendivideres med EKG base og behandles på samme måde som hastigheden signal, med henblik på at opnå en enkelt slag diameter bølgeform. Men i nogle betingelser, det opnåede tidsopløsning vil ikke være hensigtsmæssigt at opnå en gyldig diameter signal. Fremtidige ændringer af billedbehandling kæde til formål at overvinde disse begrænsninger vil forbedre teknikken og føre til en mere præcis vurdering af lokal arteriel stivhed.
Fremtidige anvendelser af præsenterede fremgangsmåde vil vedrøre andre arterielle distrikter. Effektivt, takket være det faktum, at det kræver erhvervelse af B-mode og PW-Doppler billeder kun denne metode kan let anvendes på andre arterielle steder, såsom halspulsåren, hvilket giver en multi-site arteriel stivhed vurdering. En højere frekvens sonde bør vælges for mere overfladiske arterier såsom almindelig carotis; Under alle omstændigheder bør valget af proben sikre korrekt visualisering af arterien til the dyr i undersøgelsen. Som konklusion kan det beskrevne system giver en enkel måde at vurdere funktionelle egenskaber af forskellige arterier i musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
