Summary
Артериальная жесткость является ключевым фактором в сердечно-сосудистой системы скорости болезни и пульсовой волны (СПВ) можно рассматривать в качестве суррогатного показателя артериальной жесткости. Этот протокол описывает алгоритм обработки изображения для вычисления PWV у мышей, основанных на обработке изображений ультразвука, который применим в различных артериальных участках.
Abstract
Артериальная жесткость может быть оценена путем вычисления скорости пульсовой волны (СПВ), то есть скорость , с которой пульсовая волна движется по трубе судна. Этот параметр чаще исследуется в небольших моделях на грызунах, в которых он используется для оценки изменений в сосудистой функции, относящиеся к конкретным генотипов / лечения или для характеристики прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. Этот протокол описывает алгоритм обработки изображений, который приводит к неинвазивного измерения артериального СПВ у мышей с использованием только Ультразвуковое исследование (УЗИ) изображения. Предложенная методика была использована для оценки брюшной аорты СПВ у мышей и оценивать его возрастные изменения.
Брюшного отдела аорты США сканирования получают из мышей при газовой анестезии с использованием конкретного США устройство, имеющее высокочастотных американских зондов. В-режиме и пульсовой волны Доплера (PW-Doppler) изображения анализируются с целью получения диаметра и средней мгновенные значения скорости, соответственно, Для этой цели используются методы обнаружения края и отслеживания контура. Одиночная биений означают формы волны диаметр и скорость выровнены по времени, и в сочетании с тем, чтобы достичь диаметра скорости (Lnd-V), петля. значения СРПВ получаются из наклона линейной части петли, что соответствует ранней систолической фазы.
При современном подходе, анатомических и функциональной информации о мыши брюшной аортой может быть неинвазивным достигнута. Требование обработки изображений США только, он может представлять собой полезный инструмент для неинвазивного определения характеристик различных артериальных участков в мыши с точки зрения упругих свойств. Применение данного метода может быть легко распространен на другие сосудистые районах, таких как сонная артерия, обеспечивая тем самым возможность получить оценку жесткости артерий с несколькими абонентами.
Introduction
Мышиные модели все чаще используются для исследования сердечно - сосудистых заболеваний (ССЗ) и особенно часто используется в продольных исследований , которые позволяют охарактеризовать различные фазы развития болезни 1. Упругие свойства крупных артерий связаны с различными патологическими состояниями; с технической точки зрения, артериальная жесткость может быть оценена путем измерения скорости пульсовой волны (СПВ), которая представляет собой скорость , с которой пульсовая волна движется по трубе резервуара 2. Из - за его клиническое значение, она все чаще измеряется даже в доклинических маленьких животных моделях 3.
Различные методы доступны для оценки СПВ у мышей. Инвазивные подходы основаны на использовании датчиков давления катетер-наконечник. СПВ оценивают путем обнаружения сигналов давления на двух различных артериальных участков и делением расстояния между двумя измерения SИТЭС временным сдвигом между сигналами 4. Основной недостаток связан с этими видами методов состоит в том, что они требуют жертву животных для оценки расстояния между двумя узлами измерений и, таким образом, не могут быть использованы в продольных исследованиях. Чтобы преодолеть это ограничение, неинвазивные подходы, основанные на различных методов визуализации, были разработаны. Предыдущие исследования сообщали оценки СПВ у мышей , полученных с применением метода времени пролета по данным магнитно - резонансной визуализации скорости кодированного 5 и импульсно-доплеровских сигналов 6. Тем не менее, значение СПВ, полученные с этими методами является региональной оценки жесткости артерий. На самом деле, она представляет собой среднее значение, что составляет для различных артерий с точки зрения размера и упругих свойств. Кроме того, эти виды оценок требуют оценки расстояния между двумя измерениями участков, который является источником ошибок, которые могут Influence конечный результат.
СПВ можно оценить с помощью диаметра скорости (LND-V) контура 7. Этот метод основан на одновременной оценки значений диаметра и скорости потока в выбранном сосуде. В соответствии с этим подходом, цикл Lnd-V получают значения диаметров натуральный логарифм планировавших против средние значения скорости и СПВ оценивается путем расчета наклона линейной части полученного контура, соответствующего ранней систолической фазы. Что касается практической реализации этого метода, предыдущие работы уже сообщали о результатах его применения в наборе системы контроля 7 в пробирке и ее использование для оценки обеих сонных и бедренных СПВ у человека 8.
Основной целью настоящего исследования является предоставление подробного описания алгоритма обработки изображений, который обеспечивает неинвазивный артериальное измерение СПВ у мышей с использованием Uтолько S изображения. Предложенный подход позволяет оценить локальной жесткости артерий путем обработки как B-режиме и импульсно-волновой допплерографии (PW-Доплера) изображений и могут быть применены на артериях, имеющих ключевое значение, таких как брюшной аорты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейской директивой (за 2010/63 / UE) и итальянским законодательством (D.Lvo 26/2014), и она следовала принципам ухода за лабораторными животными. Местный этический Группа Утверждение одобрил исследование.
1. Процедура обработки изображений
- Поместите мышь в наркоз индукционной камере, заполненной 2,5% изофлуран в 1 л / мин чистого кислорода. Проверьте глубину анестезии невосприимчивости до ног крайнем случае.
- Место животное на контролируемой температурой плате в положении лежа на спине. Смочить глаза животного с глазной мазью, чтобы избежать их всухую. Поставка обезболивающий потока газа (1,5% изофлуран), помещая нос мыши в выделенном конусообразной. При необходимости отрегулировать процент изофлюрана от случая к случаю, в зависимости от животного при исследовании. Зафиксируйте температуру платы при 40 ° C.
- Смазать четыре конечности животного с проводящей пасты и ленты их на ЭКГ электродов, внедренных вдоска. Измерьте температуру тела с помощью ректального зонда смазанной вазелином. Убедитесь, что все физиологические измерения (ЭКГ и сигнал дыхания, а также температура) правильно получается и отображается.
- Удалить волосы химически из брюшной полости с депиляции кремом и покрыть его гелем акустической связи.
- Поместите (13-24 МГц) США зонд в механической руки.
- Закрепить зонд параллельно США к животному и регулировать его положение с целью получения продольных изображений брюшной аорты с интересующей области, расположенной в фокальной зоне.
- Сбор анатомической информации.
- Нажмите на эту кнопку , позволяя с высокой частотой кадров с ЭКГ-синхронизацией приобретение 9, выбрать приобретение частоту кадров , равную 700 кадров в секунду и начать сбор данных. Примечание: Таким образом, можно получить анатомические изображения сосуда, связанного с одного сердечного цикла.
- Сбор информации о скорости потока. </ Сильный>
- Используя ту же проекцию сканирования, нажмите на кнопку PW-Допплера, поместите объем образца в центре судна и получать изображения, обеспечивающие, чтобы петля кинокамеры не короче чем на 3 сек. Получить эти данные, сохранив коррекцию угла как можно меньше, регулируя его от случая к случаю на основе проекции США, полученного.
- Удалите животное с контролируемой температурой платы и ждать полного выздоровления.
Примечание: В нашем опыте это занимает около 10 минут. Не оставляйте без присмотра и животных, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
2. Постобработка
- Экспорт в В-режиме и PW-доплеровских изображений в виде DICOM файлов и сохранять их на персональном компьютере. Transform PW-доплеровский DICOM файлы .tiff изображений.
- B-режиме процесса изображения.
- Импорт соответствующий файл DICOM с помощью специального графического интерфейса пользователя (GUI).
- Для инициализации контуров, нарисуйте линию, близкую к дальней стенке сосуда (один клик для запуска его и сделайте двойной щелчок для прекращения его) и дважды щелкните рядом с ближней стеной. Прямая, параллельная, что рядом с дальней стене появится автоматически. Примените алгоритм на один кадр, нажав на кнопку "Анализировать".
- Проверьте результат. Если края были правильно идентифицированы (то есть., Эволюция инициализированными точек обнаружили как задней и передней стенки), применить алгоритм на всей киношной петли, нажав на кнопку "GO". Если края не правильно идентифицировать, очистить их, нажав на кнопку "Clear" Контур и инициализировать их снова повторяя пункт 2.2.2.
Примечание: Алгоритм основан на обнаружении края и контурных методов отслеживания и было ранее описано подробно 10. - Получить окончательный результат, нажав на кнопку "запись" и сохраните коррesponding .mat файл, который содержит значения мгновенного диаметра, относящиеся к одному сердечному циклу.
- Откройте графический интерфейс для реализации LND-V цикла.
- Нажмите на кнопку "Velocity" для того , чтобы начать процесс обработки изображений PW-Доплера , который приводит к одинарной удару средней кривой скорости.
- Определить PW-доплеровский след и найдите строку, соответствующую значению скорости, равной нулю, нажав на кнопку "WHITE LINE".
- Выполнить калибровку скорости и калибровки времени с помощью "Velocity" и кнопки "TIME" (в панели калибровки), соответственно. При нажатии на эти кнопки позволяет нарисовать линию, длина которой соответствует коэффициенту калибровки вставленной.
- Вручную выбрать ROI, содержащий физиологические сигналы с помощью кнопки "ROI физио".
- Вручную выбрать ROI, содержащий PW-доплеровский след, нажав на кнопку "ROI сигнала".
- Cliск на кнопку "Анализировать" и проверьте, если конверт идентифицируется. Если результат не является удовлетворительным, изменения порога (введя новое значение в "Velocity Threshold" редактируемом текстовом поле) и снова нажмите кнопку "Анализировать". Настройтесь порог от случая к случаю, в зависимости от качества изображения. Нажмите кнопку "проработки".
- Найдите R-пиков ЭКГ сигнала и разделить сигнал скорости огибающей, соответственно, нажав на кнопку "Обновить". Выберите биты, которые не испорчены шумом или находящиеся в фазе вдоха, нажав на кнопку "Выбирай биений". Таким образом, получить сигнал биений средней скорости волны.
- С помощью быстрого преобразования Фурье метод интерполировать выбранные биты в частотной области , и сделать их всех состоят из того же числа точек, как подробно описано в ссылке 11. Выполните эту операцию автоматически простым нажатием RETбыли выбраны урна клавиша на клавиатуре компьютера один раз биений. Если "MEAN Velocity" установлен флажок одиночный бит означает , сигнал скорости достигается путем деления максимальной скорости кривой на два, параболическую гипотез профиля скорости 12. Нажмите кнопку "OK".
- Нажмите на кнопку "ДИАМЕТР". Интерполируйте формы волны диаметра одного удара во временной области для получения сигнала диаметра одного удара с той же частотой дискретизации в качестве сигнала скорости одного ритма, нажав на кнопку "INTERPOLATE". Нажмите на кнопку "OK".
Примечание: Для того чтобы иметь диаметр одного бита и средней кривые скорости с той же частотой дискретизации и то же количество точек данных, они интерполированы в частотной области. - Выберите "второй производной" подход в качестве способа выравнивания (над графиком отображаются формы сигналов диаметра и скорости) и нажмите на кнопку "Обновить" переключатеп. Две кривые будут автоматически выровнены по времени с использованием второй производной метод 14.
- Построить конечный цикл LND-V путем построения графика натуральный логарифм значений диаметра одного налегли одностраничную бить средние значения скорости. Это происходит автоматически, когда два сигнала выровнены. Примечание: Точки, заключенной между 5% и 90% от максимального значения одноленточного такт средней кривой скорости автоматически расположены и линейная интерполяция по этим точкам применяется для оценки наклона линейной части петли.
- Вычислить СПВ в соответствии со следующим уравнением 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Предложенный подход был применен к мышам брюшной аорты в предыдущем исследовании 11. На следующих рисунках показаны результаты применения описанного подхода на реальных мышей изображений. Эти данные взяты из одного животного ( у мышей дикого типа, 13 недель, штамм: C57BL6, вес: 33 г) , в частности, на рисунке 1 представляет собой результат анализа американских изображений. методы обнаружения и слежения за края контура применяются к B-режиме изображений, полученных с высокой частотой кадров ЭКГ-стробированием модальность обеспечивают форму сигнала диаметра; с другой стороны, определение огибающей сигнала PW-Доплера приводит к одно- бить означают оценки кривой скорости. Оценка одиночной ритм средней скорости сигналов включает в себя среднее значение данных из различных сердечных циклов. Для показаны данные, стандартное отклонение кривых скорости (рассчитывается как среднее значение стандартного отклонения, полученного прикаждый раз, когда точка) составляет 0,0137 м / сек.
Single-бит диаметра и средние формы волны скорости интерполируются в частотной и во временной области , а затем выровнены по времени (рис 2А). Цикл LND-V получается выводя значения диаметра натуральный логарифм vs. измерения средней скорости, как показано на рисунке 2B. СПВ оценивается путем расчета наклона линейной части петли, которая, как известно, соответствуют ранней систолической фазы. Эта часть автоматически идентифицируется как соответствующий уклоном вверх средней кривой скорости. Эти данные свидетельствуют о том, что операции по обработке изображений , необходимых для реализации предлагаемого способа приводит к конечной петле LND-V , который аналогичен полученному у людей , использующих подобный подход 7. Это говорит о том, что этот метод может представлять собой реальную альтернативу для неинвазивной оценки СПВ у мышей.
Рисунок 1: Обработка B-режиме и PW-доплеровских изображений. B-режим изображения (а) обрабатываются с использованием методов обнаружения края и отслеживания контура. PW-доплеровские изображения (б) обрабатываются для идентификации сигнала огибающей , из которого одного удара среднего получается форма волны скорости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Реализация-V LND Loop для СПВ расчета. Диаметр и средние формы волны скорости, полученные из B-режиме и обработки изображений PW-Доплера. (А). Цикл LND-V получается путем построения естественной logariTHM значений диаметра от средних значений скорости (б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании, алгоритм обработки изображения на основе цикла Lnd-V для оценки СПВ у мышей была описана подробно. Предложенный подход основан на обработке изображений США только и, таким образом, может представлять собой действительную альтернативу существующим методам 6, 13 для оценки артериальной жесткости в мышиных моделях. На самом деле, наоборот , к инвазивным методам 6 , которые основаны на приобретение внутриартериального сигналов давления и требуют животное в жертву, этот метод является полностью неинвазивным и, таким образом, могут быть особенно пригодны в случае продольных исследований. Кроме того, она обеспечивает оценку жесткости артерий, локальным и не региональным. Хотя предложенный метод , как известно, под влиянием отраженной волны 15, она может обеспечить более точную оценку СПВ в отношении других США на основе подходов для местного PWОценка V, как , например, основанный на технике 13 потока на области , которое требует приобретения данных цветового потока в проекции в поперечном сечении. Значение СПВ показано в разделе "репрезентативные результаты", равный 1,69 м / сек, в соответствии с тем, как сообщается в ссылке 11: на самом деле, в этом исследовании, брюшная аорта СПВ была равна 1,91 ± 0,44 м / сек в взрослых мышей и 2,71 ± 0,63 м / сек у старых животных.
Для того, чтобы минимизировать ошибки в оценках PWV, большое внимание должно быть уделено при получении изображений США. В частности, в В-режиме изображения должны быть получены с очень четкими передней и задней стенки для достижения кривой диаметра, который не будет искажена шумами. Что касается PW-доплеровских изображений, коррекция угла должна быть сведена к минимуму. Значение 60 градусов может представлять собой, в большинстве случаев, хороший компромисс между хорошей длинной оси зрения и хорошей аппроксимации компонент скорости. Furthermoповторно, в случае продольных исследований с повторными измерениями, следует соблюдать осторожность при визуализации сосуда таким же образом, то есть, с той же проекции сканирования.
Основным ограничением представленного подхода относится тот факт, что изображения, необходимые для диаметра и означают оценки скорости формы сигнала не усваиваются одновременно. Это отсутствие одновременности может представлять собой источник ошибок для оценки СПВ и сделать измерение менее точным. Кроме того, реальное одновременное приобретение будет гарантировать лучшее согласование по времени между двумя кривыми и избежать проблем, связанных с вариабельности сердечного ритма. С практической точки зрения, еще одно ограничение может быть отсутствие доступности с высокой частотой кадров ЭКГ-закрытого типа модальности. Эта проблема может быть частично преодолены путем получения изображения в В-режиме модальности и корректировки параметров измерения для того, чтобы достичь максимально временным разрешением. В этом случае сигнал, диаметр долженделится на ЭКГ базы и обрабатывали таким же образом, что и сигнал скорости, с тем чтобы получить единую форму волны диаметра биений. Тем не менее, в некоторых условиях, полученное разрешение по времени будет не целесообразно, чтобы достигнуть действительного сигнала диаметра. Будущие модификации цепочки обработки изображений, направленных на преодоление этих ограничений позволит улучшить технику и привести к более точной оценке локальной жесткости артерий.
Будущие применения представленного подхода будет касаться других артериальных районов. Эффективно, благодаря тому, что он требует приобретения B-режиме и только изображений PW-доплеровские, этот метод может быть легко применен к другим артериальных участков, таких как сонная артерия, обеспечивая тем самым оценку жесткости артерий с несколькими абонентами. Более высокая частота датчика должна быть выбрана для более поверхностных артерий, таких как общей сонной артерии; в любом случае, выбор зонда должен обеспечить правильную визуализацию артерии при ^он животных в исследовании. В заключение отметим, что описанная система может предложить простой способ оценки функциональных свойств различных артерий в мышиных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Никто.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
