Summary
La rigidité artérielle représente un facteur clé dans la maladie et la vitesse d'impulsion vague cardiovasculaires (VOP) peut être considéré comme un indice de substitution pour la rigidité artérielle. Ce protocole décrit un algorithme de traitement d'image pour le calcul de la VOP chez les souris basées sur l'échographie de traitement d'image qui est applicable à différents sites artériels.
Abstract
La rigidité artérielle peut être évaluée en calculant la vitesse d'onde de pouls (PWV), à savoir la vitesse à laquelle l'onde d'impulsion se déplace dans un récipient de type conduit. Ce paramètre est de plus en plus étudié dans des modèles de rongeurs petits dans lesquels elle est utilisée pour évaluer les altérations de la fonction vasculaire liée à des traitements particuliers génotypes / ou pour caractériser la progression de la maladie cardio-vasculaire. Ce protocole décrit un algorithme de traitement d'image ce qui conduit à une mesure VOP artérielle non invasive chez la souris en utilisant des ultrasons (US) uniquement à des images. La technique proposée a été utilisée pour évaluer l'aorte abdominale VOP chez la souris et d'évaluer ses changements liés à l'âge.
aorte abdominale scans américains sont obtenus à partir des souris sous anesthésie gazeuse en utilisant un dispositif US spécifique équipé de haute fréquence des sondes américaines. B-mode et images Pulse-Wave Doppler (PW-Doppler) sont analysés afin d'obtenir le diamètre et la vitesse moyenne des valeurs instantanées, respectivement. A cet effet, les techniques de détection des bords et le suivi des contours sont employés. L'unique battement de diamètre moyen et de la vitesse des formes d'onde sont alignés temporellement et combinés afin d'obtenir le diamètre vitesse (lnD-V) boucle. Les valeurs VOP sont obtenues à partir de la pente de la partie linéaire de la boucle, ce qui correspond à la phase systolique précoce.
Avec l'approche actuelle, anatomique et fonctionnelle des informations à propos de la souris aorte abdominale peut être non invasive réalisée. Exiger le traitement des images américaines seulement, il peut représenter un outil utile pour la caractérisation non-invasive des différents sites artériels chez la souris en termes de propriétés élastiques. L'application de la présente technique peut être facilement étendu à d'autres régions vasculaires, tels que l'artère carotide, offrant ainsi la possibilité d'obtenir une évaluation de la rigidité artérielle multisite.
Introduction
Des modèles de souris sont de plus en plus utilisés pour l'étude des maladies cardiovasculaires (MCV) et plus particulièrement utilisés dans les études longitudinales qui permettent la caractérisation des différentes phases de développement de la maladie 1. Les propriétés élastiques des grandes artères sont liées à différents états pathologiques; à partir d' un point de vue technique, la rigidité artérielle peut être évaluée en mesurant la vitesse de l' onde de pouls (VOP), qui représente la vitesse avec laquelle l'onde de pouls se déplace dans un vaisseau conduit 2. En raison de son importance clinique, il est de plus en mesure , même dans des modèles animaux précliniques 3 petits.
Différentes techniques sont disponibles pour l'évaluation de la VOP chez la souris. des approches invasives sont basées sur l'utilisation de capteurs de pression cathéter à pointe. VOP est évaluée par l'acquisition des signaux de pression à deux sites différents artérielles et en divisant la distance entre les deux mesures deites par le décalage temporel entre les signaux 4. Le principal inconvénient lié à ce genre de techniques est qu'elles nécessitent le sacrifice des animaux pour l'évaluation de la distance entre les deux points de mesure et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés dans des études longitudinales. Pour surmonter cette limitation, les approches de non-invasive, en fonction de différentes techniques d'imagerie, ont été développés. Des études antérieures ont rapporté des évaluations de VOP chez les souris obtenues en appliquant la méthode du temps de transit sur la résonance magnétique des données d'imagerie de vitesse codées 5 et signaux pulsés-Doppler 6. Toutefois, la valeur de la VOP obtenue avec ces méthodes est une évaluation régionale de la rigidité artérielle. En effet, elle représente une valeur moyenne, ce qui représente pour différentes artères en termes de taille et des propriétés élastiques. En outre, ces types d'évaluation nécessitent l'évaluation de la distance entre les deux sites de mesures qui est une source d'erreur qui pourrait influence du résultat final.
VOP peut être évaluée en utilisant le diamètre-vitesse (lnD-V) boucle 7. Cette méthode est basée sur l'évaluation simultanée des valeurs du diamètre et de la vitesse d'écoulement dans un récipient sélectionné. Selon cette approche, la boucle lnD-V est obtenue en traçant les valeurs de logarithme naturel de diamètre vs valeurs moyennes de vitesse et de VOP est estimée en calculant la pente de la partie linéaire de la boucle obtenue correspondant à la phase systolique précoce. En ce qui concerne la mise en œuvre pratique de cette méthode, les travaux précédents ont déjà rapporté des résultats quant à son application dans un in vitro set-up système 7 et son utilisation pour l'évaluation des deux carotides et VOP fémorale chez l' homme 8.
Le but principal de la présente étude est de fournir une description détaillée d'un algorithme de traitement d'image qui fournit une mesure de la VOP artérielle non invasive chez la souris à l'aide de US images seulement. L'approche proposée permet l'évaluation de la rigidité artérielle locale au moyen du traitement des deux B-mode et Pulsed-Wave Doppler (PW-Doppler) images et peut être appliqué sur les artères d'une importance capitale, comme l'aorte abdominale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive européenne (2010/63 / UE) et la loi italienne (D.Lvo 26/2014), et il suivi les principes de protection des animaux de laboratoire. Le Comité d'approbation éthique local a approuvé l'étude.
1. Procédure d'imagerie
- Placer la souris dans une chambre d'induction de l'anesthésie rempli avec 2,5% d'isoflurane à 1 L / min d'oxygène pur. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'insensibilité à pincement de l'orteil.
- Placez l'animal sur une planche à température contrôlée dans une position couchée. Humidifiez les yeux de l'animal avec un collyre, afin d'éviter un fonctionnement à sec. Fournir un anesthésique flux de gaz (1,5% de l'isoflurane) en plaçant le nez de la souris dans le cône de nez dédié. Si nécessaire, ajuster le pourcentage d'isoflurane de cas en cas, en fonction de l'animal à l'étude. Fixer la température de la carte à 40 ° C.
- Enduire les quatre membres de l'animal avec de la pâte conductrice et collez-les sur les électrodes ECG intégrés dans leplanche. Mesurer la température du corps avec une sonde rectale lubrifié avec de la vaseline. Vérifiez que toutes les mesures physiologiques (ECG et signal de respiration ainsi que la température) sont correctement acquises et affichées.
- Enlever les cheveux chimiquement de l'abdomen avec crème dépilatoire et l'enduire de gel de couplage acoustique.
- Placez le (13-24 MHz) sonde américaine dans le bras mécanique.
- Fixer la sonde parallèle US à l'animal et ajuster sa position pour obtenir des images longitudinales de l'aorte abdominale avec la région d'intérêt situé dans la zone focale.
- Recueillir des informations anatomiques.
- Cliquez sur le bouton permettant à la cadence élevée acquisition 9 ECG-gated, choisissez une acquisition de taux de trame égal à 700 fps et lancer l'acquisition. Remarque: De cette manière, des images anatomiques du récipient lié à un seul cycle cardiaque peuvent être acquises.
- Recueillir des informations de vitesse d'écoulement. </ Strong>
- En utilisant la même projection de numérisation, cliquez sur le bouton PW-Doppler, placez le volume de l'échantillon dans le centre du navire et acquérir des images assurant que la boucle ciné est pas moins de 3 s. Obtenir ces données en maintenant la correction d'angle aussi faible que possible, en l'ajustant au cas par cas sur la base de la projection US obtenue.
- Retirer l'animal de la carte à température contrôlée et attendre la guérison complète.
NOTE: Dans notre expérience, cela prend environ 10 min. Ne pas laisser sans surveillance et l'animal jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
2. Post-traitement
- Exporter en mode B et images PW-Doppler en tant que fichiers DICOM et les enregistrer sur un ordinateur personnel. Transformer les fichiers PW-Doppler DICOM aux images .tiff.
- Processus images en mode B.
- Importer le fichier DICOM correspondant en utilisant l'interface utilisateur graphique dédiée (GUI).
- Pour initialiser les contours, tracer une ligne à proximité du mur du fond de la cuve (un simple clic pour le démarrage et double-cliquez pour y mettre fin) et double-cliquez à proximité du mur près. Une ligne parallèle à celle proche du mur du fond apparaîtra automatiquement. Appliquer l'algorithme sur une seule image en appuyant sur le bouton "ANALYSER".
- Vérifiez le résultat. Si les bords ont été correctement identifiés (ie., L'évolution des points initialisées ont détecté la fois la partie postérieure et la paroi antérieure), appliquer l'algorithme sur l'ensemble de cine-loop en cliquant sur le bouton "GO". Si les bords ne sont pas correctement identifiés, désactivez-les en cliquant sur "Effacer Contour" et initialiser à nouveau par point 2.2.2 répéter.
NOTE: L'algorithme est basé sur des techniques de suivi de détection de bord et contour et a été décrit précédemment en détail 10. - Obtenir le résultat final en appuyant sur le bouton "RECORD" et enregistrez le corrÉPONDRE .mat fichier qui contient des valeurs de diamètre instantanés liés à un seul cycle cardiaque.
- Ouvrez l'interface graphique pour la mise en œuvre de la boucle lnD-V.
- Cliquez sur le bouton «VELOCITY» pour démarrer PW-Doppler de traitement d'image qui conduit à un seul battement de courbe de vitesse moyenne.
- Identifier la trace PW-Doppler et de localiser la ligne correspondant à une valeur de vitesse égale à zéro en appuyant sur le bouton "LINE WHITE".
- Effectuer le calibrage de la vitesse et de calibration de temps en utilisant le "Vélocité" et les boutons "TIME" (dans le panneau d'étalonnage), respectivement. En appuyant sur ces boutons permet de tracer une ligne dont la longueur correspond au facteur d'étalonnage inséré.
- Sélectionnez manuellement un retour sur investissement contenant les signaux physiologiques en utilisant le bouton "retour sur investissement de PHYSIO".
- sélectionner manuellement un ROI contenant la trace PW-Doppler en appuyant sur le bouton "ROI SIGNAL".
- Click sur le bouton "ANALYSER" et vérifier si l'enveloppe est identifiée. Si le résultat est pas satisfaisant, modifier le seuil (en tapant la nouvelle valeur dans le champ modifiable de texte "Seuil de vitesse") et appuyez à nouveau sur le bouton "ANALYSER". Réglez le seuil de cas en cas, en fonction de la qualité des images. Appuyez sur le bouton "ELABORATION".
- Repérez les R-pics du signal d'ECG et de diviser le signal d'enveloppe de vitesse en conséquence en cliquant sur le bouton "Mettre à Jour". Choisissez beats qui ne sont pas corrompus par le bruit ou situés dans la phase d'inspiration en cliquant sur le bouton "CHOISIR BEATS". De cette façon, obtenir un seul battement vitesse moyenne de forme d'onde.
- Utilisez le Fast Fourier Transform méthode pour interpoler les battements sélectionnés dans le domaine fréquentiel et les rendre tous composés du même nombre de points, comme indiqué dans la référence 11. Effectuez automatiquement cette opération en appuyant simplement sur le retclé urne sur le clavier du PC une fois que les battements ont été sélectionnés. Si la case "vitesse moyenne" est cochée , le seul battement signifie signal de vitesse est obtenue en divisant la courbe de vitesse maximale par deux, hypothétisation un profil de vitesse parabolique 12. Appuyez sur le bouton "OK".
- Cliquez sur le bouton "DIAMETRE". Interpoler le diamètre forme d'onde unique de battement dans le domaine temporel afin d'obtenir un signal de diamètre unique battement avec la même fréquence d'échantillonnage que le signal de vitesse unique battement en appuyant sur le bouton "INTERPOLATE". Cliquez sur le bouton "OK".
Remarque: Afin d'avoir le diamètre unique battement et la moyenne des courbes de vitesse avec la même fréquence d'échantillonnage et le même nombre de points de données, ils sont interpolés dans le domaine des fréquences. - Sélectionnez le "Second dérivé" approche que la méthode d'alignement (au-dessus du graphique affichant les formes d'onde de diamètre et de vitesse) et cliquez sur "Mettre à Jour" button. Les deux courbes seront automatiquement alignement temporel en utilisant la deuxième méthode dérivée 14.
- Construire la boucle finale lnD-V en traçant le logarithme naturel des valeurs de diamètre unique battement contre le seul battement des valeurs moyennes de vitesse. Ceci est fait automatiquement lorsque les deux formes d'onde sont alignés. Nota: Les points compris entre 5% et 90% de la valeur maximale de l'unique battement moyenne courbe de vitesse est automatiquement localisé et une interpolation linéaire sur ces points est appliquée pour évaluer la pente de la partie linéaire de la boucle.
- Calculer VOP conformément à l'équation 7 suivante
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'approche proposée a été appliquée à des souris aorte abdominale dans une étude précédente 11. Les figures suivantes montrent les résultats de l'application de l'approche décrite sur les images de souris réelles. Ces données proviennent d'un seul animal (souris de type sauvage, vieux de 13 semaines, la souche: C57BL6, poids: 33 g) En particulier, la figure 1 représente le résultat de l'analyse des images américaines. les techniques de détection de bord et de suivi de contour appliqués aux images en mode B acquises avec la fréquence d'images élevée ECG-gated modalité fournir la forme d'onde de diamètre; d'autre part, l'identification de l'enveloppe du signal PW-Doppler conduit à un seul battement signifie l'évaluation de la courbe de vitesse. L'évaluation de l'unique battement moyenne des formes d'onde de vitesse comprend la moyenne des données provenant de cycles cardiaques différents. Pour les données affichées, l'écart-type des courbes de vitesse (calculé comme la moyenne de l'écart type obtenu àchaque point de temps) est 0,0137 m / sec.
Diamètre et moyenne des formes d' onde de vitesse simple battement sont interpolées dans les deux le domaine de fréquence et de temps, puis aligné dans le temps (figure 2A). La boucle lnD-V est obtenue en traçant les valeurs de diamètre du logarithme naturel par rapport aux mesures de vitesses moyennes, comme représenté sur la figure 2B. VOP est évaluée en calculant la pente de la partie linéaire de la boucle, qui est connue pour correspondre à la phase systolique précoce. Cette partie est automatiquement identifié comme étant celui correspondant à la pente ascendante de la courbe de vitesse moyenne. Ces chiffres indiquent que les opérations de traitement d'image nécessaires à la mise en œuvre de la technique proposée conduit à une dernière boucle lnD-V qui est similaire à celle obtenue chez l' homme en utilisant une approche similaire 7. Cela donne à penser que cette technique pourrait représenter une alternative valable pour l'évaluation de la VOP non-invasive chez la souris.
Figure 1: Traitement de mode B et PW-Doppler Images. Images en mode B (a) sont traitées en utilisant des techniques de détection de bord et de suivi de contour. Images PW-Doppler (b) sont traitées pour l'identification du signal d'enveloppe à partir duquel le seul battement vitesse moyenne de forme d' onde est obtenue. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Mise en œuvre de lnD-V Boucle pour VOP Calcul. Diamètre et moyenne des formes d'onde de vitesse obtenues à partir de B-mode et PW-Doppler de traitement d'image. (A). La boucle lnD-V est obtenue en traçant la logari naturellethm des valeurs de diamètre par rapport aux valeurs de vitesse moyenne (b). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cette étude, un algorithme de traitement d'image sur la base de la boucle lnD-V pour l'évaluation VOP chez la souris a été décrite en détail. L'approche proposée est basée sur le traitement des images américaines seulement et, par conséquent, pourrait représenter une alternative valable aux techniques existantes 6, 13 pour l'évaluation de la rigidité artérielle dans les modèles de souris. En effet, à l' inverse des procédés invasifs 6 qui sont basées sur l'acquisition des signaux de pression intra-artérielle et exigent que l'animal soit sacrifié, cette technique est totalement non invasif et, par conséquent, il peut être particulièrement approprié dans le cas des études longitudinales. En outre, elle fournit une évaluation de la rigidité artérielle qui est locale et non régionale. Bien que la méthode proposée est connue pour être influencée par l'onde réfléchie 15, il peut fournir une évaluation plus précise VOP par rapport à d' autres approches basées sur les États - Unis pour PW localeL' évaluation de V, tel que celui basé sur la technique d' écoulement zone 13 qui nécessite l'acquisition des données de flux couleur en projection transversale. La valeur de VOP indiqué dans la section " Les résultats représentatifs», égale à 1,69 m / s, est en ligne avec ce qui est rapporté dans la référence 11: en effet, dans cette étude, l' aorte abdominale VOP était égale à 1,91 ± 0,44 m / s dans souris adultes et 2,71 ± 0,63 m / sec chez les animaux âgés.
Afin de minimiser les erreurs dans les évaluations VOP, une grande attention doit être payé lors de l'acquisition d'images. En particulier, les images en mode B doivent être acquises avec des parois antérieures et postérieures très claires afin d'obtenir une courbe de diamètre qui ne soit pas altéré par du bruit. En ce qui concerne les images PW-Doppler, la correction d'angle doit être réduit au minimum. La valeur de 60 degrés peut représenter, dans la plupart des cas, un bon compromis entre une bonne vue de l'axe long et une bonne approximation des composantes de la vitesse. Furthermore, dans le cas des études longitudinales avec des mesures répétées, il faut prendre soin dans l' imagerie du navire de la même manière, à savoir avec la même projection de balayage.
La principale limitation de l'approche présentée concerne le fait que les images nécessaires pour le diamètre et la moyenne des évaluations de forme d'onde de vitesse ne sont pas acquises simultanément. Ce manque de simultanéité peut représenter une source d'erreur pour l'évaluation de la VOP et effectuer la mesure moins précise. En outre, une véritable acquisition simultanée garantirait un alignement temporel mieux entre les deux courbes et éviter les problèmes liés à la variabilité de la fréquence cardiaque. D'un point de vue pratique, une autre limitation pourrait être le manque de disponibilité de la modalité cadence élevée ECG-gated. Ce problème peut être partiellement surmonté par l'acquisition d'images en mode B et modalité de réglage des paramètres d'acquisition afin d'obtenir la résolution temporelle plus élevée. Dans ce cas, le signal de diamètre devraitêtre divisé par la base de l'ECG et traitées de la même manière que le signal de vitesse, afin d'obtenir une forme d'onde unique d'un diamètre de battement. Cependant, dans certaines conditions, la résolution temporelle obtenue ne sera pas appropriée pour atteindre un signal de diamètre valide. modifications futures de la chaîne de traitement d'image visant à surmonter ces limitations permettraient d'améliorer la technique et conduire à une évaluation plus précise de la rigidité artérielle locale.
Les applications futures de l'approche présentée concerneraient d'autres districts artérielles. En effet, grâce au fait qu'elle nécessite l'acquisition de mode B et les images PW-Doppler uniquement, ce procédé peuvent être facilement appliqués à d'autres sites artériels, comme l'artère carotide, fournissant ainsi une évaluation de la rigidité artérielle multisite. Une sonde de fréquence plus élevée doit être choisie pour les artères les plus superficielles comme la carotide commune; dans tous les cas, le choix de la sonde doit assurer la visualisation correcte de l'artère pour til les animaux dans l'étude. En conclusion, le système décrit pourrait offrir un moyen simple d'évaluer les propriétés fonctionnelles des différentes artères dans les modèles de souris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
