Summary
La méthode à bille pour le marquage des anticorps avec de petites molécules permet l'étiquetage d'une petite quantité d'anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette méthode est compatible avec une amine et de la chimie de thiol, et peut gérer plusieurs échantillons en parallèle, manuellement ou en utilisant des plates-formes automatisées.
Abstract
Les anticorps marqués avec de petites molécules comme des colorants fluorescents, des médicaments cytotoxiques, et des traceurs radioactifs sont des outils essentiels dans la recherche biomédicale, immunodiagnostic et plus récemment en tant qu'agents thérapeutiques. Les méthodes traditionnelles pour marquer des anticorps avec de petites molécules nécessitent des anticorps purifiés à une concentration relativement élevée, comportent plusieurs étapes de dialyse et ont un débit limité. Toutefois, plusieurs applications, y compris le domaine de conjugués anticorps-médicaments (CAN), bénéficieront de nouvelles méthodes qui permettront l'étiquetage des anticorps directement à partir de milieux cellulaires. De tels procédés peuvent permettre d'anticorps à cribler dans des essais biologiques pertinents, par exemple, l'anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur dans le cas de VPA. Ici, nous décrivons un (méthode à bille) procédé qui permet l'étiquetage de petites quantités d'anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette approche utilise grande capacité magnétique protéine A et protéine G billes d'affinité pour capturer des anticorpsà partir des milieux cellulaires, suivi par un marquage avec de petites molécules en utilisant la chimie amine ou thiol, et l'élution subséquente des anticorps marqués. Prendre des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous démontrons l'étiquetage sur cordon de trois anticorps de souris différents directement à partir de milieux cellulaires utilisant à la fois amine et de la chimie de marquage thiol. La forte affinité de liaison des anticorps à la protéine A et la protéine G assure des recouvrements élevés ainsi que de haute pureté des anticorps marqués. En outre, l'utilisation de billes magnétiques permet de multiples échantillons à traiter manuellement, ce qui améliore considérablement l'étiquetage débit.
Introduction
Des anticorps marqués avec de petites molécules sont peut - être les réactifs les plus couramment utilisés en biologie 1,2. Des anticorps marqués avec des colorants fluorescents et la biotine sont largement utilisés dans l' imagerie, les dosages immunologiques, cytométrie en flux, des transferts Western, immunoprécipitation et parmi d' autres applications 3-6. Anticorps radiomarqués 3,7- trouvent une utilisation extensive dans l' imagerie et la thérapie, des anticorps marqués avec des médicaments cytotoxiques (ADC) sont offrant de nouvelles options pour le traitement des cancers, et deux ADCs ont déjà été approuvés pour une utilisation thérapeutique 8. En dépit de leur large utilisation, les méthodes d'anticorps étiquetage sont restés étonnamment inchangé et généralement impliquer de multiples réactions et de dessalage étapes 9-12. Méthodes de résolution fonctionnent très bien dans les cas où seuls quelques anticorps doivent être étiquetés et sont disponibles sous une forme hautement purifiée à forte concentration et en quantité suffisante. Cependant, pour les applications plus récentes comme ADCs, il y a unbesoin d'étiqueter des anticorps au stade précoce d'hybridome de sorte qu'ils peuvent être criblés pour des propriétés biologiques pertinents, par exemple, médiée par un récepteur d' anticorps intériorisation 13-16. Au stade de l'hybridome, des volumes d'échantillons sont limités, les anticorps sont exprimés à de faibles concentrations et un certain nombre d'échantillons sont grandes, donc des méthodes d'étiquetage basées sur des solutions ne sont pas adaptés.
Pour simplifier et améliorer le débit des méthodes de marquage des anticorps traditionnels, quelques approches alternatives ont été proposées 17,18. Une approche consiste à utiliser la protéine amagnétique A billes d'affinité emballés dans de petites colonnes pour capturer des anticorps suivie par la réaction de marquage et l'élution de la protéine marquée et purifiée. Cette méthode peut être utilisée pour marquer les anticorps directement à partir de milieux cellulaires, cependant, l'utilisation de colonnes peut être laborieuse. Un procédé basé sur des billes magnétiques a été récemment rapporté 19 qui élimine l'utilisation de colonnes et de débit mais à cause amélioreà l'anticorps capacité limitée des billes de liaison, seulement nanogramme à des quantités faibles de microgramme des anticorps pourrait être étiqueté.
Nous avons récemment développé et utilisé une grande capacité magnétique protéine A et protéine G perles (> 20 mg d'IgG / ml de perles sédentaires humain) pour étiqueter des anticorps présents dans les milieux de cellules avec de petites molécules 20. La capacité élevée des bourrelets permet de dizaines à des centaines de microgrammes d'anticorps à marquer facilement et rapidement la réponse magnétique des billes simplifie la manipulation et le traitement d'un grand nombre d'échantillons en parallèle. En utilisant des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous montrons que la méthode est compatible avec amine et thiol étiquetage chimie et offre des recouvrements élevés d'anticorps marqués et très purs.
Ce protocole et la vidéo qui l'accompagne décrivent l'étiquetage sur cordon de anticorps de souris présents dans les médias de cellules en utilisant la protéine magnétique A et protéine G perles. Le protocole estdivisé en quatre sections: Section 1 décrit la capture d'anticorps sur le cordon à partir d'échantillons biologiques. Après la capture, le marquage des anticorps avec un colorant fluorescent à l'aide de la chimie amine ou en utilisant la chimie thiol est décrite dans les sections 2 et l'article 3, respectivement. Enfin, la section 4 décrit la méthode pour le calcul de la concentration d'anticorps et le colorant au rapport de l'anticorps.
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Protocol
1. Anticorps de capture sur High Capacity Protein magnétique A ou la protéine G Magnetic Beads
- Uniformément re-suspension des billes magnétiques par agitation douce. Gardez l'uniforme de suspension lorsque aliquotage perles.
- Ajouter 50 pi de perles suspension à un tube de 1,5 ml. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de stockage.
- Ajouter 250 pi de tampon de liaison d'anticorps.
- Mélanger et placer dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de liaison.
- Ajouter 1,0 ml de l'échantillon contenant 50 à 100 ug d'anticorps aux billes. Les échantillons peuvent être purifiés des anticorps ou des anticorps dans le milieu cellulaire.
- Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
- Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon de liaison / lavage. Répétez cette sTep pour un total de deux lavages.
- Passez à la section 2 pour les anticorps de l'étiquette en utilisant la chimie amine ou à l'article 3 aux anticorps de l'étiquette en utilisant la chimie de thiol.
2. Anticorps Étiquetage utilisant Amine Chemistry
- Anticorps conjugué
- Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison aminé aux billes.
- Dissoudre les colorants fluorescents réagissant avec les amines (AlexaFluor 532-SE) à 10 mg / ml par addition de 100 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l'utilisation.
- Ajouter 2,5 ul de colorant avec une amine pour 100 pg d'anticorps.
Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d'anticorps et d'anticorps propriétés intrinsèques. - Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
- Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer et jeter le tampon de liaison / lavage. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
- antibody Recovery
- Ajouter 50 pi de tampon d'élution aux billes.
- Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l'échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de tampon de neutralisation.
- Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues.
- Quantifier la concentration d'anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4.
3. Anticorps Étiquetage utilisant thiol Chemistry
- Réduction des anticorps
- Ajouter 250 pide tampon de conjugaison thiol et mix. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répéter deux fois cette étape.
- Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol.
- Ajouter du dithiothréitol (DTT) jusqu'à une concentration finale de 2,5 mM.
- Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon.
- Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
- Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol.
- Anticorps conjugué
- Dissoudre le colorant réactif thiol à 10 mg / ml par addition de 100 ul de DMSO à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l'utilisation.
- Ajouter 2,5 pi de colorant thiol réactif pour 100 ug d'anticorps.
Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d'anticorps et d'anticorps propriétés intrinsèques. - Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
- Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
- Eluer Anticorps
- Ajouter 50 pi de tampon d'élution aux billes.
- Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
- Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l'échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de neutun tampon de ralization.
- Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues.
- Quantifier la concentration d'anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4.
Ratio 4. Calculer Dye-to-Antibody
- Mesurer l'absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nm (A280) et à l'Xmax pour le colorant (Amax).
- Calculer la concentration d'anticorps:
Anticorps Concentration (mg / ml) = A280 - (A × max CF) / 1,4
où CF = facteur de correction du colorant (fourni par le fabricant). - Calculer le rapport colorant à l'anticorps:
Colorant à l' anticorps Ratio (DAR) = (A max × 150 000) / Ab concentration (mg / ml) x ε colorant
où ε colorant = coefficient d'extinction du colorant à son maximum d'absorption et le poids moléculaire de l' anticorps = 150 000 Da.
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Representative Results
Un schéma de marquage d' anticorps avec de petites molécules en utilisant une grande capacité magnétique de la protéine A et la protéine G billes est représenté sur la figure 1. Les anticorps capturés sur la protéine magnétique G billes peuvent être marquées avec de petites molécules, par exemple des colorants fluorescents, en utilisant la chimie des amines qui marque des amines primaires de la lysine, des acides aminés ou en utilisant la chimie thiol qui marque les thiols réduits dans la région charnière de l'anticorps. L' affinité entre les anticorps et la protéine G est solide 21 et se traduit par une perte minimale d'anticorps lors de la réaction de marquage. Ceci se reflète dans la récupération efficace (50-90%) des trois isotypes d'anticorps de souris différentes (tableau 1) , après marquage avec des colorants fluorescents, par rapport à une purification simple. Récupération efficace (similaire à celle rapportée avant le 19) est également évidente dans les gels Coomassie (Figure 2) où la bande intensides attaches des chaînes lourdes et légères des anticorps purifiés et des anticorps marqués refléter le résultat indiqué dans le tableau 1. protéinique magnétique G billes ont des propriétés de liaison non spécifiques faibles conduisant à des anticorps hautement purifiés comme on le voit dans le gel de Coomassie (figure 2) et à la fois les chaînes lourdes et légères sont marqués par fluorescence (figure 2). Étiquetage sur-talon peut également être effectuée sur les protéines magnétiques perles de A et est compatible avec plusieurs colorants fluorescents résultant en une récupération élevée et la bonne teinture à taux d' anticorps (tableau 2).
Figure 1. Schéma d'étiquetage sur perle d'anticorps avec des molécules fluorescentes. (A) l' étiquetage des anticorps en utilisant la chimie thiol. Les anticorps sont capturés sur une grande capacité Protein magnétique A ou protéine G magnétique bEADS suivie par une réduction des liaisons disulfure inter-chaînes en utilisant des agents réducteurs tels que le DTT ou le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP). maléimide réagissant avec un thiol contenant des colorants fluorescents sont ajoutées à des anticorps de l'étiquette. des anticorps marqués sont récupérés par une faible élution de pH et neutralisés immédiatement. (B) l' étiquetage des anticorps en utilisant la chimie amine. Les anticorps capturés sur une grande capacité magnétique protéine A et la protéine G Les perles sont mises à réagir avec des colorants fluorescents réagissant avec les amines pour marquer des anticorps aux amines primaires des lysines. des anticorps marqués sont élues par une faible élution de pH et neutralisés immédiatement. Adapté de Nath, N. et al. 20 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La dénaturation SDS-PAGE images de gel de trois isotypes d' IgG de souris purifié et marqué avec AlexaFluor 532, en utilisant la méthode en perle. (A) Amine réaction (B) réaction thiol. images de gel d'anticorps marqués avec un colorant réactif thiol. Lanes 1-6 correspondent aux échantillons présentés dans le tableau 1. Gels ont d' abord été imagée en utilisant le scanner fluorescent et montrent seulement AlexaFluor 532 anticorps a marqué des chaînes lourdes et légères. Les échantillons où les anticorps ont été purifiés ne sont pas visibles. Les gels ont ensuite été colorées avec Coomassie pour montrer les chaînes lourdes et légères de l'anticorps qui ont été purifiés ainsi que des anticorps qui ont été marqués. Adapté de Nath, N. et al. 20 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Amine réaction | réaction thiol | |||||
| bien | Isotype | Anticorps de récupération (pg) | Dye Ratio d'anticorps | Anticorps de récupération (pg) | Dye Ratio d'anticorps | |
| 1 | souris IgG1 | Purification | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Conjugaison | 27,4 ± 3,2 | 4,2 ± 0,2 | 46,2 ± 3,5 | 1,6 ± 0,2 | |
| 3 | IgG2a de souris | Purification | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | conjugation | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5,5 ± 0,4 | |
| 5 | IgG2b de souris | Purification | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Conjugaison | 66,7 ± 0,5 | 5,6 ± 0,1 | 55,7 ± 0,9 | 5,2 ± 0,5 | |
Tableau 1:. Étiquetage sur-perle de trois isotypes IgG de souris directement à partir de supports de cellules en utilisant amine et thiol chimies Pour chaque échantillon, une aliquote de 1,0 ml de milieu cellulaire a été utilisé seulement pour la purification d'anticorps en utilisant la protéine G magnétique perles (50 pi) et lisier seconde aliquote a été utilisée pour l'étiquetage en perles avec une amine réactive AlexaFluor 532 colorant. les recouvrements d'anticorps dans les deux cas ont été calculés (comme décrit dans le texte) unD par rapport à déterminer les pertes d'anticorps au cours de réaction de marquage. Dye ratio d'anticorps a également été calculé pour les trois anticorps. Toutes les réactions ont été réalisées en triple. Adapté de Nath, N. et al. 20
| Protein magnétique G Perles | Perles de protéines magnétique A | ||||
| Anticorps de récupération (pg) | Dye Ratio d'anticorps | Anticorps de récupération (pg) | Dye Ratio d'anticorps | ||
| 1 | Purification | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5,1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5.377; 0,04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2,9 | 3,3 ± 0,1 | 112,3 ± 11,4 | 3,6 ± 0,2 |
| 4 | fluorescéine | 179,5 ± 5,3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6,5 | 6,8 ± 0,1 |
Tableau 2:. Étiquetage Sur cordon d'IgG2a de souris avec trois colorants fluorescents réagissant avec un thiol différents échantillons de milieux cellulaires concentrées ont été utilisés dans cette expérience pour montrer que cette méthode peut également être adopté pour différentes quantités d'anticorps. En outre, les réactions de conjugaison ont été réalisées à l'aide de la protéine G magnétique, ainsi que la protéine magnétique A. Un aliquote de 1,0 ml concentré milieu cellulaire a été utilisée pour la purification des anticorps en utilisant des billes de protéine G magnétique (100 ul slurry). Trois autres portion de 1,0 mls ont été marqués et purifiés avec thiol réactif AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 et fluorescéine. les recouvrements d'anticorps ont été calculés (comme décrit dans le texte) et par rapport à diverses réactions de marquage. Dye ratio d'anticorps a également été calculé pour les trois colorants fluorescents. purification similaires et l'étiquetage ont été effectués à l'aide de protéines magnétique perles A. Toutes les réactions ont été réalisées en triple. Adapté de Nath, N. et al '20.
| Tampon | Commentaires / Description |
| un tampon de conjugaison amine (tampon de bicarbonate de sodium 10 mM, pH 8,5) | 1. 0,084 g de bicarbonate de sodium 2. Dissoudre dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le pH à 8,5. 3. Réglez le volume final à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. |
| un tampon de conjugaison thiols (mM de tampon 10 phosphate avec 1 mM d'EDTA, pH 7.0) | 1. phosphate de sodium 0,0378 g, monobasique, monohydraté phosphate de sodium 2. 0,195 g, dibasique, heptahydraté 3. Dissoudre dans de l'eau déminéralisée. 4. Ajouter l'EDTA à une concentration finale de 1,0 mM. 5. Ajuster le pH à 7. 6. Réglez le volume final à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. |
| tampon de liaison / lavage anticorps (tampon phosphate 10 mM, pH 7,0) | 1. phosphate de sodium 0,0378 g, monobasique, monohydraté phosphate de sodium 2. 0,195 g, dibasique, heptahydraté 3. Dissoudre dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le pH à 7. 4. Ajuster le volume final à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. |
| tampon d'élution (50 mM de tampon glycine, pH 2,7) | 1. 0,188 g glycine 2. Dissoudre dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le pH à 2,7 avec du HCl. 3. Réglez le volume final à 50 ml avec de l'eau déminéralisée. |
| un tampon de neutralisation (Tris 2 M, tampon, pH 7,5) | 1. 0,472 gbase de trizma 2. 2,54 g de chlorhydrate de trizma 3. Dissoudre dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le pH à 7,5. 4. Réglez le volume final à 10 ml avec de l'eau déminéralisée. |
Tableau 3: compositions tampons.
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Discussion
Le but de cette étude était de développer un procédé pour marquer des anticorps présents dans le milieu cellulaire à des concentrations faibles, avec une variété de petites molécules. Un tel procédé permettra à un grand nombre d'anticorps, au cours des premiers stades de la découverte d'anticorps, à marquer avec de petites molécules et tamisé en utilisant un essai biologique approprié. Un tel essai est l'anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur lorsque l'internalisation entre les anticorps peuvent varier, même avec des affinités de liaison similaires. Par conséquent, il est important pour cribler des anticorps spécifiquement pour leurs propriétés d'internalisation, en plus de l'enzyme traditionnelle Immunosorbent Assay (ELISA) de criblage à base lié. Les exigences clés pour la méthode pour étiqueter des anticorps au stade de développement d'anticorps précoce sont: a) la capacité d'étiqueter des anticorps directement à partir de supports de cellules; b) la capacité à étiqueter des anticorps présents à des concentrations faibles, par exemple lorsque la concentration d'anticorps dans le milieu cellulaire est de 50 pg / ml; c)la pureté de l'anticorps et l'anticorps marqué par la concentration doit être compatible avec les applications en aval; d) la méthode doit être compatible avec les amines et thiol chimie de conjugaison sur la base; e) la méthode doit être compatible avec le traitement de plusieurs échantillons simultanément.
Compte tenu de ces exigences, nous avons développé une méthode de marquage et de purification d'anticorps sur billes en utilisant haute capacité magnétique protéine A et protéine G perles. Ces billes sont à base de cellulose hydrophile ayant des propriétés de liaison non spécifique faible et donnent lieu à la préparation des anticorps de haute pureté , comme illustré sur la figure 2. La capacité élevée des billes signifie qu'une petite quantité de billes peut capturer efficacement des anticorps à partir du support et des anticorps peuvent être élue dans un volume réduit par conséquent la concentration des anticorps. Dans le tableau 1, seuls 10 ul réglés billes ont été utilisées pour capturer l' anticorps à partir de 1,0 ml d' échantillons (concentrations attendues de 50 à 100 pg / ml) d' und anticorps marqués ont été éluées dans un volume de 120 ul à des concentrations comprises entre 200 à 500 pg / ml. Ces concentrations sont compatibles avec les cellules sur la base des expériences d'internalisation d' anticorps où les concentrations sont généralement comprises entre 1,0 ug / ml à 10 ng / ml 15,16. Le procédé de marquage sur billes est compatible avec les amines et les chimies thiol et une large gamme de colorants à des rapports d'anticorps peuvent être obtenus avec une récupération efficace des anticorps marqués (tableau 1). Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire et jusqu'à 12 échantillons ont été traités en parallèle manuellement, ce qui réduit considérablement le temps de traitement. Le débit de l'étiquetage pourrait encore être augmentée en utilisant des plates - formes robotiques comme il a été démontré que dans d' autres applications utilisant des billes magnétiques 19,22.
Des échantillons avec une quantité plus élevée d'anticorps peuvent être facilement adaptées en augmentant la quantité de billes utilisées pour le captage, tout en maintenant la récupération de l'anticorps et de l'étiquetage véhicuncy (tableau 2). Le procédé est également compatible avec de multiples colorants afin que les divers conjugués d'anticorps de colorant peut être fait, cependant, un colorant à des rapports d'anticorps doivent être optimisés. Colorant ratio d'anticorps de 2-4 a été déterminée comme étant optimale 11,12 et dans le cas de VPA approuvés en moyenne 3,5 médicaments par anticorps a été rapportée 23. Avec la chimie de conjugaison sur bourrelet, il est relativement facile de régler un nombre optimal de la petite molécule par l'anticorps en fonction des besoins de l'application en aval. En outre, à la fois le thiol et d'une amine chimie pour le marquage peut être testé afin de déterminer la meilleure option de chimie qui est critique pour VPA comme il a été démontré que l' antigène et la liaison au récepteur, la stabilité in vivo et l' activité thérapeutique de l' anticorps dépend de la chimie de conjugaison 24 , 25.
Il y a quelques facteurs clés pour atteindre un bon étiquetage des anticorps et la récupération. Propriétés de la petite molécule unre le pilote critique tant pour la récupération des anticorps et colorant ratio d'anticorps. Pour une petite molécule hydrophobe, un colorant élevé au rapport de l'anticorps provoque l'adhérence non spécifique de l'anticorps marqué à la bille et la récupération d'anticorps significativement réduite. Parfois, en fonction du colorant et des caractéristiques d'anticorps, nous avons trouvé qu'un bourrelet peut fonctionner mieux que d'autres par conséquent, des tests à la fois des perles lors de l'optimisation peut être utile. Protéine A et protéine G ont des affinités différentes 21 pour les anticorps provenant d' espèces différentes et de différents sous - types, qui devraient être pris en considération lors de la sélection des perles appropriées. Par exemple, la protéine A a une faible affinité pour les IgG1 de souris donc protéines G perles sont fortement recommandées. Pour la chimie thiol, des agents réducteurs de la TNT et PTCE fonctionnent aussi bien. TNT sera toutefois interférer avec la réaction maléimide devrait donc être complètement éliminé par lavage. Faible pH de 2,7 est recommandé pour l'élution, mais le pH inférieur à 2,2 peut être nécessaire pour l'efficacité recovery dans certains cas. Pour les anticorps marqués qui peuvent subir une dénaturation à un pH faible à un équilibre entre une récupération efficace et la fonctionnalité de l'anticorps devra être déterminée de manière empirique. Il est bien connu que la chimie de l' étiquetage peut avoir un impact l'activité de liaison anticorps-antigène 11,23, par conséquent, il est absolument nécessaire pour tester la fonctionnalité d'anticorps après marquage utilisant l' application aval souhaitée.
En résumé, nous décrivons une méthode pour marquer des anticorps avec des colorants fluorescents directement à partir du milieu cellulaire sans aucune étape de purification préalable. Cette méthode tire parti de grande capacité magnétique protéine A et protéine G perles et représente une amélioration significative par rapport à une solution à base de méthode de marquage nécessitant des anticorps hautement purifiés à des concentrations élevées 10,11. L'utilisation de billes magnétiques permet d' emploi ainsi que la manipulation automatisée des échantillons, ce qui est un avantage par rapport à billes non magnétique sur la base des techniques de marquage 17,18. Enfin, l'utilisation de la haute bea des capacitésds permettent mise à l' échelle de la réaction de marquage de l' anticorps à partir des niveaux faibles de l'ordre du microgramme à des centaines de microgrammes en utilisant de petites quantités de perles et différencie cette méthode à partir d' autres procédés de marquage sur la base des billes magnétiques 19. Le protocole présenté ici décrit marquage des anticorps avec des colorants fluorescents, mais le procédé peut être étendu à d'autres marqueurs, y compris la biotine, les médicaments cytotoxiques et éventuellement des enzymes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
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