Summary
Den på-bead Fremgangsmåte for merking av antistoffer med små molekyler muliggjør merking av en liten mengde av antistoffer direkte fra celle media. Denne metoden er kompatibel med amin og tiol kjemi, og kan håndtere flere prøver i parallell, manuelt eller ved hjelp av automatiserte plattformer.
Abstract
Antistoffer merket med små molekyler som fluorescerende fargestoffer, cytostatika, og radioaktive sporstoffer er viktige verktøy i biomedisinsk forskning, immunodiagnostics og mer nylig som terapeutiske midler. Tradisjonelle metoder for merking av antistoffer med små molekyler krever rensede antistoffer ved forholdsvis høy konsentrasjon, innebære flere dialysetrinn, og har begrenset kapasitet. Men flere programmer, inkludert innen Antistoff Drug konjugater (ADC), vil dra nytte av nye metoder som vil tillate merking av antistoffer direkte fra celle media. Slike metoder kan tillate antistoffene som skal screenes i biologisk relevante analyser, for eksempel, den reseptor-formidlet internalise-antistoff-analyse i tilfellet av omvandlere. Her beskriver vi en fremgangsmåte (on-bead metode) som muliggjør merking av små mengder av antistoffer direkte fra celle media. Denne tilnærmingen benytter høykapasitets magnetisk Protein A og Protein G affinitet perler å fange antistofferfra cellemedier fulgt av merking med små molekyler ved hjelp av enten amin eller tiol kjemi og etterfølgende eluering av de merkede antistoffer. Tar fluorescerende fargestoffer som surrogater for små molekyler, demonstrerer vi på perle merking av tre forskjellige mus antistoffer direkte fra cellemedier ved hjelp av både amin og tiol merking kjemi. Den høye bindingsaffinitet av antistoff til protein A og protein G sikrer et høyt utbytte, så vel som høy renhet av de merkede antistoffer. I tillegg gjør bruk av magnetiske kuler flere prøver som skal håndteres manuelt, og derved betydelig bedre merking gjennomstrømming.
Introduction
Antistoffer merket med små molekyler er kanskje den mest brukte reagenser i biologi 1,2. Antistoffer merket med fluorescerende fargestoffer og biotin er i utstrakt bruk i bildebehandling, immunologiske analyser, flowcytometri, vestlige blotter, og immunoprecipitation blant andre applikasjoner 3-6. Radiomerkede antistoffer 3,7 finne utstrakt anvendelse i avbildning og terapi, antistoffer merket med cytotoksiske medikamenter (ADCs) tilbyr nye muligheter for behandling av kreft, og to ADC har allerede blitt godkjent for terapeutisk anvendelse 8. Til tross for sin omfattende bruk, har metoder for merking antistoffer forble overraskende uendret og vanligvis innebære flere reaksjoner og avsalting trinn 9-12. Løsningsmetoder fungerer veldig bra i tilfeller der bare noen få antistoffer må være merket og er tilgjengelig i svært renset form ved høy konsentrasjon og i tilstrekkelige volumer. Men for nyere applikasjoner som ADC, er det enbehov for å merke antistoffer ved hybridom tidlig stadium, slik at de kan bli undersøkt for biologisk relevante egenskaper, for eksempel, reseptor-antistoff-formidlet internalise 13-16. Ved hybridomet fasen, testvolumer er begrenset, antistoffer uttrykkes ved lave konsentrasjoner, og et antall prøver er store, derav løsningsbasert merkingsmetoder er ikke egnet.
For å forenkle og forbedre gjennomstrømningen av de tradisjonelle antistoff merking metoder, har noen alternative tilnærminger blitt foreslått 17,18. En tilnærming er å bruke ikke-magnetiske Protein A affinitet kuler pakket i små kolonner for å fange opp antistoff etterfulgt av merkingsreaksjonen og eluering av merket og renset protein. Denne fremgangsmåten kan brukes til å merke antistoffer direkte fra celle media har imidlertid bruken av kolonnene kan være arbeidskrevende. En basert på magnetiske kuler metode er nylig blitt rapportert 19 som eliminerer bruken av søyler og øker gjennomstrømningen, men på grunntil den begrensede antistoffbindingskapasiteten av kulene, kan bare nanogram til lave mikrogram mengder av antistoffene være merket.
Vi har nylig utviklet og brukt høy kapasitet magnetisk Protein A og protein G perler (> 20 mg of Human IgG / ml bosatte perler) til å merke antistoffene som finnes i celle media med små molekyler 20. Den høye kapasitet av kulene lar titalls til flere hundre mikrogram av antistoffet som skal merkes enkelt og hurtig magnetisk respons av kulene forenkler håndtering og behandling av et stort antall prøver parallelt. Ved hjelp av fluorescerende fargestoffer som surrogater for små molekyler, viser vi at metoden er kompatibel med amin og tiol merking kjemi og tilbyr høy inngang på merket og svært rene antistoffer.
Denne protokollen og den tilhørende video beskrive on-perle merking av muse-antistoffer til stede i cellemedier ved hjelp av magnetiske protein A og protein G-perler. Protokollen erdelt inn i fire seksjoner: Seksjon 1 beskriver fangst av antistoffer mot perle fra biologiske prøver. Etter fangst, er merking av antistoffer med fluorescerende fargestoff som bruker amin kjemi eller ved hjelp tiol kjemi beskrevet i del 2 og del 3, henholdsvis. Endelig seksjon 4 beskrives fremgangsmåten for beregning av antistoffkonsentrasjonen, og fargestoff til antistoff-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antistoff Capture på High Capacity Magnetic Protein A eller Magnetic Protein G Perler
- Jevnt re-suspendere magnetiske kuler ved forsiktig risting. Hold suspensjon uniform når alikvoteringsprosessen perler.
- Tilsett 50 ul perle slurry til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Plasser i den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern forsiktig lagringsbuffer.
- Tilsett 250 ul av antistoff-bindingsbuffer.
- Bland og legg i magnetstativet i 10 sek. Fjern forsiktig bindingsbuffer.
- Tilsett 1,0 ml av prøven som inneholder 50-100 ug av antistoffet til kulene. Prøver kan bli renset antistoffer eller antistoffer i celle media.
- Bland prøven i 60 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander.
- Plasser røret i den magnetiske stativet i 10 sek og fjern supernatanten.
- Tilsett 250 ul av antistoff binding / vaskebuffer og bland. Plasser i den magnetiske stativet i 10 sek og fjerne binding / vaskebuffer. Gjenta dette sTEP for en total av to vaskinger.
- Fortsett til § 2 å merke antistoffer ved hjelp av amin kjemi eller § 3 for å merke antistoffer ved hjelp tiol kjemi.
2. Antistoff Merking Bruke Amine kjemi
- konjugat antistoff
- Tilsett 100 ul av amin konjugering buffer til kulene.
- Oppløs amin-reaktivt fluorescerende fargestoffer (AlexaFluor 532-N) ved 10 mg / ml ved tilsetning av 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) til 1,0 mg fargestoff. Bland ved virvling. Gjør denne løsningen like før bruk.
- Legg 2,5 mL av amin-reaktivt farvestoff for 100 ug antistoff.
Merk: Typisk et 5-20 molart overskudd av reaktivt fargestoff anbefales. Men mengden av reaktivt fargestoff tilsatt til reaksjonsblandingen som må optimaliseres empirisk avhengig av ønsket fargestoff til antistoff-forhold og iboende egenskaper antistoff. - Bland prøven i 60 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander. Pass på at perlene forbli i suspension.
- Plasser røret i den magnetiske stativet i 10 sek og fjern supernatanten.
- Tilsett 250 ul av antistoff binding / vaskebuffer og bland. Plasser i den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern og kast binding / vaskebuffer. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker.
- antistoff Recovery
- Tilsett 50 ul elueringsbuffer til kulene.
- Bland i 5 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander. Pass på at perlene forbli i suspensjon.
- Plasser røret i den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern eluerte prøven og overføring til en ny mikro-sentrifugerør inneholdende 5 ul av nøytralisering buffer.
- Gjenta prosessen en gang til og basseng eluerte prøvene.
- Kvantifisere antistoffkonsentrasjon og fargestoff-til-antistoff-forhold som beskrevet i seksjon 4.
3. Antistoff Merking Bruke Tiol kjemi
- antistoff Reduksjon
- Tilsett 250 mLav tiol konjugering buffer og blanding. Plasser røret på den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern og kast buffer. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Tilsett 100 ul av tiol konjugering buffer.
- Legg Dithiothreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 2,5 mM.
- Bland prøven i 60 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander. Pass på at perlene forbli i suspensjon.
- Plasser røret i den magnetiske stå i 10 sek og kast buffer.
- Tilsett 250 ul av tiol konjugering buffer og bland. Plasser røret på den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern og kast buffer. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker.
- Tilsett 100 ul av tiol konjugering buffer.
- konjugat antistoff
- Oppløs det tiol-reaktive fargestoff ved 10 mg / ml ved tilsetning av 100 ul DMSO til 1,0 mg fargestoff. Bland ved virvling. Gjør denne løsningen like før bruk.
- Legg 2,5 mL av tiol-reaktivt farvestoff for 100 ug av antikropp.
Merk: Typisk et 5-20 molart overskudd av reaktivt fargestoff anbefales. Men mengden av reaktivt fargestoff tilsatt til reaksjonsblandingen som må optimaliseres empirisk avhengig av ønsket fargestoff til antistoff-forhold og iboende egenskaper antistoff. - Bland prøven i 60 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander. Pass på at perlene forbli i suspensjon.
- Plasser røret i den magnetiske stå i 10 sek og fjern supernatanten.
- Tilsett 250 ul av tiol konjugering buffer og bland. Sett i det magnetiske stativet i 10 sekunder og fjerne bufferen. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker.
- Eluer antistoff
- Tilsett 50 ul elueringsbuffer til kulene.
- Bland i 5 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en virvelblander eller ende-over-ende-blander. Pass på at perlene forbli i suspensjon.
- Plasser røret i den magnetiske stativet i 10 sek. Fjern elueres prøven og overføring til en ny mikro-sentrifugerør inneholder 5 ul neutralization buffer.
- Gjenta prosessen en gang til og basseng eluerte prøvene.
- Kvantifisere antistoffkonsentrasjon og fargestoff-til-antistoff-forhold som beskrevet i seksjon 4.
4. Beregn Dye-til-antistoff Ratio
- Mål absorbansen av antistoff-konjugat fargestoff ved 280 nm (A280) og ved Amaks-verdien for fargestoffet (Amax).
- Beregn antistoffkonsentrasjonen:
Antistoff-konsentrasjon (mg / ml) = A280 - (A maks x CF) / 1.4
hvor CF = korreksjonsfaktor av fargestoff (gitt av produsenten). - Beregn fargestoff-til-antistoff-forhold:
Dye-til-antistoff-forhold (DAR) = (A maks x 150 000) / Ab Konsentrasjon (mg / ml) x ε fargestoff
hvor, ε fargestoff = ekstinksjonskoeffisienten av fargestoffet ved dets absorbans maksimum og molekylvekten til antistoff = 150 000 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk for merking av antistoffer med små molekyler ved hjelp av høy kapasitet magnetisk protein A og protein G-perler er vist i figur 1. Antistoffer fanget på den magnetiske Protein G-perler kan merkes med små molekyler, for eksempel fluorescerende fargestoffer, enten ved hjelp av amin-kjemi hvilke etiketter primære aminer av lysin aminosyrer eller ved hjelp av tiol kjemi hvilke etiketter på de reduserte tioler i hengselregionen av antistoffene. Affinitet mellom antistoff og Protein G er sterk 21 og resulterer i minimalt tap av antistoff under merkingsreaksjonen. Dette gjenspeiles i den effektive utvinningen (50-90%) av tre forskjellige mus antistoff-isotyper (tabell 1) etter merking med de fluorescerende fargestoffer sammenlignet med enkel rensing. Effektiv utvinning (tilsvarende det som er rapportert før 19) er også tydelig i de Coomassie gels (figur 2) hvor bandet intensibånd av de tunge og lette kjeder fra de rensede antistoffene og merkede antistoffer reflekterer resultatet er rapportert i tabell 1. Magnetisk Protein G-perler har lave ikke-spesifikke bindingsegenskaper som resulterer i høyt rensede antistoffer som vist på Coomassie-gel (figur 2), og begge de tunge og lette kjeder er fluorescensmerket (figur 2). Merkingen på-perle kan også gjøres på Magnetiske protein A kuler og er kompatibel med flere fluorescerende fargestoffer som resulterer i høy utvinning og god fargestoff til antistoff-forhold (Tabell 2).
Figur 1. Skjematisk av on-perle merking av antistoffer med fluorescerende molekyler. (A) Antistoff merking ved hjelp av tiol kjemi. Antistoffer er fanget på høy kapasitet magnetisk Protein A eller magnetisk Protein G bEADS fulgt av reduksjon av inter-kjede-disulfidbindinger ved hjelp av reduksjonsmidler som DTT eller tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP). Tiol-reaktivt maleimid som inneholder fluorescerende fargestoffer tilsettes for å merke antistoffer. Merkede antistoffer utvinnes ved lav pH-eluering og nøytralisert umiddelbart. (B) Antistoff merking ved hjelp av amin kjemi. Antistoffer fanget på høy kapasitet magnetisk Protein A og protein G perler omsettes med amin-reaktivt fluorescerende fargestoffer for å merke antistoffer på primære aminer av lysin. Merkede antistoffer elueres ved lav pH-eluering og nøytralisert umiddelbart. Tilpasset fra Nath, N. et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. denaturering SDS-PAGE-gel bilder av tre mus IgG isotyper renset og merket med AlexaFluor 532, ved hjelp av on-kulemetoden. (A) amin reaksjon (B) Tiol reaksjon. Gel bilder av antistoffer merket med tiol-reaktive fargestoff. Baner 1-6 svarer til prøvene er vist i tabell 1. Gelene ble først avbildes med fluorescerende skanner og viser bare AlexaFluor 532 merket antistoff tunge og lette kjeder. Prøvene hvor antistoffer ble bare renset ikke er synlige. Gelene ble deretter farget med Coomassie-flekken for å vise tunge og lette kjeder fra antistoffer som ble renset, så vel som antistoffer som ble merket. Tilpasset fra Nath, N. et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Amine Reaction | tiol Reaction | |||||
| Godt | isotype | Antistoff Recovery (mikrogram) | Dye til Antistoff Ratio | Antistoff Recovery (mikrogram) | Dye til Antistoff Ratio | |
| 1 | mus IgG1 | rensing | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Bøyning | 27,4 ± 3,2 | 4,2 ± 0,2 | 46,2 ± 3,5 | 1,6 ± 0,2 | |
| 3 | mus IgG2a | rensing | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | Conjugasjon | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5.5 ± 0.4 | |
| 5 | mus IgG2b | rensing | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Bøyning | 66,7 ± 0,5 | 5,6 ± 0,1 | 55,7 ± 0,9 | 5.2 ± 0.5 | |
Tabell 1:. On-perle merking av tre mus IgG isotyper direkte fra cellemedier ved hjelp av amin- og tiol-kjemi For hver prøve en aliquot på 1,0 ml cellemateriale ble anvendt for rensing av antistoffer ved hjelp av magnetiske Protein G-perler (50 ul) og slam andre prøve ble brukt for on-perle merking med amin-reaktive AlexaFluor 532 fargestoff. Antistoff inngang i begge tilfeller ble beregnet (som beskrevet i teksten) end forhold til å bestemme antistoff tap i merking reaksjon. Fargestoff til antistoff-forholdet ble også beregnet for alle tre antistoffer. Alle reaksjonene ble utført i tre eksemplarer. Tilpasset fra Nath, N. et al. 20
| Magnetisk Protein G Perler | Magnetisk Protein A perler | ||||
| Antistoff Recovery (mikrogram) | Dye til antistoff Ratio | Antistoff Recovery (mikrogram) | Dye til antistoff Ratio | ||
| 1 | rensing | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5,1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5.377; 0,04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2,9 | 3,3 ± 0,1 | 112,3 ± 11,4 | 3,6 ± 0,2 |
| 4 | fluorescein | 179,5 ± 5,3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6,5 | 6,8 ± 0,1 |
Tabell 2:. On-perle merking av muse-lgG2a med tre forskjellige tiol-reaktivt fluorescerende fargestoffer Konsentrerte cellemediaprøver ble anvendt i dette eksperiment for å vise at fremgangsmåten kan også tas i bruk for forskjellig mengde antistoff. I tillegg ble konjugeringsreaksjoner utført ved hjelp av magnetisk Protein G, så vel som magnetisk protein A. En alikvot på 1,0 ml konsentrert cellemateriale ble anvendt for antistoffrensing ved hjelp av magnetiske Protein G-perler (100 ul suspensjon). Tre andre 1,0 ml prøves ble merket og renset med tiol-reaktive AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 og Fluorescein. Antistoff-inngang ble beregnet (som beskrevet i teksten) og sammenlignet for forskjellige merkingsreaksjoner. Fargestoff til antistoff-forholdet ble også beregnet for alle tre fluorescerende fargestoffer. Ligner rensing og merking ble gjort ved hjelp av magnetisk Protein A perler. Alle reaksjonene ble utført i tre eksemplarer. Tilpasset fra Nath, N. et al. »20
| Buffer | Kommentarer / beskrivelse |
| Amin konjugasjon-buffer (10 mM natriumbikarbonatbuffer, pH 8,5) | 1. 0,084 g natriumbikarbonat 2. Løs opp i avionisert vann. Juster til pH 8,5. 3. Juster sluttvolum til 100 ml med avionisert vann. |
| Tiol konjugasjon buffer (10 mM fosfatbuffer med 1 mM EDTA, pH 7.0) | 1. 0,0378 g natriumfosfat, monobasisk monohydrat 2. 0,195 g natriumfosfat, dibasisk, heptahydrat 3. Løs opp i avionisert vann. 4. Legg EDTA til en endelig konsentrasjon på 1,0 mM. 5. Juster til pH 7. 6. Juster sluttvolum til 100 ml med avionisert vann. |
| Antistoffbinding / vaskebuffer (10 mM fosfatbuffer, pH 7,0) | 1. 0,0378 g natriumfosfat, monobasisk monohydrat 2. 0,195 g natriumfosfat, dibasisk, heptahydrat 3. Løs opp i avionisert vann. Juster til pH 7. 4. Juster sluttvolum til 100 ml med avionisert vann. |
| Elueringsbuffer (50 mM glycinbuffer, pH 2,7) | 1. 0,188 g glysin 2. Løs opp i avionisert vann. Juster pH til 2,7 med HCl. 3. Juster det endelige volum til 50 ml med avionisert vann. |
| Nøytralisering buffer (2 M Tris buffer, pH 7,5) | 1. 0,472 gTrizma basen 2. 2,54 g Trizma hydroklorid 3. Løs opp i avionisert vann. Juster til pH 7,5. 4. Justere det endelige volum til 10 ml med avionisert vann. |
Tabell 3: bufferblandinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne studien var å utvikle en metode for å merke antistoffer, til stede i cellen media ved lave konsentrasjoner, med en rekke små molekyler. En slik fremgangsmåte vil gi et stort antall antistoffer, i løpet av den tidlige fasen av antistoff oppdagelse, til å bli merket med små molekyler og screenet ved anvendelse av en biologisk relevant assay. En slik analyse er den reseptor-formidlet internalisering antistoffanalyse hvor internalisering kan variere mellom antistoffer til og med med liknende bindingsaffiniteter. Derfor er det viktig å screene antistoffer som er spesifikt for deres internalise egenskaper i tillegg til tradisjonell Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) basert screening. De viktigste kravene for metoden til å merke antistoffer på et tidlig antistoffutvikling fasen er: a) evne til å merke antistoffer direkte fra celle media; b) evne til å merke antistoffene som er tilstede i lave konsentrasjoner, for eksempel ved antistoffkonsentrasjonen i cellematerialet er 50 ug / ml; c)renhet av det merkede antistoff og antistoff-konsentrasjon bør være kompatibel med nedstrømsapplikasjoner; d) av fremgangsmåten bør være kompatibel med både amin- og tiol basert konjugering kjemi; e) av fremgangsmåten bør være kompatibel med å behandle mange prøver samtidig.
Vurderer disse kravene, har vi utviklet en on-perle antistoff merking og rensing metode med høy kapasitet magnetisk Protein A og protein G perler. Disse perlene er basert på hydrofile cellulose med lave ikke-spesifikke bindingsegenskaper og resultere i meget ren antistoffpreparat som vist i figur 2. Den høye kapasitet av perlene betyr at en liten mengde av perlene kan effektivt fange antistoffer fra mediet og antistoffer kan elueres i et lite volum derav konsentrering av antistoffer. I tabell 1, bare 10 ul avgjort perler ble brukt til å fange antistoffer fra 1,0 ml prøver (forventede konsentrasjoner 50-100 ug / ml) etd merkede antistoffer ble eluert i et 120 ul volum ved konsentrasjoner mellom 200-500 mikrogram / ml. Disse konsentrasjonene er forenlige med cellebasert internalise forsøk hvor typiske antistoffkonsentrasjoner området fra 1,0 ug / ml til 10 ng / ml 15,16. Den på-perle merking metode er kompatibel med både amin- og tiol-kjemi og et bredt spekter av farvestoff-til-antistoff-forhold kan oppnås sammen med effektiv utvinning av de merkede antistoffer (tabell 1). Forsøk ble utført i triplikater og opp til 12 prøver ble håndtert i parallell manuelt, noe som reduserer behandlingstiden. Gjennomstrømningen av merkingen kan økes ytterligere ved hjelp av robot-plattformer som det har blitt vist i andre programmer ved å bruke magnetiske kuler 19,22.
Prøver med høyere antistoff-mengde kan enkelt innlemmes ved å øke mengden av perler som brukes for fangst under opprettholdelse av antistoffet utvinning og merking effektiv vNCY (tabell 2). Fremgangsmåten er også kompatibelt med flere fargestoffer, slik at ulike fargestoff antistoffkonjugater kan bli gjort, imidlertid, farvestoff-til-antistoff-forhold må optimaliseres. Fargestoff til antistoff-forhold på 2-4 har blitt bestemt til å være optimal 11,12, og i tilfelle av godkjente Adjutanter et gjennomsnitt på 3,5 stoffer pr antistoffet er blitt rapportert 23. Med on-perle konjugasjon kjemi, er det forholdsvis lett å stille inn et optimalt antall små molekyl per antistoff avhengig av kravene til den nedstrøms søknaden. Videre kan både den tiol- og aminkjemi for merking bli testet for å bestemme den beste kjemi alternativet som er kritisk for ADC som det er blitt vist at antigen og reseptorbinding in vivo stabilitet, og terapeutisk aktivitet av antistoff avhenger av konjugering kjemi 24 , 25.
Det er noen viktige faktorer for å oppnå god antistoff merking og utvinning. Egenskaper av det lille molekylet enre den kritiske driveren for både antistoffet utvinning og fargestoff til antistoff-forhold. For en hydrofob lite molekyl, vil høy fargestoff til antistoff-forhold forårsake ikke-spesifikk klebing av det merkede antistoff til vulsten og betydelig redusert antistoff utvinning. Noen ganger, avhengig av fargestoff og antistoff karakteristikk, har vi funnet at en vulst kan fungere bedre enn en annen derav, kan testing av begge kulene under optimaliseringen være nyttig. Protein A og Protein G har ulike slektskap 21 for antistoffer fra ulike arter og for ulike undergrupper, som bør vurderes når du velger de riktige perler. For eksempel har Protein En lav affinitet for mus IgG1 dermed Protein G perler på det sterkeste. For tiol kjemi, DTT og TCEP reduksjonsmidler fungerer like godt. DTT vil imidlertid interferere med maleimid reaksjonen derfor bør fjernes fullstendig ved vasking. Lav pH-verdi på 2,7 er anbefalt for eluering, men lavere pH-verdi på 2,2 kan være nødvendig for effektiv recovery i noen tilfeller. For merkede antistoffer som kan denaturere ved lav pH en balanse mellom effektiv gjenvinning og antistoff-funksjonalitet vil måtte bestemmes empirisk. Det er velkjent at merking kjemi kan påvirke antistoff-antigen bindingsaktivitet 11,23, derfor er det helt nødvendig å teste for antistoffer funksjonalitet etter merking ved hjelp ønsket nedstrøms søknaden.
Oppsummert beskriver vi en metode for å merke antistoffer med fluorescerende fargestoffer direkte fra cellen media uten forutgående rensetrinn. Denne fremgangsmåten utnytter høy kapasitet magnetisk protein A og protein G-perler, og er en betydelig forbedring i forhold løsning basert merking metode som krever høyt rensede antistoffer i høye konsentrasjoner 10,11. Bruken av magnetiske kuler muliggjør manuell og automatisert prøvehåndtering, noe som er en fordel i forhold til ikke-magnetisk kulebaserte merkingsteknikker 17,18. Endelig er bruken av høykapasitets beads tillate skala opp av antistoff merking reaksjon fra lave mikrogram nivåer til hundrevis av mikrogram bruke små mengder av perler og skiller denne metoden fra andre magnetiske kuler basert merkingsmetoder 19. Protokollen som presenteres her beskriver merking av antistoffer med fluorescerende fargestoffer, men fremgangsmåten kan utvides til andre merkelapper inkludert biotin, cytotoksiske medikamenter og muligens enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al.
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al.
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
