Summary
O método no grânulo para a marcação de anticorpos com pequenas moléculas permite a marcação de uma pequena quantidade de anticorpos directamente a partir de meio celular. Este método é compatível com a química de amina e tiol, e pode lidar com várias amostras em paralelo, manualmente ou por meio de plataformas automatizadas.
Abstract
Anticorpos marcados com pequenas moléculas como corantes fluorescentes, medicamentos citotóxicos e traçadores radioativos são ferramentas essenciais na investigação biomédica, imunodiagnóstico e, mais recentemente como agentes terapêuticos. Os métodos tradicionais de anticorpos de rotulagem com pequenas moléculas requerem anticorpos purificados na concentração relativamente elevada, envolvem múltiplos passos de diálise e tem produção limitada. No entanto, várias aplicações, incluindo o campo de Anticorpo drogas conjugados (ADCs), irão beneficiar de novos métodos que permitam a rotulagem de anticorpos diretamente da mídia de celulares. Tais métodos podem permitir que os anticorpos a serem rastreados em ensaios biologicamente relevantes, por exemplo, o ensaio de anticorpo de internalização mediada pelo receptor no caso de ADCs. Aqui, nós descrevemos um (método a-bead) método que permita a marcação de pequenas quantidades de anticorpos directamente a partir de meio celular. Esta abordagem utiliza alta capacidade G esferas de afinidade Protein magnética A e proteína para capturar anticorposa partir dos meios celulares, seguido de marcação com moléculas pequenas utilizando quer química de amina ou de tiol e a subsequente eluição dos anticorpos marcados. Tomando corantes fluorescentes como substitutos para moléculas pequenas, que demonstram a rotulagem sobre-cordão de três diferentes anticorpos de ratinho directamente a partir de meios celulares utilizando tanto amina e química rotulagem tiol. A elevada afinidade de ligação de anticorpos à proteína A e proteína G assegura recuperações elevadas, bem como elevada pureza dos anticorpos marcados. Além disso, a utilização de esferas magnéticas permite que amostras múltiplas para serem manuseados manualmente, melhorando desse modo significativamente a taxa de transferência de rotulagem.
Introduction
Os anticorpos marcados com moléculas pequenas são, talvez, os reagentes mais utilizados na biologia 1,2. Os anticorpos marcados com corantes fluorescentes e biotina são amplamente utilizados em imagiologia, imunoensaios, citometria de fluxo, Western blot, imunoprecipitação e entre outras aplicações 3-6. Anticorpos radiomarcados 3,7 encontrar o uso extensivo em imagiologia e terapia, anticorpos marcados com drogas citotóxicas (ADCs) estão oferecendo novas opções para o tratamento de cancros, e dois ADCs já foram aprovados para uso terapêutico 8. Apesar de sua ampla utilização, os métodos para detecção de anticorpos rotulagem continuam surpreendentemente inalterado e normalmente envolvem múltiplas reações e dessalinização os passos 9-12. métodos de solução funciona muito bem nos casos em que apenas alguns anticorpos necessita ser etiquetado e estão disponíveis em forma altamente purificada em concentração elevada e em volumes suficientes. No entanto, para aplicações mais recentes, como os ADCs, existe umprecisa para marcar anticorpos de hibridoma na fase precoce de modo que eles podem ser rastreados para propriedades biologicamente relevantes, por exemplo, mediada por receptor de anticorpos de internalização 13-16. Na fase de hibridoma, os volumes de amostra são limitados, os anticorpos são expressas em baixas concentrações e uma série de amostras são grandes, portanto, solução baseada em métodos de marcação não são adequados.
Para simplificar e melhorar o rendimento dos métodos de rotulagem de anticorpos tradicionais, algumas abordagens alternativas têm sido propostas 17,18. Uma abordagem é a utilização de proteínas de não-magnético grânulos de afinidade embalados em pequenas colunas para capturar anticorpos, seguido pela reacção de marcação e a eluição da proteína marcada e purificada. Este método pode ser utilizado para rotular os anticorpos directamente a partir de meios de células, no entanto, o uso de colunas pode ser trabalhoso. Processo baseado em esférulas magnéticas tem sido relatado recentemente que 19 elimina o uso de colunas e melhora o rendimento mas devidopara o anticorpo limitada capacidade dos grânulos de ligação, apenas a nanograma a baixas quantidades de micrograma de os anticorpos podem ser marcados.
Nós recentemente desenvolvido e utilizado alta capacidade magnética Proteína A e Proteína G grânulos (> 20 mg de IgG humana / mL de esferas de liquidados) para rotular anticorpos presentes nos meios de células com moléculas pequenas 20. A elevada capacidade dos grânulos permite dezenas a centenas de microgramas de anticorpo a ser marcado convenientemente e a resposta magnética rápida dos grânulos simplifica o manuseamento e processamento de um grande número de amostras em paralelo. Utilizando corantes fluorescentes como substitutos para moléculas pequenas, que mostram que o método é compatível com a amina e tiol rotulagem química e oferece recuperações elevadas de anticorpos marcados e muito puras.
Este protocolo eo vídeo que a acompanha descrevem rotulagem on-gota de anticorpos de ratinho presentes nos meios de células usando G esferas de Proteína Magnetic A e proteína. O protocolo édividida em quatro secções: uma secção descreve a captura de anticorpos para o grânulo a partir de amostras biológicas. Após a captura, a rotulagem de anticorpos com corante fluorescente usando química amina ou utilizando a química do tiol é descrito nas Secções 2 e seção 3, respectivamente. Finalmente, a seção 4 descreve o método para o cálculo da concentração de anticorpos e o corante à relação de anticorpos.
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Protocol
1. Captura de Anticorpos em G Beads Alta Capacidade Protein Magnetic A ou a proteína Magnetic
- Uniformemente re-suspender as esferas magnéticas por agitação suave. Mantenha o uniforme de suspensão quando alíquotas esferas.
- Adicionar 50 ul de suspensão de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque no suporte magnético por 10 s. Retire cuidadosamente o tampão de armazenamento.
- Adicionar 250 ul de tampão de ligação do anticorpo.
- Misture e coloque no suporte magnético por 10 s. Retire cuidadosamente o tampão de ligação.
- Adicionar 1,0 ml de amostra contendo 50-100 ng de anticorpo com as esferas. As amostras podem ser purificados anticorpos ou anticorpos no meio celular.
- Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final.
- Coloque tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
- Adicionar 250 ul de anticorpo tampão de ligação / lavagem e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 seg e remover o tampão de ligação / lavagem. Repita este step para um total de duas lavagens.
- Vá para a Seção 2 a anticorpos etiqueta utilizando química amina ou a Seção 3 para anticorpos etiqueta utilizando química tiol.
2. Rotulagem de anticorpos utilizando a amina Química
- conjugado anticorpo
- Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de amina para os grânulos.
- Dissolver os corantes fluorescentes reactivos com aminas (AlexaFluor 532-SE) a 10 mg / ml por adição de 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1,0 mg de corante. Misture em vortex. Faça esta solução imediatamente antes da utilização.
- Adicionar 2,5 mL de corante reactivo a amina de 100 ug de anticorpo.
Nota: normalmente um excesso molar de 5-20 de corante reactivo é recomendado. No entanto, a quantidade de corante reactivo adicionado à reacção tem de ser empiricamente optimizadas dependendo do corante desejado rácio de anticorpos e propriedades intrínsecas de anticorpos. - Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspension.
- Coloque tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
- Adicionar 250 ul de anticorpo tampão de ligação / lavagem e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 s. Remova e descarte tampão de ligação / lavagem. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
- Recuperação de anticorpo
- Adicionar 50 ul de tampão de eluição para os grânulos.
- Mistura-se durante 5 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
- Coloque tubo no suporte magnético por 10 s. Remover a amostra e eluiu-se a transferência para um tubo de micro-centrifugação novo contendo 5 ul de tampão de neutralização.
- Repetir o processo mais uma vez e reunir as amostras eluídas.
- Quantificar a concentração de anticorpos e tingir-se anticorpo rácio conforme descrito na Seção 4.
3. Anticorpo de marcação utilizando química Tiol
- Redução de anticorpo
- Adicionar 250 ulde tampão de conjugação de tiol e mistura. Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg. Retirar e descartar o buffer. Repita esta etapa duas vezes.
- Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de tiol.
- Adicionar ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 2,5 mM.
- Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
- Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg e descartar o tampão.
- Adicionar 250 ul de tampão de conjugação de tiol e misturar. Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg. Retirar e descartar o buffer. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
- Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de tiol.
- conjugado anticorpo
- Dissolve-se o corante reactivo com tiol a 10 mg / ml por adição de 100 ul de DMSO a 1,0 mg de corante. Misture em vortex. Faça esta solução imediatamente antes da utilização.
- Adicionar 2,5 mL de corante reactivo com tiol de 100 ug de anticorpo.
Nota: normalmente um excesso molar de 5-20 de corante reactivo é recomendado. No entanto, a quantidade de corante reactivo adicionado à reacção tem de ser empiricamente optimizadas dependendo do corante desejado rácio de anticorpos e propriedades intrínsecas de anticorpos. - Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
- Coloque o tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
- Adicionar 250 ul de tampão de conjugação de tiol e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 segundos e retire o tampão. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
- eluto Antibody
- Adicionar 50 ul de tampão de eluição para os grânulos.
- Mistura-se durante 5 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
- Coloque tubo no suporte magnético por 10 s. Remover amostra eluída e transferir para um tubo de micro-centrífuga nova contendo 5 ul de neuttampão ralization.
- Repetir o processo mais uma vez e reunir as amostras eluídas.
- Quantificar a concentração de anticorpos e tingir-se anticorpo rácio conforme descrito na Seção 4.
Rácio 4. Calcule Dye-to-Antibody
- Medir a absorvância do conjugado anticorpo-corante a 280 nm (A280) e a ^ max para o corante (Amax).
- Calcula-se a concentração de anticorpo:
Concentração de anticorpo (mg / ml) = A 280 - (A máx × CF) / 1.4
em que CF = factor de correcção do corante (fornecido pelo fabricante). - Calcular a proporção de corante-de-anticorpo:
Tintura-se Anticorpo Ratio (DAR) = (A máx 150000 ×) / Ab Concentração (mg / ml) × ε corante
onde, corante ε = o coeficiente de extinção do corante no seu máximo de absorvância e o peso molecular do anticorpo = 150000 Da.
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Representative Results
Um esquema para a marcação de anticorpos com moléculas pequenas utilizando G grânulos alta capacidade Proteína magnética A e proteína é mostrada na Figura 1. Os anticorpos capturados sobre a proteína magnética grânulos G podem ser marcados com moléculas pequenas, por exemplo, corantes fluorescentes, utilizando quer química de amina que rotula aminas primárias de ácidos aminados ou da lisina utilizando química de tiol, o qual etiquetas nos tióis reduzidos na região de charneira dos anticorpos. A afinidade entre os anticorpos e a proteína G é forte 21 e resulta em uma perda mínima de anticorpo durante a reacção de marcação. Isto reflecte-se na recuperação eficaz (50-90%) de três isotipos de anticorpo de ratinho diferentes (Tabela 1) após marcação com os corantes fluorescentes quando em comparação com a purificação simples. A recuperação eficiente (semelhante ao descrito antes 19) é também evidente nos géis de Coomassie (Figura 2) onde banda intensilaços das cadeias pesadas e leves dos anticorpos purificados e anticorpos marcados reflectem os resultados apresentados na Tabela 1. Proteína Magnética G grânulos têm propriedades de ligação não específica baixos, resultando em anticorpos altamente purificados como visto no gel Coomassie (Figura 2) e ambos as cadeias pesadas e leves são marcado de forma fluorescente (Figura 2). Rotulagem no talão também pode ser feito em esferas de uma proteína magnéticos e é compatível com vários corantes fluorescentes, resultando em alta recuperação e bom corante para rácios de anticorpos (Tabela 2).
Figura 1. Esquema de rotulagem sobre-cordão de anticorpos com moléculas fluorescentes. (A) rotulagem de anticorpos usando química tiol. Os anticorpos são capturados na alta capacidade magnética Proteína A ou Proteína G b magnéticaEADS seguido por redução da ligações dissulfureto inter-cadeias, utilizando agentes redutores como o DTT ou tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). maleimida tiol-reactiva contendo corantes fluorescentes são adicionados anticorpos de etiquetas. anticorpos marcados são recuperados por baixo eluição pH e neutralizado imediatamente. (B) rotulagem de anticorpos usando química de amina. Os anticorpos capturados em alta capacidade magnética Proteína A e Proteína G Grânulos são feitos reagir com corantes fluorescentes reactivos com aminas para marcar anticorpos para as aminas primárias das lisinas. anticorpos marcados são eluídos por baixo pH eluição e neutralizado imediatamente. Adaptado de Nath, N. et al. 20 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Desnaturação SImagens de gel DS-PAGE de três isotipos de IgG de rato purificada e marcada com AlexaFluor 532, utilizando o método no grânulo. Reacção tiol (A) Amina de reacção (B). Imagens de gel de anticorpos marcados com corante reactivo com tiol. As pistas 1-6 correspondem às amostras mostrados na Tabela 1. Os géis foram primeiro fotografada usando fluorescente do scanner e mostram apenas AlexaFluor 532 anticorpo marcado cadeias pesadas e leves. Amostras onde os anticorpos só foram purificados não são visíveis. Os géis foram subsequentemente coradas com corante de Coomassie para mostrar as cadeias pesada e leve a partir de anticorpos que foram purificados, bem como os anticorpos que foram marcados. Adaptado de Nath, N. et al. 20 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amine Reaction | Reação tiol | |||||
| Bem | Isotype | Recuperação de Anticorpo (ug) | Dye à relação Antibody | Recuperação de Anticorpo (ug) | Dye à relação Antibody | |
| 1 | IgG1 | Purificação | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Conjugação | 27,4 ± 3,2 | 4,2 ± 0,2 | 46,2 ± 3,5 | 1,6 ± 0,2 | |
| 3 | IgG2a | Purificação | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | Conjugção | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5,5 ± 0,4 | |
| 5 | IgG2b | Purificação | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Conjugação | 66,7 ± 0,5 | 5,6 ± 0,1 | 55,7 ± 0,9 | 5,2 ± 0,5 | |
Tabela 1:. Rotulagem On-gota de três isotipos de IgG mouse diretamente de mídia celular utilizando amina e tiol químicas Para cada amostra, uma alíquota de 1,0 ml de meio de células foi usado apenas para a purificação de anticorpos utilizando proteína G Magnética esferas (50 ul de polpa) e uma segunda aliquota foi usada para rotulagem sobre-cordão com amina reactiva AlexaFluor 532 corante. recuperações de anticorpos em ambos os casos, foram calculadas (tal como descrito no texto) umd em comparação para determinar as perdas de anticorpos durante a reacção de marcação. Tintura à relação de anticorpo também foi calculado para todos os três anticorpos. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Adaptado de Nath, N. et al. 20
| Proteína Magnetic Beads G | Grânulos uma proteína Magnética | ||||
| Recuperação de Anticorpo (ug) | Dye à relação de anticorpo | Recuperação de Anticorpo (ug) | Dye à relação de anticorpo | ||
| 1 | Purificação | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5,1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5.377; 0,04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2,9 | 3,3 ± 0,1 | 112,3 ± 11,4 | 3,6 ± 0,2 |
| 4 | Fluoresceína | 179,5 ± 5,3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6,5 | 6,8 ± 0,1 |
Tabela 2:. Rotulagem on-gota de IgG2A rato com três diferentes corantes fluorescentes tiol-reactivos amostras de meio de células concentradas foram usados nesta experiência para mostrar que o método pode também ser adoptado para diferentes quantidades de anticorpo. Além disso, reacções de conjugação foram realizadas utilizando a proteína G magnético assim como a proteína magnética A. Uma alíquota de 1,0 ml da solução concentrada meio das células foi utilizada para purificação de anticorpos utilizando proteína G Magnética esferas (100 ul) de lamas. Três outra aliquota de 1,0 mls foram marcadas e purificadas com AlexaFluor tiol-reactivo 532, 647 e AlexaFluor fluoresceína. recuperações de anticorpos foram calculados (como descrito no texto) e comparada para várias reacções de etiquetagem. Tintura à relação de anticorpo também foi calculado para todos os três corantes fluorescentes. purificação semelhante e rotulagem foi feito usando contas de uma proteína Magnetic. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Adaptado de Nath, N. et al. "20
| Amortecedor | Comentários / Descrição |
| tampão de conjugação amina (tampão bicarbonato de sódio 10 mM, pH 8,5) | 1. 0,084 g de bicarbonato de sódio 2. Dissolve-se em água desionizada. Ajustar a pH 8,5. 3. Ajustar o volume final para 100 ml com água desionizada. |
| tampão de conjugação tiol (tampão fosfato 10 mM com EDTA 1 mM, pH 7.0) | 1. 0,0378 g de fosfato de sódio monobásico, mono-hidrato de 2. 0,195 g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado 3. Dissolver em água deionizada. 4. Adicionar EDTA para uma concentração final de 1,0 mM. 5. Ajustar para pH 7. 6. Ajustar o volume final para 100 ml com água desionizada. |
| A ligação do anticorpo / tamp de lavagem (tampão fosfato 10 mM, pH 7,0) | 1. 0,0378 g de fosfato de sódio monobásico, mono-hidrato de 2. 0,195 g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado 3. Dissolver em água deionizada. Ajustar a pH 7. 4. Ajustar o volume final para 100 ml com água desionizada. |
| Tampão de eluição (tampão de glicina 50 mM, pH 2,7) | 1. 0,188 g de glicina 2. Dissolve-se em água desionizada. Ajustar o pH para 2,7 com HCl. 3. Ajustar o volume final para 50 ml com água desionizada. |
| tampão de neutralização (Tris Buffer de 2, pH 7,5) | 1. 0,472 gbase de Trizma 2. 2,54 g de cloridrato de Trizma 3. Dissolver em água deionizada. Ajustar a pH 7,5. 4. Ajustar o volume final para 10 ml com água desionizada. |
Tabela 3: Composições de memória intermédia.
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Discussion
O objectivo deste estudo foi o de desenvolver um método para marcar anticorpos, presentes no meio celular em baixas concentrações, com uma variedade de moléculas pequenas. Um tal processo permitirá que um grande número de anticorpos, durante as fases iniciais da descoberta de anticorpos, para ser marcado com moléculas pequenas e rastreados utilizando um ensaio de biologicamente relevante. Um desses ensaios é o ensaio de anticorpo de internalização mediada pelo receptor onde internalização pode variar entre os anticorpos, mesmo com afinidades de ligação semelhantes. Por isso, é importante para rastrear anticorpos especificamente para as suas propriedades de internalização, para além da enzima tradicional Linked Immunosorbent Assay (ELISA) baseado rastreio. Os principais requisitos para o método para identificar anticorpos na fase de desenvolvimento de anticorpos precoce são: a) capacidade de marcar anticorpos diretamente da mídia de célula; b) a capacidade de marcar anticorpos presentes em concentrações baixas, por exemplo quando a concentração de anticorpo no meio das células é de 50 ug / ml; c)pureza da concentração de anticorpo e anticorpo marcado deve ser compatível com aplicações a jusante; d) o método deve ser compatível tanto com amina e tiol com base química de conjugação; e) o método deve ser compatível com o processamento de múltiplas amostras em simultâneo.
Tendo em conta estes requisitos, desenvolvemos um anticorpo rotulagem e purificação método on-talão com alta capacidade Protein magnética A e proteína G esferas. Estes grânulos são à base de celulose hidrófila com propriedades de ligação não específica baixos e resultar na preparação de anticorpo de elevada pureza, como mostrado na Figura 2. A elevada capacidade dos grânulos significa que uma pequena quantidade de grânulos pode eficientemente capturar os anticorpos a partir dos meios de comunicação e os anticorpos podem ser eluído em um pequeno volume, consequentemente, a concentração dos anticorpos. Na Tabela 1, apenas 10 ul assente esferas foram utilizadas para capturar os anticorpos a partir de 1,0 ml (amostras de concentrações esperadas de 50-100 ug / ml) aanticorpos marcados D foram eluídas num volume de 120 uL com concentrações entre 200-500 ng / ml. Estas concentrações são compatíveis com base em células de internalização experiências em que as concentrações de anticorpos típicos variam de 1,0 ug / ml a 10 ng / mL 15,16. O método de marcação no talão é compatível tanto com amina e químicas tiol e uma vasta gama de rácios de corante-a-anticorpo pode ser conseguido com recuperação eficiente ao longo dos anticorpos marcados (Tabela 1). As experiências foram efectuadas em triplicado e até 12 amostras foram tratadas em paralelo manualmente, reduzindo significativamente o tempo de processamento. O rendimento da marcação poderia ser ainda mais aumentado usando plataformas robóticas como tem sido mostrado em outras aplicações que utilizam esferas magnéticas 19,22.
As amostras com maior quantidade de anticorpos pode ser facilmente acomodado por aumento da quantidade de pérolas de captura utilizado para a recuperação, mantendo o anticorpo e efficie rotulagemNCY (Tabela 2). O método também é compatível com vários corantes de modo a que vários conjugados de anticorpos corante pode ser feito, no entanto, as proporções de corante-a-anticorpo terá de ser optimizada. Tintura à relação de anticorpo de 2-4 foi determinada como sendo óptima e 11,12 no caso de ADCs aprovados uma média de 3,5 medicamentos por anticorpo foi avaliado 23. Com conjugação química no talão, que é relativamente fácil de sintonizar um número óptimo de pequena molécula por anticorpo, dependendo dos requisitos da aplicação a jusante. Além disso, tanto o tiol e amina química para rotulagem pode ser testado para determinar a melhor opção química que é crítico para ADCs, como tem sido mostrado que o antigénio e ligação aos receptores, a estabilidade in vivo, e a actividade terapêutica de anticorpo depende da química de conjugação 24 , 25.
Existem alguns factores essenciais para alcançar uma boa rotulagem e recuperação de anticorpos. Propriedades da pequena molécula de umre o controlador crítica, tanto para a recuperação do anticorpo e corante a proporção anticorpo. Para uma molécula pequena hidrofóbico, elevada de corante a proporção anticorpo irá provocar a aderência não específica do anticorpo marcado ao cordão e recuperação de anticorpo significativamente reduzida. Algumas vezes, dependendo do corante e características de anticorpos, verificou-se que um grânulo podem funcionar melhor do que o outro, portanto, ambos os testes de os grânulos durante a optimização pode ser útil. Proteína A e Proteína G têm diferentes afinidades 21 para anticorpos de espécies diferentes e de diferentes subtipos, que devem ser considerados ao selecionar as contas apropriadas. Por exemplo, Proteína A tem baixa afinidade para IgG1 de ratinho, por conseguinte, a proteína G grânulos são fortemente recomendados. Para a química tiol, TDT e TCEP agentes redutores funcionam igualmente bem. DTT no entanto interferir com a reacção de maleimida, portanto, deve ser completamente removido por lavagem. baixo pH de 2,7 é recomendada para a eluição, mas pode não ser necessária a diminuição do pH de 2,2 para rec eficienteovery em alguns casos. Para os anticorpos marcados que podem desnaturar-se a pH baixo de um equilíbrio entre a recuperação eficiente e funcionalidade anticorpo terá de ser determinada empiricamente. É bem sabido que a química rotulagem pode ter impacto na actividade de ligação de anticorpo-antigénio 11,23, portanto, é absolutamente necessário para testar a funcionalidade do anticorpo após a marcação usando a jusante aplicação desejada.
Em resumo, nós descrevemos um método para identificar anticorpos com corantes fluorescentes diretamente da mídia celular sem quaisquer passos de purificação anteriores. Este método aproveita a alta capacidade magnética Proteína A e Proteína G grânulos e é uma melhoria significativa sobre método de marcação solução baseada exigindo anticorpos altamente purificados em concentrações elevadas 10,11. A utilização de esferas magnéticas permite manual, bem como o tratamento de amostras automatizado, o que é uma vantagem sobre os grânulos não-magnético com base técnicas de marcação 17,18. Finalmente, o uso de alta capacidade BEAds permitir exclusiva da reacção de marcação de anticorpos de baixos níveis de microgramas a centenas de microgramas usando pequenas quantidades de grânulos e diferencia este método de outros métodos de rotulagem baseado grânulo magnético 19. O protocolo aqui apresentado descreve rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes, mas o método pode ser alargado a outras etiquetas incluindo biotina, fármacos citotóxicos e, possivelmente, enzimas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al.
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al.
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
