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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Published: October 6, 2016 doi: 10.3791/54585
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

Summary

इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे ड्रोसोफिला आंख / antennal imaginal डिस्क (EAD) में fluorescently चिह्नित, आनुवंशिक रूप से परिभाषित प्रतिरूप ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए। यह बताता है कि तीसरे instar लार्वा और कैसे कल्पना और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और ट्यूमर invasiveness यों तो उन्हें प्रक्रिया से EAD और मस्तिष्क काटना करने के लिए कैसे।

Introduction

कैंसर रोग का सबसे आनुवंशिक रूप से विषम समूह, जिसका घटनाओं और मृत्यु दर नाटकीय रूप से बढ़ रही है, विशेष रूप से बुजुर्गों के बीच दुनिया भर में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। कैंसर एक ट्यूमर की शुरुआत सेल कि निहित ट्यूमर शमन तंत्र पलायन और नियंत्रण से बाहर बिताते से clonally निकलती है। आनुवंशिक घावों कि सहयोगात्मक विकास, प्रसार और गतिशीलता को बढ़ावा देने मौत और भेदभाव बाधा जबकि क्रमिक संचय एक अत्यंत घातक मेटास्टेटिक और घातक ट्यूमर में प्रारंभिक सौम्य अतिवृद्धि बदल देती है। यह स्पष्ट हो गया है कि आनुवंशिक परिवर्तन के अलावा, ट्यूमर प्रगति आसपास के स्ट्रोमा और इसके microenvironment में ट्यूमर और अनेक प्रकार की कोशिकाओं (जैसे, fibroblasts, प्रतिरक्षा और endothelial कोशिकाओं) के बीच crosstalk में परिवर्तन की आवश्यकता है। ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत सहित घातक परिवर्तन अंतर्निहित आणविक सिद्धांतों को समझने preven के विकास के लिए बहुत महत्व का हैtion और जल्दी स्क्रीनिंग रणनीतियों, साथ ही नए और प्रभावी उपचार कैंसर मेटास्टेसिस और दवा प्रतिरोध का मुकाबला करने के लिए।

फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर कैंसर रिसर्च 1-4 के लिए एक आकर्षक प्रणाली अपनी तेजी पीढ़ी समय के कारण बन गया है, मक्खियों और मनुष्य, सीमित आनुवंशिक अतिरेक और उन्नत आनुवंशिक उपकरण है कि लगभग किसी भी जीन की हेरफेर की सुविधा के धन के बीच नोड्स संकेत की उल्लेखनीय संरक्षण एक अस्थायी रूप से और स्थानिक प्रतिबंधित तरीके से। बदलती द्रोह की आनुवंशिक रूप से परिभाषित ट्यूमर reproducibly MARCM तकनीक 5 का उपयोग कर एक अन्यथा जंगली प्रकार के ऊतकों में progenitors के एक सबसेट में gain- और नुकसान के समारोह के म्यूटेशन को शुरू करने से ड्रोसोफिला में इंजीनियर जा सकता है। MARCM उपकरण को जोड़ती है FLP / FRT (FLP recombinase / FLP मान्यता लक्ष्य) FLP-बाहर 7 और Gal4 / यूएएस (अपस्ट्रीम एक्टिवेशन अनुक्रम) 8 लक्ष्य जीन के साथ mitotic पुनर्संयोजन 6 मध्यस्थताअभिव्यक्ति सिस्टम 9। किसी भी यूएएस आधारित transgene की इस विधि अभिव्यक्ति, ओंकोजीन या फ्लोरोसेंट प्रोटीन cDNAs या dsRNA प्रेरित जीन मुंह बंद करने के लिए उलटा डीएनए दोहराता सहित साथ कोशिकाओं के एक क्लोन है कि एक विशिष्ट आनुवंशिक ठिकाना और पुनर्संयोजन के कारण एक Gal4 repressor खो दिया है करने के लिए प्रतिबंधित कर दिया जाएगा (चित्रा 1 ए)। क्लोनल पैच हरी फ्लोरोसेंट (GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चिह्नित (जैसे, आरएफपी, DsRed, mCherry) आसानी से विकास, पृथक और विश्लेषण के दौरान पता लगाया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, उनके व्यवहार सीधे सटे जंगली प्रकार के ऊतकों की तुलना में हो सकता है। इस प्रकार, सवाल सेल आनुवंशिक घावों की स्वायत्त और गैर-स्वायत्त प्रभाव आसानी से अध्ययन किया जा सकता करने के लिए प्रासंगिक। स्तनधारियों के लिए भी इसी तरह, केवल क्लोन जिसमें कई ऑन्कोजेनिक घावों संयुक्त ड्रोसोफिला में घातक हो जाते हैं और स्तनधारी कैंसर के प्रमुख पहचान पुनरावृत्ति कर रहे हैं। वे overproliferate, apoptosis से बचने, सूजन पैदा, अमर और Inva हो जाते हैंनिर्णायक, अंततः मेजबान 10-17 मौत हो गई।

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल MARCM तकनीक का उपयोग ड्रोसोफिला लार्वा की आंख / antennal और मस्तिष्क के ऊतकों में आनुवंशिक रूप से परिभाषित प्रतिरूप ट्यूमर उत्पन्न करने का वर्णन है। विधि एक MARCM परीक्षक शेयर जो अंधा बढ़ाने (eyFLP) 18,19 के नियंत्रण में खमीर FLP recombinase व्यक्त करता है पर निर्भर करता है। इस तरह, GFP लेबल क्लोन EAD की peripodial और स्तंभ उपकला और भ्रूण और लार्वा चरणों (चित्रा 1 ए, बी और संदर्भ 20) के दौरान मस्तिष्क के neuroepithelium दोनों में उत्पन्न कर रहे हैं। जबकि neuroepithelium neuroblasts कि विभेदित ऑप्टिक पालि न्यूरॉन्स उत्पादन को जन्म देता है के रूप में EAD वयस्क आंख, एंटीना और सिर कैप्सूल में विकसित क्लोन आसानी से वयस्कता तक पीछा किया जा सकता।

पच्चीकारी ऊतक, हम डी के व्यापक, आणविक कार्यात्मक और प्ररूपी लक्षण वर्णन की सुविधा के लिएEAD और तीसरे instar लार्वा से मस्तिष्क के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल मुंशी और रूपरेखा कैसे तीन विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उन्हें प्रक्रिया: (i) ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं और immunostaining का पता लगाने, (ii) ट्यूमर invasiveness और (iii) के विश्लेषण की मात्रा का ठहराव जीन अभिव्यक्ति एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT- पीसीआर) या एक उच्च throughput अनुक्रमण mRNA (mRNA-सेक) (चित्रा 1 सी) का उपयोग बदल जाता है।

immunostaining प्रोटोकॉल एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ब्याज की किसी भी प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों से एक विशेष संकेतन मार्ग की गतिविधि पर सुविधाजनक और सटीक spatiotemporal जानकारी प्रदान करते हैं। सेल-वंश विशिष्ट पत्रकारों, दूसरे हाथ पर, पच्चीकारी ऊतक के भीतर और अलग जीनोटाइप के ट्यूमर सेल आबादी के बीच में गुणात्मक और मात्रात्मक परिवर्तन को प्रतिबिंबित। आक्रामक व्यवहार की मात्रा जीनोटाइप के बीच ट्यूमर द्रोह की तुलना की सुविधाएस। अंत में, प्रोटोकॉल आरएनए अलगाव के लिए पच्चीकारी EAD का संग्रह और प्रसंस्करण का वर्णन इस तरह रिवर्स QRT- पीसीआर और जीनोम चौड़ा mRNA-सेक, क्रमशः के द्वारा पीछा प्रतिलेखन के रूप में दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। इन assays से प्राप्त गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा प्रतिरूप ट्यूमर के सामाजिक व्यवहार में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे अलग-अलग जीन, आनुवंशिक नेटवर्क और विभिन्न चरणों में ट्यूमर microenvironment और tumorigenesis के पहलुओं की भूमिका पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक ठोस नींव का उत्पादन।

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Protocol

नोट: यह काम eyFLP1 का इस्तेमाल करता है; अधिनियम> y +> Gal4, यूएएस GFP; FRT82B, टब-Gal80 MARCM 82B ग्रीन परीक्षक रेखा 11। ऐसे w के रूप में स्ट्रेन के पुरुषों के लिए MARCM 82B ग्रीन परीक्षक कुंवारी पार; यूएएस एक; यूएएस ख आरएनएआई, FRT82B ग mut जीनोटाइप संतान जिसमें mitotic पुनर्संयोजन 3 मुताबिक़ गुणसूत्रों का सही हथियार के बीच हो जाएगा निकलेगा। इस तरह, जीन FRT82B साइट के लिए बाहर स्थित ग के लिए क्लोन homozygous उत्परिवर्ती EAD और मस्तिष्क neuroepithelium के भीतर उत्पन्न हो जाएगा। ये क्लोन GFP, ट्रांस्जीन एक और जीन बी (चित्रा 1 ए) के लिए dsRNA व्यक्त करेंगे। एक्स, 2L, 2R, 3 एल और 3R पर पुनर्संयोजन के लिए विभिन्न eyFLP-MARCM परीक्षक लाइनों की स्थापना की और मक्खी समुदाय के भीतर उपलब्ध हैं की है।

1. फ्लाई हैंडलिंग, पार, और मचान

  1. कई बो populating द्वारा कमरे के तापमान पर उचित MARCM परीक्षक शेयर विस्तारएक ही समय में ttles। ताजा बोतलों में हर 2-3 दिनों वयस्कों पलटें तो यह है कि पर्याप्त कुंवारी बाद के पार के लिए एकत्र किया जा सकता है।
    नोट: जब कुंवारियों का संग्रह है, के रूप में इस महिला उपजाऊपन समझौता 2 सह करने के लिए एक लंबे समय तक निवेश करने से बचें।
  2. प्रयोग के पैमाने पर निर्भर करता है, कम से कम 10 MARCM परीक्षक कुंवारी और 4 पुरुषों (जैसे, फ्लोरोसेंट संवाददाताओं और immunostaining की इमेजिंग के लिए) या कम से कम 30 कुंवारियों और 10 पुरुषों (जैसे, के लिए के साथ बोतलों में उपयोग करते हुए शीशियों में मक्खी पार की स्थापना शाही सेना अलगाव और invasiveness की मात्रा का ठहराव)।
  3. एक लंबे दिन 16 घंटा / 8 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर संतान उठाएँ। नई शीशियों / बोतलों में माता-पिता फ्लिप हर 24 घंटा के लार्वा की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मचान की सुविधा के लिए और भीड़भाड़ रोकने के लिए।
    नोट: अंडे बिछाने (AEL) के बाद 6 दिन पर शुरू, देर तीसरे instar नियंत्रण लार्वा को रोकने के खिला, भटक शुरू करते हैं और pupariation दर्ज करें। इसके विपरीत, लार्वा-पोटा संबंधी संक्रमण की शुरुआत डे के किया जा सकतारखी या EAD hyperplastic या घातक ट्यूमर प्रतिरूप असर के साथ लार्वा में न के बराबर।

2. तीसरे instar लार्वा एकत्रित

  1. immunostaining के लिए, के बारे में 20 देर तीसरे instar लार्वा (दीवार पर भटक और भोजन से एक तुलनीय शरीर के आकार के उन) इकट्ठा। संदंश का प्रयोग धीरे शीशी या बोतल से लार्वा लेने और उन्हें एक भ्रूण कांच फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ भरा डिश में स्थानांतरित करने के लिए।
    1. शाही सेना अलगाव और invasiveness की मात्रा का ठहराव के लिए, कम से कम 80 देर तीसरे instar लार्वा (दीवार पर भटक और भोजन से एक तुलनीय शरीर के आकार के उन) इकट्ठा। लार्वा युक्त एक मक्खी की बोतल में पीबीएस धार के लिए जब तक सतह कवर किया जाता है एक धार की बोतल का प्रयोग करें।
    2. एक रंग के साथ भोजन के ऊपर परतों नरम और एक पेट्री डिश में भोजन लार्वा युक्त मुहब्बत डालना। संदंश का प्रयोग, धीरे लार्वा लेने और उन्हें एक भ्रूण कांच पीबीएस के साथ भरा पकवान में स्थानांतरित।
  2. पीबीएस UNT साथ लार्वा धोआईएल सभी अवशिष्ट भोजन निकाल दिया जाता है। 16X बढ़ाई करने के लिए 8 के साथ फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत लार्वा का निरीक्षण सभी "तेंदुए लार्वा" है कि लार्वा पूरे शरीर में यादृच्छिक GFP पॉजिटिव स्पॉट (चित्रा 2A, 2 बी और वहाँ चर्चा खंड) ले त्यागने के लिए।
    नोट: शाही सेना के अलगाव के लिए 1 मिनट के लिए 70% EtOH में एक अंत से पहले धोने कदम शामिल हैं।
  3. विच्छेदन जब तक बर्फ पर पीबीएस में चयन किया लार्वा युक्त पकवान रखें। 30 मिनट के भीतर प्रक्रिया लार्वा ठंड और भुखमरी के प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए।

3. लार्वा के विच्छेदन

  1. एक stereomicroscope के तहत EAD काटना करने के लिए, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग धीरे गिलास पकवान नीचे के खिलाफ लार्वा के मध्य भाग प्रेस करने के लिए। दूसरी संदंश के साथ, लार्वा मुंह हुक हड़पने के लिए और उन्हें शरीर (चित्रा -2) से दूर खींच।
    नोट: खींच बल अक्सर EAD पै जोड़ने के ऑप्टिक डंठल को तोड़ने के लिए पर्याप्त हैमस्तिष्क पालियों को आर। मस्तिष्क या अपने हिस्से EAD से जुड़ी रहने और उनकी उपस्थिति आगे अनुप्रयोगों के लिए वांछित नहीं है, तो संदंश के दो जोड़े की मदद से ऑप्टिक डंठल काट दिया। आक्रामक ट्यूमर (जैसे, रास V12 scrib 1) EAD और मस्तिष्क पालियों के बीच संबंध तेजी से overgrowing और प्रतिरूप कोशिकाओं पलायन करके समय के साथ छिप हो जाता है।
    1. एक अक्षुण्ण उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) (चित्रा 2 डी) के साथ EAD / मस्तिष्क जटिल तैयार करते हैं, शरीर के बीच में एक लार्वा कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें। पीछे आधे त्यागें।
    2. एक संदंश के सुझावों के बीच लार्वा शरीर के पूर्वकाल आधा पकड़ो, लार्वा दूसरे संदंश की नोक के साथ मुंह हुक में धकेलने के द्वारा और पहले संदंश जोड़ी के साथ इस पर छल्ली रोलिंग द्वारा अंदर-बाहर फ्लिप।
  2. संदंश का प्रयोग करते हुए EAD जोड़ी छोड़ने ध्यान से सभी बाहरी ऊतकों (जैसे, लार ग्रंथियों, वसा शरीर, और पेट) को हटाने याEAD / मस्तिष्क जटिल मुंह हुक से जुड़ा है। सुलझाना overlying छल्ली से मुंह हुक। नि: शुल्क वीएनसी शरीर की मांसपेशियों और एपिडर्मिस (आंकड़े 1 बी, -2, 2 डी) के लिए बढ़ा axonal अनुमानों विच्छेद करके।
    नोट: मुंह हुक संदंश के साथ ऊतक के सुरक्षित हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं और धोने के दौरान और अधिक कुशल डूबने और ऊतकों की आसान मान्यता की सुविधा। विच्छेदित EAD परिवर्तन आकृति विज्ञान अपेक्षाकृत तेजी से जब पीबीएस में unfixed रखा। 20-30 मिनट के लिए सीमा विच्छेदन का समय है।
  3. ऊतक हस्तांतरण करने के लिए, कोट शेष शरीर pipetting द्वारा एक P20 micropipette टिप ऊपर और नीचे कई बार शवों। बड़ा EAD / मस्तिष्क परिसरों का स्थानांतरण करने, कैंची से P20 micropipette टिप काटा।
    नोट: कोटिंग प्रक्रिया स्थानांतरण के दौरान चिपके हुए हैं और विच्छेदित ऊतक के नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। एक P20 micropipette का प्रयोग करें, लगानेवाला समाधान में पीबीएस के हस्तांतरण को कम करता अवांछित कमजोर पड़ने सीमित।
    1. immunostaining के लिए स्थानांतरितसाथ 400 μl 4% paraformaldehyde (पीएफए) लगानेवाला भरा एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में EAD विच्छेदित। बड़ा EAD के लिए 1 मिलीलीटर पीएफए ​​के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का प्रयोग करें / मस्तिष्क परिसरों invasiveness की स्कोरिंग के लिए बने।
      चेतावनी: पीएफए ​​बेहद जहरीला है। सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें। त्वचा, आंखों या श्लेष्मा झिल्ली के साथ संपर्क से बचें।
    2. शाही सेना के अलगाव के लिए ठंड पीबीएस के साथ भरा एक नया कांच डिश में विच्छेदित EAD हस्तांतरण। अंगूठी और लसीका ग्रंथियों से EAD साफ करने के लिए, नमूना संदूषण को कम करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
    3. एंटीना डिस्क और मुंह हुक संदंश (चित्रा 2 ई) का उपयोग कर के बीच संबंध विच्छेद करके मुंह हुक से EAD को अलग करें। आरएनए गिरावट और जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों से बचने के लिए, 30 मिनट के लिए सीमा विच्छेदन का समय है। चरण 7 के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: एक अनुभवी शोधकर्ता 30 मिनट को छोड़कर समय लार्वा संग्रह और कपड़े धोने के लिए आवश्यक में लगभग 60 लार्वा काटना कर सकते हैं। कुल शाही सेना पैदावार EAD आकार कि जीनोटाइप और developmentà में भिन्नता है पर निर्भरएल चरणों। देर तीसरे instar लार्वा से 80-100 नियंत्रण EAD जोड़े के विच्छेदन उपज चाहिए 5-8 माइक्रोग्राम कुल शाही सेना।

4. फिक्सिंग, immunostaining, और बढ़ते

  1. 25 मिनट के लिए पीएफए ​​लगानेवाला में नमूने ठीक है, जबकि कमरे के तापमान पर nutating। निर्धारण समय ऊतक आकृति विज्ञान और प्रोटीन की प्रतिजनकता बदलने के बिना 60 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है।
  2. एक nutator का उपयोग कर 10 मिनट के लिए तीन बार (0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) PBST के साथ लगानेवाला और धोने के नमूने निकालें। प्रत्येक धोने कदम (400 μl / 0.5 मिलीलीटर ट्यूब) के लिए PBST की पर्याप्त मात्रा का प्रयोग करें।
    नोट: फिक्स्ड EAD / मस्तिष्क परिसरों invasiveness की स्कोरिंग के लिए बने immunostaining की आवश्यकता नहीं है। GFP संकेत निर्धारण के बाद अच्छी तरह से दिखाई दे बनी हुई है। अंतिम विच्छेदन के लिए 4.4 कदम करने के लिए आगे बढ़ें।
    1. immunostaining के लिए, एक अवरुद्ध कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के साथ 20 मिनट के लिए समाधान (0.3% BSA के साथ PBST) के 200 μl में ब्लॉक ऊतक।
      1. रस्मी साथ सेतेआरे एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अवरुद्ध समाधान रात भर के 100 μl में पतला जबकि धीरे मिलाते हुए। प्राथमिक एंटीबॉडी पत्रक या सिफारिश की एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए प्रकाशित साहित्य का संदर्भ लें।
        नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
      2. PBST में पांच से 10 मिनट washes के बाद, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग ऊतक अवरुद्ध समाधान में पतला जबकि धीरे अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मिलाते हुए या रात।
      3. धो नमूने तीन बार PBST में 10 मिनट।
  3. DAPI धुंधला समाधान के 500 μl के साथ PBST बदलें। एफ actin लेबल, DAPI धुंधला समाधान के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित phalloidin जोड़ें। बाद अंधेरे में 15 मिनट शिखावर्तन, PBST के साथ 10 मिनट के लिए एक बार ऊतक धो लें।
    नोट: एफ actin लेबलिंग DAPI धुंधला की स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है।
  4. अंतिम विच्छेदन कदम के लिए, एक 1 मिलीलीटर गड़बड़ी का उपयोग कर एक पीबीएस भरा गिलास पकवान में वापस ऊतक हस्तांतरणPette। संदंश के दो जोड़े का प्रयोग मुंह हुक बंद क्लिप।
    1. दिमाग कि ऊंचा हो गया EAD के रूप में ऑप्टिक डंठल काटने के विश्लेषण में बाधा हो सकती द्वारा EAD से invasiveness की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा अलग करें।
  5. एक एक उद्देश्य स्लाइड पर बढ़ते मध्यम के ड्रॉप (एक 22 मिमी x 22 मिमी coverslip के लिए 15 μl) रखें। संदंश सुझावों की मदद से, एक पतली परत में मध्यम वितरित। एक P20 micropipette के साथ बढ़ते मध्यम में EAD, दिमाग या EAD / मस्तिष्क परिसरों स्थानांतरण।
  6. संदंश सुझावों या एक टंगस्टन रॉड का प्रयोग ऊतक वितरित करने और स्लाइड पर वीएनसी सीधा करने के लिए।
  7. बुलबुले जबकि बढ़ते, पहला स्पर्श बढ़ते मध्यम करने के लिए एक coverslip के एक किनारे और फिर धीरे धीरे संदंश की मदद से बढ़ते मध्यम पर कम के गठन से बचने के लिए। फिल्टर पेपर या ऊतक के छोटे टुकड़े का उपयोग coverslip किनारों के आसपास अतिरिक्त बढ़ते मध्यम अवशोषित करने के लिए साफ कर लें।
    नोट: DABCO / पाली (विनाइल शराब) 4-88 बढ़ते मध्यम और मज़बूत बनाता हैएक घंटे के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर। स्लाइड्स 4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

5. Confocal इमेजिंग

  1. एकल confocal वर्गों और ढेर एक confocal 20X, 40X और 60X तेल उद्देश्यों के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग मोल।
  2. पिक्सेल संतृप्ति रोकें। छवि संकल्प, लेजर इनपुट शक्ति, लाभ, ऑफसेट, फ्रेम औसतन, एक जेड श्रृंखला में एक कदम आकार सहित एक ही छवि अधिग्रहण पैरामीटर का उपयोग करें और सभी जीनोटाइप के लिए इन सेटिंग्स को बनाए रखने के लिए अलग जीनोटाइप 21,22 के बीच पिक्सेल तीव्रता की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: EAD / मस्तिष्क परिसर के दृश्य के लिए, अधिकतम अनुमानों पैदा करते हैं और संबंधित पड़ोसी छवियों सिलाई। अंतिम छवि तैयारी के लिए, पैनल विधानसभा के लिए पोस्ट इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और चमक और विपरीत समायोजित करने के लिए।

6. ट्यूमर invasiveness की मात्रा

  1. एक स्कोरिंग प्रणाली है कि ट्यूमर invasivenes के विभिन्न स्तरों को चिह्नित करेगा परिभाषित करेंआक्रमण के स्थानिक पैटर्न और GFP सकारात्मक मस्तिष्क और VNC में फैल कोशिकाओं की राशि पर विचार है। प्रलेखन (चित्रा 3) के लिए मूल्यांकन शीट तैयार करें।
  2. माउंट में कम से कम 80 प्रति 24 मिमी x 50 मिमी coverslip बढ़ते मध्यम के 40 μl का उपयोग कर एक स्लाइड पर प्रत्येक जीनोटाइप के लिए बरकरार दिमाग तय की।
    1. निष्पक्ष स्कोरिंग अनुमति देने के लिए, स्लाइड अनाम बना है, ताकि स्कोरिंग प्रक्रिया निष्पक्ष है एक तटस्थ पार्टी में पूछते हैं। स्वतंत्र रूप से दो प्रयोगशाला के सदस्यों द्वारा अनामीकृत स्लाइड का मूल्यांकन। जीनोटाइप के बाद ही मतगणना समाप्त हो गया है खुलासा।
  3. एक फ्लोरोसेंट एक GFP फिल्टर सेट से लैस stereomicroscope के तहत मुहिम शुरू की दिमाग की एक अंधे स्कोरिंग से द्रोह की डिग्री का मूल्यांकन। दिमाग कि पहले से ही दोहरी गणना (चित्रा 3 बी) से बचने के लिए देखा गया है लेबल करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें।
  4. जीनोटाइप प्रति परिभाषित आक्रामक श्रेणियों में से प्रत्येक में गिरने से दिमाग के प्रतिशत की गणना। निर्धारित बनाने के लिए सांख्यिकीय रोंignificance एक ची के वर्ग परीक्षण (चित्रा 3 सी) के प्रयोग से।

7. आरएनए अलगाव, DNase उपचार, और गुणवत्ता की जांच

नोट: सभी अभिकर्मकों (समाधान, plasticware) निम्न चरणों में इस्तेमाल किया RNase गतिविधि से मुक्त होना चाहिए। हमेशा दस्ताने पहनना और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ काम करने के लिए एक रासायनिक हुड का उपयोग करें।

  1. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक लेपित P20 micropipette टिप के साथ स्वच्छ EAD स्थानांतरण।
  2. ट्यूब के नीचे ऊतक डूब जाने, ध्यान से पीबीएस हटाने और 100 μl आरएनए सेल अभिकर्मक (अप करने के लिए 140 EAD के लिए पर्याप्त) के साथ बदलें।
  3. vortexing द्वारा Lyse ऊतक। इस बिंदु पर, नमूने तरल नाइट्रोजन में गहरी जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या सीधे एक मानक शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल के साथ कार्रवाई की जा सकती।
    नोट: कई विच्छेदन दौर से समान जीनोटाइप के नमूने आरएनए सेल अभिकर्मक में एक बार जमा किया जा सकता है।
  4. आरएनए सेल अभिकर्मक के साथ 0.9 मिलीलीटर के लिए नमूना मात्रा भरें। क्लोरोफॉर्म के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें और VIGORO नमूने मिश्रण15-20 सेकंड के लिए usly।
  5. कमरे के तापमान पर 2 से 3 मिनट ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  6. अंतरावस्था परेशान करने के बिना एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरण बेरंग ऊपरी जलीय चरण युक्त आरएनए। अंतरावस्था से दूर रहने के रूप में यह प्रोटीन और जीनोमिक डीएनए होता है।
    नोट: बरामद मात्रा homogenization के लिए इस्तेमाल किया आरएनए सेल अभिकर्मक की मात्रा के बारे में 60% होना चाहिए।
  7. isopropyl शराब के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर शाही सेना वेग। भंवर और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 75% इथेनॉल के 600 μl के साथ एक बार शाही सेना गोली धो लें। एक छोटी भंवर और centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 10,000 XG) के बाद सभी इथेनॉल त्यागने और 5-10 मिनट के लिए एक साफ ऊतक पोंछ पर खुला ट्यूब रखने के लिए शाही सेना गोली हवा शुष्क करते हैं।
    नोट: शाही सेना गोली एक छोटे से अपारदर्शी / सफेद सेंट के रूप में दिखाई हो सकता हैट्यूब या अदृश्य के तल पर पका हुआ। शेष इथेनॉल बूँदें ध्यान P10 micropipette टिप के साथ हटाया जा सकता है।
  10. एक विंदुक टिप के माध्यम से vortexing या एक बार कुछ समाधान से गुजर रहा DEPC इलाज पानी की 50 μl में शाही सेना भंग।
  11. जीनोमिक डीएनए के साथ प्रदूषण को कम करने के लिए, DNase के 1 μl (2 यू / μl) और DEPC इलाज पानी में 10x DNase बफर के 10 μl युक्त एक मिश्रण के 50 μl जोड़कर DNase के साथ कुल शाही सेना का इलाज। भंवर और नीचे स्पिन।
  12. एक पानी के स्नान या 30 से 40 मिनट के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक नमूने में DEPC इलाज पानी के 100 μl जोड़ें।
  13. DNase से enzymatic गतिविधि और साफ आरएनए निष्क्रिय करने के लिए, फिनोल के 200 μl जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25: 24: 1) समाधान, भंवर 1 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूने हैं।
  14. ध्यान से एक ताजा ट्यूब में शाही सेना युक्त ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण। बराबर मात्रा में जोड़ें (200 μl)क्लोरोफॉर्म का मिश्रण है, और ऊपर से centrifugation कदम दोहराएँ।
  15. ध्यान से ऊपरी चरण ले लीजिए और 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 मात्रा जोड़कर आरएनए वेग, पीएच 5.2 DEPC एच 2 हे और 2.5 100% इथेनॉल की मात्रा में तैयार किया। vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स।
    नोट: एक वर्षा मिश्रण करने के लिए 0.5 μl ग्लाइकोजन (20 माइक्रोग्राम / μl) जोड़ना शाही सेना गोली कल्पना करने के लिए मदद करता है। आरएनए नुकसान को कम करने के लिए, siliconized, कम बाध्यकारी 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग करें।
  16. कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना को वेग।
    नोट: ऊष्मायन रात भर बाहर किया जा सकता है। नमूने के रूप में अच्छी तरह से -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली आरएनए। धो और 7.9 में विवरण निम्न सूखी गोली।
  18. DEPC इलाज पानी की 10-15 μl में शाही सेना भंग। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर आरएनए।
  19. 230 एनएम, 260 एनएम और 280 एनएम एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने पर आयुध डिपो को मापने के द्वारा मात्रा और शाही सेना की शुद्धता निर्धारित करते हैं। गणना आरएनए सहसम्मेलन को लागू करने से ncentration कि 260 एनएम 40 माइक्रोग्राम / एमएल आरएनए के बराबर होती है पर 1 आयुध डिपो।
    नोट: "शुद्ध" शाही सेना के एक 260/280 अनुपात 2.0 के बराबर होती है, जबकि एक एक 260/230 अनुपात 2.0-2.2 की सीमा में होना चाहिए। 1.7 और 2.0 के बीच एक एक 260/280 अनुपात के साथ शाही सेना के नमूने ऐसे सीडीएनए संश्लेषण के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। mRNA-सेक पुस्तकालयों की तैयारी के लिए गुणवत्ता और शाही सेना की मात्रा एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग कर जाँच की जानी चाहिए। 28S / 18S अनुपात 1.8 से ऊपर होना चाहिए।

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Representative Results

EyFLP-MARCM तकनीक ड्रोसोफिला EAD में परिभाषित जीनोटाइप के GFP-चिह्नित पैच उत्पन्न करने की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, क्लोन के तीन प्रकार प्रेरित किया गया: (1) नियंत्रण व्यक्त केवल GFP, (2) घातक ट्यूमर छोटे से एक ऑन्कोजेनिक प्रपत्र व्यक्त जी-प्रोटीन रास (रास V12) (scrib 1) एक ट्यूमर शमन जीन घसीटना की homozygous नुकसान की पृष्ठभूमि में, और (3) overgrowing लेकिन गैर इनवेसिव रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. क्लोन है, जहां जून-एन टर्मिनल काइनेज (JNK) ने अपनी प्रमुख नकारात्मक रूप (चित्रा 4, जीनोटाइप के लिए 1 टेबल) की अभिव्यक्ति द्वारा निष्क्रिय किया गया था। यह दिखाया गया है कि रास V12 scrib 1 प्रतिरूप ट्यूमर के invasiveness JNK सिगनल की न्यायपालिका सक्रियण की आवश्यकता है और इसके नीचे की ओर प्रतिलेखन कारक 10,12,23,24 गया है। इसके अलावा, रास V12 scrib 1 14,25 में प्रतिरक्षा कोशिकाओं (बुलाया hemocytes) की घुसपैठ में जिसके परिणामस्वरूप, ड्रोसोफिला लार्वा में एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के।

स्तर और पच्चीकारी ऊतक के भीतर JNK गतिविधि के स्थानिक वितरण और अलग जीनोटाइप के ट्यूमर के बीच की निगरानी करने के लिए, की स्थापना की ट्रांसजेनिक, JNK उत्तरदायी TRE-DsRed रिपोर्टर 26 कार्यरत था। विच्छेदित, तय EAD और EAD के Confocal माइक्रोस्कोपी / मस्तिष्क के ऊतकों परिसरों असर घातक रास V12 scrib 1 ट्यूमर (चित्रा 4 बी) में TRE-DsRed संवाददाता गतिविधि के रूप में चिह्नित अपरेगुलेशन का पता चला। DsRed संकेत लेबल रास V12 scrib EAD (चित्रा 4 बी) के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं में 1 क्लोन मस्तिष्क पालियों में फैल और VNC (चित्रा 4E, 4F) पर हमला। इसके विपरीत, TRE-DsRed संवाददाता गतिविधियोंTy antennal से नियंत्रण डिस्क (चित्रा -4 ए ') की आंख भाग को विस्तार देने की कोशिकाओं के एक स्ट्रिंग के लिए प्रतिबंधित बने रहे। JNK सिगनल अवरूध्द प्रतिरूप रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. ट्यूमर (चित्रा 4C, 4D) में TRE-DsRed संकेत के एक नाटकीय कमी के परिणामस्वरूप। ये आंकड़े इस प्रकार JNK की एक आवश्यकता घातक रास V12 scrib 1 ट्यूमर में TRE निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के संकेत के लिए कार्यात्मक सबूत प्रदान करते हैं। एक वंश विशेष hmlΔ-DsRed संवाददाता, ड्रोसोफिला पता लगाने के लिए तैयार कर लिया 27,28 असर घातक रास V12 scrib 1 ट्यूमर (चित्रा 5 ब) के ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक संग्रह से पता चला है hemocytes। इसके विपरीत, केवल व्यक्तिगत hemocytes या कुछ स्थानीय hemocyte पैच नियंत्रण और रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. पच्चीकारी EAD और मस्तिष्क के ऊतकों में पाया गया(चित्रा 5 ए, 5C)। अखिल hemocyte विरोधी Hemese एंटीबॉडी के साथ Immunostaining (एच 2) 29 hmlΔ-DsRed सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 5 डी, 5e) की प्रतिरक्षा सेल पहचान की पुष्टि की। प्रकाशित रिपोर्ट 12,23,24 के अनुरूप, ट्यूमर invasiveness की निष्पक्ष मात्रा का ठहराव आसन्न मस्तिष्क पालियों और VNC (चित्रा -3 सी) में ट्यूमर आक्रमण को बढ़ावा देने में संकेत JNK के एक केंद्रीय भूमिका की पुष्टि की। अंत में, कुल शाही सेना पच्चीकारी EAD से पृथक किया गया। नमूने QRT- पीसीआर के लिए या तो अधीन या गुणवत्ता और मात्रा के लिए एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली पर विश्लेषण किया गया। चित्रा 6A मैट्रिक्स metalloproteinase के महत्वपूर्ण JNK निर्भर अपरेगुलेशन चलता 1 (mmp1) EAD घातक रास V12 scrib 1 प्रतिरूप ट्यूमर असर, पहले से इस बात की पुष्टि में प्रतिलेख प्रकाशित निष्कर्ष 12,24,30,31। एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग कर कुल शाही सेना के आकलन से पता चला है टीटोपी तीन स्वतंत्र EAD नमूने ऊपर 1.8 (चित्रा 6B) एक 28S / 18S अनुपात था। हालांकि, EAD 2 आरएनए आंशिक रूप से अपमानित किया गया था, जेल (चित्रा 6C) पर एक धब्बा से परिलक्षित। इसके विपरीत, EAD 3 नमूना एक कम एकाग्रता था। जेल छवि (चित्रा 6B) और electropherogram (चित्रा 6C) पर छोटे चोटियों पर उच्च आणविक भार के एकाधिक बैंड, भी डीएनए संदूषण का सुझाव दिया। इस प्रकार, केवल EAD 1 नमूना mRNA-सेक पुस्तकालय की तैयारी के लिए उपयुक्त होगा।

आकृति 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला EAD और बहाव के अनुप्रयोगों में आनुवंशिक मोज़ाइक की पीढ़ी के लिए MARCM प्रणाली के Schematics (ए) MARCM प्रणाली एक अन्यथा जंगली प्रकार में परिभाषित आनुवंशिक घावों के साथ प्रतिरूप पैच की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है (विषमयुग्मजी)।संदर्भ। एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर (जैसे, अंधा) के नियंत्रण में FLP की अभिव्यक्ति उत्प्रेरित दो FRT रोकें कैसेट flanking तत्वों के बीच पुनर्संयोजन एक पीले रंग (y) जीन (अधिनियम> y +> Gal4) के साथ चिह्नित। बंद करो कैसेट के हटाने पर, सर्वत्र Gal4 transcriptional उत्प्रेरक (अधिनियम-Gal4) ऐसे यूएएस GFP (यूएएस भी रास V12) के रूप में किसी भी यूएएस आधारित transgene की अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं व्यक्त की है। एक माता पिता के सेल में, हालांकि, Gal4 गतिविधि एक Gal80 repressor जिनकी अभिव्यक्ति एक tubulin प्रमोटर (टब-Gal80) द्वारा नियंत्रित किया जाता है द्वारा अवरुद्ध है। सेल चक्र के G2 चरण में FLP FRT साइटों के लिए बाहर का मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच गैर-बहन क्रोमेटिडों के आदान-प्रदान मध्यस्थता करता है। पिंजरे का बँटवारा दौरान पुनः संयोजक गुणसूत्रों के अलगाव दो बेटी कोशिकाओं, एक विशेष जीनोमिक ठिकाना के लिए एक होने के homozygous उत्परिवर्ती को जन्म देगा (जैसे, scrib अप> 1) दूसरे जबकि दो जंगली प्रकार alleles ले जाएगा। homozygous उत्परिवर्ती कोशिकाओं में Gal80 की हानि GFP की अभिव्यक्ति की अनुमति होगी। इसके विपरीत, एक जंगली प्रकार बहन GFP नकारात्मक रहता है। (बी) के एक तिहाई instar लार्वा का एक योजनाबद्ध ड्राइंग EAD मुंह हुक करने के लिए और पीछे ऑप्टिक डंठल के माध्यम से मस्तिष्क के लिए पूर्व से जुड़ा जोड़ी को दर्शाया गया है। eyFLP-MARCM प्रणाली EAD और मस्तिष्क पालियों की neuroepithelium भीतर GFP-चिह्नित क्लोन लाती है। (सी) विच्छेदित EAD और दिमाग (mRNA (ii) immunochemistry और ट्रांसजेनिक संवाददाता गतिविधि (मैं) का पता लगाने, ट्यूमर invasiveness की मात्रा का ठहराव सहित विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों और transcriptome की रूपरेखा एक उम्मीदवार (QRT- पीसीआर) या एक निष्पक्ष दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए किए जा सकता है -seq) (iii)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2: तीसरे instar लार्वा और EAD और EAD के प्रतिनिधि उदाहरण के छंटनी / मस्तिष्क परिसरों अलग बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया (एबी) तीसरे instar लार्वा असर नियंत्रण GFP लेबल क्लोन eyFLP-MARCM 82B ग्रीन परीक्षक के साथ प्रेरित फ्लोरोसेंट micrographs।। (ए) EAD और मस्तिष्क पालियों तक ही सीमित क्लोन के साथ प्रतिनिधि नियंत्रण लार्वा। (बी) के एक "तेंदुए लार्वा" पूरे शरीर में विभिन्न ऊतकों में GFP सकारात्मक क्लोन ले जाने का एक उदाहरण है। विच्छेदित EAD और (डी) EAD / मस्तिष्क परिसरों मुंह हुक से जुड़ी है, और (ई) EAD (सी) Brightfield छवियों मुंह हुक सहित सभी बाहरी ऊतक से साफ कर दिया। स्केल सलाखों = 2 मिमी (एबी) और 500 माइक्रोन (सीई)।fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। ट्यूमर invasiveness की मात्रा (ए) दिमाग के फ्लोरोसेंट confocal छवियों रास V12 scrib 1 लार्वा से विच्छेदित (7 दिन AEL) ट्यूमर गैर इनवेसिव से लेकर invasiveness के चार अलग अलग ग्रेड के वास्तविक उदाहरण प्रतिनिधित्व करते हैं (स्कोर 0), एक मस्तिष्क लोब पर आक्रमण (स्कोर 1), प्रतिरूप ऊतक दोनों पालियों मस्तिष्क को कवर करने और वीएनसी में प्रवेश करने के साथ दोनों पालियों मस्तिष्क पर आक्रमण (स्कोर 2) एक मजबूत ट्यूमर आक्रमण करने के लिए (स्कोर 3)। छवियाँ स्कोर 2 के लिए कई confocal वर्गों और उदाहरण के अनुमानों हैं और 3 2 एक्स 2 confocal छवियों से सिले हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। (बी) के लिए इस्तेमाल निष्पक्ष तय दिमाग के साथ एक गुमनाम खुर्दबीन स्लाइड का एक उदाहरणएक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत बनाए। रन बनाए दिमाग डुप्लिकेट पंजीकरण को रोकने के लिए एक कलम के साथ चिह्नित कर रहे हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन (सी) अत्यधिक आक्रामक रास V12 scrib 1 ट्यूमर, JNK संकेत के निषेध (रास V12 scrib 1 JNK डी.एन.) प्रतिरूप कोशिकाओं का सफाया किया आक्रमण की तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: scrib '1 प्रतिरूप ट्यूमर घातक रास' वी 12 'में transcriptional TRE-DsRed रिपोर्टर की सक्रियता JNK पर निर्भर है (ए। TRE-DsRed संवाददाता आंख हिस्सा (तीर) के लिए antennal से चल कोशिकाओं की एक संकरी पट्टी लेबल। (बी) TRE-DsRed रिपोर्टर की गतिविधि स्पष्ट रूप से रास V12 scrib में बढ़ाया गया था आसपास के गैर-प्रतिरूप EAD उपकला की तुलना में 1 GFP सकारात्मक क्लोन। (सी) JNK गतिविधि के निषेध रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. क्लोन में DsRed संकेत तीव्रता का एक स्पष्ट कमी के परिणामस्वरूप। (डी) DsRed संकेत के आगे बढ़ाने रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. क्लोन आसपास की कोशिकाओं में संकेत JNK की गैर स्वायत्त सक्रियण का पता चला। (ई) पर दिन 8 AEL, रास V12 scrib 1 कोशिकाओं पूरे EAD और VNC (तीर) के लिए मस्तिष्क पालियों में फैला overgrew। (एफ) क्षेत्र मीटर की वीएनसी (बंद हुआ हमलावर प्रतिरूप कोशिकाओंई में तीर द्वारा arked) DsRed संकेत के लिए समृद्ध थे। कई confocal वर्गों के अनुमानों (एसी) शो, (ई) 3x3 confocal छवियों से सिले है और (डी, एफ) एकल खंड प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। EAD, आंख / antennal डिस्क; बीएल, मस्तिष्क पालि; वीएनसी, उदर तंत्रिका कॉर्ड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। वंश विशेष HML Δ -DsRed ट्रांसजेनिक संवाददाता रास V12 scrib के संवर्धन 1 ट्यूमर जुड़े hemocytes का पता चलता है (ए) नियंत्रण EAD में, hmlΔ-DsRed संवाददाता लेबल hemocyte CLU sters आंख और antennal उपकला के indentations में फंस रहे हैं। (बी) EAD और मस्तिष्क के ऊतकों रास V12 scrib के शामिल 1 GFP-चिह्नित ट्यूमर सभी प्रतिरूप ऊतक पर बिखरे हुए hemocytes की संख्या में वृद्धि देखी गई। (सी) जुड़े hemocytes की संख्या में नाटकीय JNK सिगनल के निषेध पर रास V12 scrib 1 JNK डी.एन. पच्चीकारी के ऊतकों में कमी आई है। (DE) HmlΔ-DsRed सकारात्मक hemocytes भी एक H2 एंटीबॉडी कि अखिल hemocyte मार्कर Hemese का पता लगाता के साथ लेबल रहे थे। (एसी) कई confocal वर्गों, (ए) से 2 एक्स 2 और (BC) में सिले है के अनुमानों दिखाएँ 3 एक्स 3 confocal छवियों से सिले हैं। (डे) एकल वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन (एसी) और 10 माइक्रोन (डी) में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

e_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 6
चित्रा 6:।। मात्रा और विच्छेदित EAD से अलग कुल शाही सेना की गुणवत्ता का मूल्यांकन (ए) प्रत्येक जीनोटाइप Mmp1 प्रतिलेख के स्तर के लिए चार जैविक प्रतिकृति का उपयोग कर QRT- पीसीआर परिणामों का एक प्रतिनिधि उदाहरण rp49 के लिए सामान्यीकृत थे। जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन रिश्तेदार मानक वक्र विधि 32 का उपयोग कर की गणना की गई। डेटा ± SEM के मतलब मूल्यों कर रहे हैं; *** पी <0.001 असमान विचरण के साथ छात्र unpaired दो पूंछ टी परीक्षण का उपयोग कर। (बी, सी) एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग कर कुल शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन। आभासी जेल छवि (बी) 18S और 28S rRNAs कि electropherograms पर अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों (सी) के अनुरूप के दो प्रमुख बैंड से पता चलता है। डीएनए और आरएनए संदूषण गिरावट के रूप से परिलक्षित होते हैंmear (तीर) और extranumerary बैंड और चोटियों (तीर)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फ्लाई खींच स्रोत / टिप्पणियाँ
eyFLP1; अधिनियम> y +> Gal4, यूएएस GFP; FRT82B, टब-Gal80 eyFLP-MARCM 82B ग्रीन परीक्षक 11
w; यूएएस रास V12; FRT82B scrib 1 / TM6B 12
w; यूएएस रास V12; यूएएस JNK डी.एन. FRT82B scrib 1 / TM6B 12
w; hmlΔ-DsRed; FRT82B इस अध्ययन, w; Katja Brückner 28 से hmlΔ-DsRed
w; यूएएस रास V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B ये पढाई
w; यूएएस रास V12 hmlΔ-DsRed; यूएएस JNK डी.एन. FRT82B scrib 1 / TM6B ये पढाई
w; TRE-DsRed; FRT82B इस अध्ययन, w; डिर्क Bohmann 26 से TRE-DsRed
w; यूएएस रास V12 TRE-DsRed; FRT82B scrib 1 / TM6B ये पढाई
w; यूएएस रास V12 TRE-DsRed; यूएएस JNK डी.एन. FRT82B scrib 1 / TM6B ये पढाई

तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल ड्रोसोफिला लाइनों का सारांश।

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Discussion

तकनीक उत्पन्न करने के लिए ड्रोसोफिला में आनुवंशिक मोज़ाइक विश्लेषण और जीन समारोह 33 से छेड़छाड़ के लिए सबसे अधिक परिष्कृत उपकरण शामिल हैं। EyFLP-MARCM प्रणाली शक्तिशाली और मजबूत सिद्ध के रूप में यह एक स्थानिक प्रतिबंधित तरीके से नेत्रहीन चिह्नित, आनुवंशिक रूप से परिभाषित क्लोन की प्रेरण की अनुमति देता है, यानी, ऊतकों जहां अंधा बढ़ाने सक्रिय 9,18 है में किया गया है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब कई आनुवंशिक घावों ही कोशिकाओं में संयुक्त रहे है। इन बेहद न्यायपालिका पैच लार्वा विकास की अनुमति है जब EAD और मस्तिष्क neuroepithelia तक ही सीमित है, वे मारक जब गर्मी झटका नियंत्रित FLP (hsFLP) क्लोन के मामले में लार्वा शरीर में फैले हुए पैदा कर सकता है। गौरतलब है कि मक्खी EAD उपकला में क्लोन की प्रेरण जिसमें सक्रिय ओंकोजीन ट्यूमर शामक के नुकसान के साथ गठबंधन उद्भव और कुछ मानव कैंसर में ठोस उपकला ट्यूमर को बढ़ने से स्मरण दिलाता है। होwever, इस प्रणाली को भी अपनी सीमाएं है कि संक्षेप में चर्चा की जाएगी है। यह देखते हुए कि कीड़ों को एक खुला संचार प्रणाली है, सच मेटास्टेसिस के रूप में मानव के कैंसर में मनाया नहीं होती है। इसलिए मेटास्टेटिक प्रसार की जटिल प्रक्रिया ईमानदारी ड्रोसोफिला में मॉडलिंग नहीं किया जा सकता। फिर भी, इस तरह के रास V12 scrib 1 क्लोन के रूप में EAD ट्यूमर के रूप में वे EAD आसपास के बेसल झिल्ली टूट और आसन्न मस्तिष्क 11,12,31 पर आक्रमण घातक गुणों को प्रदर्शित करते हैं। ट्यूमर आक्रामकता की डिग्री मात्रा निर्धारित और अलग जीनोटाइप इस अध्ययन में वर्णित के रूप में तुलना की जा सकती। यह भी ध्यान दें कि मूसा EAD में विशिष्ट आनुवंशिक घावों की उपस्थिति विकासात्मक समय और लार्वा विकास की अवधि को प्रभावित कर सकता है महत्वपूर्ण है। लार्वा के मंचन का निर्धारण करेगा पच्चीकारी के ऊतकों का विश्लेषण एक ही कालानुक्रमिक या विकास मंच के जानवरों का उपयोग किया जाएगा कि क्या। एक पायलट प्रयोग प्रदर्शन एक के प्रभाव का आकलन करने के लिएविकास समय पर नए EAD प्रतिरूप जीनोटाइप वांछनीय है।

वहाँ तकनीकी सीमाओं के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं। सबसे पहले, कि eyFLP-MARCM उपकरण के साथ बनाया जा सकता है विभिन्न प्रतिरूप जीनोटाइप की संख्या महान है, लेकिन अनंत नहीं है। उदाहरण के लिए, दो के संयोजन उत्परिवर्ती alleles कि विभिन्न गुणसूत्रों पर रहते दोनों गुणसूत्रों पर पुनर्संयोजन की कम क्षमता द्वारा एक साथ रुकावट है, और छोटे चौथे गुणसूत्र पर स्थित जीन आम तौर पर दुर्गम हैं। ट्रांसजेनिक आरएनएआई का उपयोग कर पछाड़ना जीन एक वैकल्पिक समाधान है। जब तक Gal80 repressor अपमानित किया जाता है न - हालांकि, यह एहसास है कि ट्रांसजीन तुरंत mitotic पुनर्संयोजन पर व्यक्त नहीं कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। Gal4 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली की गतिविधि को 29 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ रही लार्वा द्वारा बढ़ाया जा सकता है। यह, हालांकि कि ऊंचा तापमान वृद्धि दर, विकास समय, Metaboli सहित विभिन्न विकासात्मक शारीरिक और आणविक मानकों को प्रभावित करता है को ध्यान में रखना है, महत्वपूर्णएसएम और जीन अभिव्यक्ति 34-37। इस प्रकार, इस तरह के लार्वा का मंचन या transcriptome की रूपरेखा के लिए विच्छेदित EAD की संख्या के रूप में प्रदान प्रोटोकॉल के रूपांतरों आवश्यक होगा।

eyFLP-MARCM परीक्षकों स्वास्थ्यप्रद उपभेदों के बीच में नहीं हैं। एक जीनोम समझौता में कई ट्रांसजीन फिटनेस और उपजाऊपन उड़। इन शेयरों अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है बनाए रखा और कुंवारी महिलाओं के बड़े संग्रह के लिए विस्तारित किया जा सके। जैसा कि इस अध्ययन, MARCM 82B ग्रीन परीक्षक रेखा 11 है, हालांकि व्यवहार्य में दस्तावेज जब homozygous, आनुवंशिक रूप से अस्थिर है। यह "तेंदुए लार्वा" है कि अस्थानिक, GFP लेबल आंत, tracheae, वसा शरीर, और लार्वा एपिडर्मिस सहित विभिन्न polyploid ऊतकों के भीतर क्लोन प्रदर्शित की सहज उपस्थिति से स्पष्ट है। यह घटना तब होती है सब पैतृक जीनोटाइप के स्वतंत्र पार में। हम अनुमान है कि अस्थानिक GFP पैच दो एफआर के बीच अनियंत्रित, स्टोकेस्टिक पुनर्संयोजन से परिणामFLP-बाहर कैसेट में टी साइटों, पीला + मार्कर "रोक कैसेट" को हटाने के कारण। Polyploid ऊतकों में, tubulin प्रमोटर संचालित Gal80 repressor Gal4 गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है। EAD और मस्तिष्क के अलावा अन्य ऊतकों में आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है कि प्रणालीगत प्रयोगात्मक क्लोन के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है बटोर सकता है। ये "तेंदुए लार्वा" इसलिए विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, हम नियमित तौर पर फिर से स्थापित एकल पुरुष-महिला पार से MARCM 82B ग्रीन परीक्षक।

नुकसान से ऊपर उल्लेख के बावजूद, जीन कार्यों का अध्ययन करने के eyFLP-MARCM प्रणाली के अनुप्रयोगों और प्रतिरूप ट्यूमर और अपने वातावरण के बीच बातचीत कई गुना कर रहे हैं। ऐसे LexA के रूप में Gal4 / यूएएस स्वतंत्र अभिव्यक्ति बाइनरी सिस्टम का परिचय / LexOp 38 या दवा चलाया QF / QUAS / क्यु 39,40 ट्रांस्जीन ऍक्स्प पर एक ठीक नियंत्रण प्रदान करेगाression और / या एक साथ लेबलिंग और प्रतिरूप, गैर प्रतिरूप उपकला कोशिकाओं और hemocytes सहित विभिन्न सेल आबादी के हेरफेर। इस तरह की पच्चीकारी के ऊतकों को फिर से यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार कार्रवाई की जा सकती है।

तीसरे instar लार्वा (प्रोटोकॉल धारा 3) से पच्चीकारी EAD और EAD / मस्तिष्क परिसरों के विच्छेदन के लिए विधि के रूप में अच्छी तरह से पहले विकास के चरणों को लागू किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, EAD / मस्तिष्क परिसरों के लिए प्रोटोकॉल विंग, haltere और पैर imaginal डिस्क की वसूली के लिए परमिट। इन शाही सेना अलगाव (प्रोटोकॉल वर्गों 3.3.2 और 7), ब्याज की डिस्क बाहरी ऊतक से साफ किया और इसी तरह से संसाधित EAD करने के लिए किया जाना चाहिए के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अपने छोटे आकार को देखते हुए, एकत्र haltere और पैर डिस्क की संख्या शाही सेना के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए वृद्धि की जानी चाहिए।

EAD (प्रोटोकॉल धारा 7) से कुल शाही सेना की निकासी के लिए प्रोटोकॉल आरएनए सेल अभिकर्मक के आधार पर विभिन्न वाणिज्यिक वी से उपलब्ध हैendors (सामग्री / उपकरण की सूची देखें)। प्रक्रिया के समग्र सफलता मुख्य रूप से निर्भर करता है: (i) लार्वा की पर्याप्त संख्या होने, (ii) त्वरित और सटीक जा रहा है, जबकि विदारक, और (iii) नमूने RNases से मुक्त रखते हुए। साफ है, काम करने की जगह और उपकरणों रखते हुए दस्ताने पहने, RNase मुक्त प्लास्टिक के बर्तन और समाधान का उपयोग, और बर्फ पर नमूने रखते हुए सभी आरएनए गिरावट को कम। किसी भी जीनोमिक डीएनए कि पूरी तरह से DNase उपचार (प्रोटोकॉल खंड 7.11) से हटाया नहीं जा सकता है के साथ शाही सेना के प्रदूषण को रोकने के लिए, यह पहली बार है जब (प्रोटोकॉल खंड 7.6) के लिए जलीय चरण एकत्रित अंतरावस्था से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। दोनों डीएनए प्रदूषण और आरएनए गिरावट एक स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (चित्रा 6B, 6C) पर नमूने चल रहा से पता चला जा सकता है। शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल एक व्यापक आवेदन किया है। यह सफलतापूर्वक विभिन्न विकासात्मक चरणों में पूरे लार्वा से शाही सेना निकासी, वयस्कों से, और विभिन्न के लिए इस्तेमाल किया गया हैलार्वा अंगों। प्राप्त आरएनए दोनों QRT- पीसीआर और mRNA-सेक 20,24,41,42 द्वारा जीनोम चौड़ा transcriptome विश्लेषण के लिए उपयुक्त था। QRT- पीसीआर कि ज्यादातर पर चयनित mRNAs के दसियों quantifies की तुलना में, निष्पक्ष mRNA अनुक्रमण जीनोम चौड़ा अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती परमिट। इस प्रकार, एक tumorigenesis 24 के अलग चरणों में विशिष्ट आनुवंशिक घावों से प्रेरित ट्यूमर के पूरे transcriptome हस्ताक्षर तुलना कर सकते हैं। यह ध्यान रखें कि शाही सेना को पूरे डिस्क से आता है में रखने के लिए इतना है कि परिणाम केवल क्लोन में बल्कि आसपास, गैर प्रतिरूप ऊतक में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करेगा महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं - उपलब्ध प्रोटोकॉल आदत डाल द्वारा फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) अलग पच्चीकारी EAD पर प्रदर्शन 43,44 विशिष्ट सेलुलर आबादी, जैसे, प्रतिरूप (GFP +) और गैर-प्रतिरूप (GFP) के transcriptional हस्ताक्षर निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित निर्धारण और immunostaining प्रोटोकॉल सिमुल के लिए अनुकूल हैविशिष्ट एंटीबॉडी और ट्रांसजेनिक संवाददाताओं की गतिविधि के साथ ब्याज की प्रोटीन की taneous दृश्य। दोनों GFP संकेत प्रतिरूप कोशिकाओं और DsRed प्रतिदीप्ति दो ट्रांसजेनिक इस अध्ययन में इस्तेमाल संवाददाताओं से किसी के द्वारा उत्पादित अंकन निर्धारण और immunostaining भर में संरक्षित कर रहे हैं और सीधे confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं। हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी संकेत तीव्रता बढ़ाना कर सकते हैं। इसी तरह, एक विरोधी β-galactosidase एंटीबॉडी का उपयोग बैक्टीरियल lacZ जीन के आधार पर ट्रांसजेनिक संवाददाताओं का पता लगाने की सुविधा होगी। सापेक्ष संवाददाता गतिविधियों बनाम गैर प्रतिरूप ऊतक का उपयोग कर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी, ImageJ) क्लोन के रिश्तेदार पिक्सेल तीव्रता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। जब अलग प्रतिरूप जीनोटाइप के बीच संवाददाता गतिविधि की तुलना, छवि अधिग्रहण सेटिंग्स निरंतर (प्रोटोकॉल धारा 5 और संदर्भ 21,22) रखा जाना चाहिए। हालांकि प्रोटोकॉल कई अलग अलग एक साथ अच्छी तरह से काम करता हैntibodies, यह सिफारिश की एंटीबॉडी सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। बदलाव भी निर्धारण समय, प्रकार और डिटर्जेंट (ट्राइटन X-100, बीच -20, सैपोनिन) और लगानेवाला (8% पीएफए, 4% formaldehyde, EtOH) की एकाग्रता में आवश्यक हो सकता है।

प्रोटोकॉल के ऊपर चर्चा के विपरीत, ट्यूमर invasiveness की मात्रा का ठहराव तीसरे instar लार्वा चरण और EAD / मस्तिष्क जटिल तक सीमित है। फिर भी, अपनी समग्र औचित्य किसी भी मात्रात्मक अध्ययन जहां संज्ञानात्मक पूर्वाग्रह से परहेज करने की जरूरत है के लिए आवेदन कर सकते हैं। विधि पूर्णता की आवश्यकता है। समय में ट्यूमर द्रोह बढ़ जाती है, यह एक ही उम्र के लार्वा की तुलना करने के लिए आवश्यक है (जैसे, अंडे बिछाने के बाद 7 या 8 दिन)। समय के साथ एक प्रतिरूप ट्यूमर बड़े पैमाने पर ऊंचा हो जाना कर सकते हैं, फिर भी ट्यूमर कोशिकाओं EAD के भीतर रह सकती है। कदम है जो दिमाग में EAD (प्रोटोकॉल धारा 4.4.1) से अलग हो रहे हैं इसलिए झूठी सकारात्मक invasiveness में गिना जाता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। संलग्न EAD के साथ दिमाग के बढ़ते Flatt होगाऊतकों एन, मस्तिष्क संरचना को कवर किया और इस प्रकार किसी भी मात्रा का ठहराव को रोकने के लिए ऊंचा हो गया EAD के कारण। आदर्श रूप में, एक के रहने वाले लार्वा में सीधे इनवेसिव प्रक्रिया पर कब्जा करना चाहते हैं। ट्रांसजेनिक संवाददाताओं से कल्पना करने के लिए शामिल सेल आबादी और ऊतकों उपलब्ध हैं और eyFLP-MARCM प्रणाली के साथ जोड़ा जा सकता है। दुर्भाग्य से, आक्रामक प्रक्रिया दिनों के लिए कई घंटे, एक समय सीमा है कि जबकि अभी भी जिंदा लार्वा रखने के साथ असंगत है लेता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany 00262-0500 Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C.
Corn syrup Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany 01939
Propionic acid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany 6026.1
Cornmeal ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany 4010155063948
Malt extract CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany 728985
Soy flour Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany 1000246441010
Yeast Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany 210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany H5501 Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials Kisker Biotech, Steinfurt, Germany 789008
Vial plugs K-TK e.K., Retzstadt, Germany 1002
Drosophila fly food bottles Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 960177
Bottle plugs K-TK e.K., Retzstadt, Germany 1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany 81381 Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO  Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany D2522
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany 9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST 0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany 158127 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.)
Bovine Serum Albumin/ BSA Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany A3059 Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
Fluorescently labeled phalloidin Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes A12379, A22283, A22284 Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST.
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany 6335 DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody Kurucz et al., 2003 Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK 715-175-151 Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11295-10
Glass embryo dish (30 mm) Thermo Scientific, Schwerte, Germany E90
Tungsten needles Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 10130-20
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 26018-17
Microscope slides VWR, Darmstadt, Germany 631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) VWR, Darmstadt, Germany 631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) Thermo Scientific, Schwerte, Germany 1076371
Kimtech Science Precision Wipes Thermo Scientific, Schwerte, Germany 06-677-70
Dissecting stereomicroscope Olympus, Hamburg, Germany SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope Olympus, Hamburg, Germany SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope Olympus, Hamburg, Germany FV1000 Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany  Sanyo MIR553
Squirt bottle VWR, Darmstadt, Germany 215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer VWR, Darmstadt, Germany 15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker VWR, Darmstadt, Germany DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent VWR, Darmstadt, Germany 2302700 The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany D5758 Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15593-031
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
TURBO DNase (2 U/µl) Thermo Scientific, Schwerte, Germany AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany 10-814-010
Sodium acetate trihydrate VWR, Darmstadt, Germany 27652.232 Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol Merck, Darmstadt, Germany 109634
Ethanol Merck, Darmstadt, Germany 100983 Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 Thermo Scientific, Schwerte, Germany ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) Thermo Scientific, Schwerte, Germany 5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany 7007103
Experion Automated Electrophoresis Station Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany 7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase Thermo Scientific, Schwerte, Germany 18080044
Oligo d(T) Primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C
dNTP Mixture Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France 4030 Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany 1855195
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany 170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany HSP9601
Microseal 'B' Film Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany MSB1001
rp49 Forward primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Reverse primer Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'

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References

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<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Imaginal डिस्क ट्यूमर आदर्श: दृश्य और जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर invasiveness की मात्रा जेनेटिक मोज़ाइक का प्रयोग
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Mundorf, J., Uhlirova, M. The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (116), e54585, doi:10.3791/54585 (2016).

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