Summary
Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.
Introduction
Il cancro rappresenta uno dei gruppi più geneticamente eterogeneo di malattie, la cui incidenza e la mortalità è drammaticamente in aumento, in particolare tra gli anziani in tutto il mondo. Il cancro ha origine clonale da una cellula tumorale-inizio che sfugge meccanismi oncosoppressori intrinseca e divide fuori controllo. Il progressivo accumulo di lesioni genetiche che promuovono in cooperazione la crescita, la proliferazione e la motilità, mentre inibisce la morte e la differenziazione trasforma la crescita eccessiva benigna iniziale in un tumore altamente maligno, metastatico e mortale. È diventato evidente che, oltre ad alterazioni genetiche, progressione tumorale richiede cambiamenti nello stroma circostante e diafonia tra i tipi di tumore e multiple di cellule (ad esempio, fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) nel suo microambiente. La comprensione dei principi molecolari alla base la trasformazione maligna comprese le interazioni tumore-stroma è di grande importanza per lo sviluppo di prevenzionezione e screening precoce strategie, così come i trattamenti nuovi ed efficaci per combattere la metastasi del cancro e la resistenza ai farmaci.
La mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema interessante per la ricerca sul cancro 1-4 grazie al suo tempo di generazione veloce, notevole risparmio di segnalazione nodi tra le mosche e gli esseri umani, limitati ridondanza genetica e la ricchezza di strumenti genetici avanzati che facilitano la manipolazione di quasi ogni gene in maniera limitata temporaneamente e spazialmente. Tumori geneticamente definite di varia malignità possono essere riproducibile progettati in Drosophila introducendo GAIN- e la perdita-di-funzione mutazioni in un sottogruppo di progenitori in un tessuto di tipo altrimenti selvaggio con la tecnica MARCM 5. Lo strumento MARCM combina FLP / FRT (FLP ricombinasi / FLP Target Recognition) mediata ricombinazione mitotica 6 con FLP-out 7 e GAL4 / UAS (Upstream sequenza di attivazione) del gene bersaglio 8sistemi di espressione 9. Con questo metodo l'espressione di qualsiasi transgene UAS-based, tra cui oncogene o cDNA proteina fluorescente o ripetizioni di DNA invertite per silenziamento genico dsRNA-indotta, sarà limitato a un clone di cellule che hanno perso uno specifico locus genetico e un repressore GAL4 a causa di ricombinazione (Figura 1A). Patch clonali contrassegnati con verde fluorescente (GFP) o proteine fluorescenti rossi (ad esempio, RFP, DsRed, mCherry) può essere facilmente rintracciato durante lo sviluppo, isolato e analizzato. È importante sottolineare che il loro comportamento può essere direttamente confrontata con l'adiacente tessuti wild type. Così, domande pertinenti alla cella effetti autonome e non autonome di lesioni genetiche possono essere studiati convenientemente. Simile a mammiferi, solo cloni in cui lesioni multiple oncogeni sono combinati diventano maligne in Drosophila e ricapitolano caratteristiche chiave del cancro mammiferi. Essi overproliferate, eludere l'apoptosi, inducono l'infiammazione, diventare immortale e Invasive, in ultima analisi, uccidendo l'ospite 10-17.
Qui, descriviamo un protocollo di generare tumori clonali geneticamente definite nel tessuto oculare / antenne e il cervello di Drosophila larve con la tecnica MARCM. Il metodo si basa su un tester magazzino MARCM che esprime la FLP ricombinasi lievito sotto il controllo del enhancer senza occhi (eyFLP) 18,19. In questo modo, cloni GFP-etichettata sono generati in funzione sia epitelio colonnare peripodial e della EAD e neuroepitelio del cervello durante le fasi embrionali e larvali (Figura 1A, B e di riferimento 20). I cloni possono essere facilmente seguiti fino all'età adulta, come la EAD si sviluppa nella capsula occhio adulti, antenna e la testa mentre il neuroepitelio dà luogo a neuroblasti che producono differenziate neuroni del lobo ottiche.
Per facilitare estesa caratterizzazione molecolare, funzionale e fenotipica del tessuto mosaico, si descrivano un protocollo per la dissezione del EAD e il cervello dalla terza larve instar e delineare come elaborarli per tre diverse applicazioni: (i) la rilevazione di reporter fluorescenti transgenici e immunostaining, (ii) la quantificazione di invasività tumorale e (iii) analisi dei espressione genica cambia utilizzando una quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) o di un high-throughput sequencing mRNA (mRNA-seq) (Figura 1C).
Il protocollo immunostaining può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi proteina di interesse con un anticorpo specifico. Transgenici reporter trascrizionali fluorescenti forniscono informazioni spazio-temporale comodo e preciso sull'attività di un particolare percorso di segnalazione. reporter specifici Cell-lignaggio, invece, riflettono i cambiamenti qualitativi e quantitativi in popolazioni di cellule all'interno del tessuto del mosaico e tra tumori genotipi distinti. La quantificazione del comportamento invasivo facilita il confronto delle malignità del tumore tra il genotipoS. Infine, il protocollo che descrive la raccolta e l'elaborazione di EAD mosaico per l'isolamento di RNA è adatto sia per applicazioni a valle piccola e grande scala, come trascrizione inversa seguita da rispettivamente qRT-PCR e di tutto il genoma mRNA-Seq,. I dati qualitativi e quantitativi ottenuti da questi test forniscono nuove intuizioni sul comportamento sociale dei tumori clonali. Inoltre, producono una solida base per studi funzionali sul ruolo dei singoli geni, le reti genetiche e microambiente tumorale in diverse fasi e gli aspetti della tumorigenesi.
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Protocol
NOTA: Questo lavoro utilizza la eyFLP1; atto> y +> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, vasca-Gal80 MARCM 82B verde tester linea 11. Attraversando il tester vergini MARCM 82B verdi per i maschi di ceppi, come w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotipo produrrà progenie in cui si verifica la ricombinazione mitotica tra il diritto bracci del 3 ° cromosomi omologhi. In questo modo, i cloni mutanti omozigoti per il gene c trova distale al sito FRT82B sarà generato all'interno della EAD e neuroepitelio cervello. Questi cloni esprimeranno GFP, transgene una e dsRNA per il gene B (Figura 1A). Diverse linee tester eyFLP-marcm per ricombinazione sulla X, 2L, 2R, 3L e 3R sono stati istituiti e sono disponibili all'interno della comunità mosca.
1. Manipolazione Fly, Croci, e messa in scena
- Espandere il MARCM tester magazzino appropriato a temperatura ambiente popolando bo multiplattles allo stesso tempo. Capovolgere le adulti in bottiglie fresche ogni 2-3 giorni in modo che un numero sufficiente vergini possono essere raccolti per incroci successivi.
NOTA: Quando si raccolgono le vergini, evitare l'esposizione prolungata a CO 2 in quanto questo compromette la fecondità femminile. - A seconda della scala dell'esperimento, istituito croci mosca in fiale che utilizzano almeno 10 vergini tester marcm e 4 maschi (ad esempio, per l'imaging di giornalisti fluorescenti e di immunoistochimica) o in bottiglie con almeno 30 vergini e 10 maschi (ad esempio, per l'isolamento di RNA e la quantificazione di invasività).
- Sollevare progenie a 25 ° C sotto una lunga giornata / 8 ore ciclo luce-buio 16 ore. Capovolgere i genitori in nuovi flaconi / bottiglie ogni 24 ore per facilitare la messa in scena riproducibile di larve e per evitare il sovraffollamento.
NOTA: A partire dal giorno 6 dopo uovo posa (AEL), alla fine del terzo controllo instar alimentazione arresto larve, inizia a vagare e immettere pupariation. Al contrario, l'inizio della transizione larvale-pupa può essere delayed o inesistente nelle larve con EAD cuscinetto tumori clonali iperplastici o maligni.
2. Raccolta terza larve instar
- Per immunostaining, raccogliere circa 20 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare pinze per raccogliere delicatamente le larve dal flacone o bottiglia e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS (PBS).
- Per l'isolamento di RNA e la quantificazione di invasività, raccogliere almeno 80 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare uno spruzzatore a schizzare PBS in una bottiglia contenente larve mosca fino a coprire la superficie.
- Ammorbidire gli strati superiori di cibo con una spatola e versare il mash cibo contenente le larve in una capsula di Petri. Utilizzando pinze, prendere delicatamente larve e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS.
- Lavare le larve con PBS untIl tutto il cibo residuo viene rimosso. Ispezionare le larve con lo stereomicroscopio a fluorescenza con 8 a 16X di ingrandimento per scartare tutti "leopardo larve" che portano punti GFP-positive casuali in tutto il corpo larvale (Figura 2A, 2B e vedere Discussione Girone).
NOTA: Per l'isolamento di RNA includere una fase di lavaggio penultima nel 70% EtOH per 1 min. - Porre la capsula contenente larve selezionato in PBS in ghiaccio fino dissezione. Processo larve entro 30 minuti per evitare effetti negativi di freddo e di fame.
3. dissezione delle larve
- Per sezionare il EAD sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze per premere delicatamente la parte centrale della larva contro il fondo piatto di vetro. Con la seconda pinza, afferrare i ganci bocca larvali e tirare via dal corpo (Figura 2C).
NOTA: La forza di trazione è spesso sufficiente a rompere gli steli ottica che collega l'EAD pair ai lobi cerebrali. Se il cervello o le sue parti restano attaccati alla EAD e la loro presenza non è desiderata per ulteriori applicazioni, tagliare i gambi ottica con l'aiuto di due coppie di pinze. Per i tumori invasivi (ad esempio, ras V12 Scrib 1) la connessione tra EAD e i lobi del cervello diventa sempre più oscurate con il tempo da overgrowing e la migrazione di cellule clonali.- Per preparare il complesso EAD / cervello con un intatto cordone nervoso ventrale (VNC) (Figura 2D), utilizzare pinze per tagliare una larva al centro del corpo. Eliminare la metà posteriore.
- Tenere la metà anteriore del corpo larvale tra le punte di una pinza, capovolgere la larva dentro-fuori spingendo i ganci bocca con la punta della seconda pinza e facendo rotolare la cuticola sopra con la prima coppia pinze.
- Utilizzando pinze rimuovere con cura tutti i tessuti estranei (ad esempio, le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino), lasciando la coppia EAD oil complesso EAD / cervello collegato ai ganci bocca. Districare i ganci bocca dalla cuticola sovrastante. Liberare il VNC tagliando le proiezioni assoni che si estendono ai muscoli del corpo e dell'epidermide (figure 1B, 2C, 2D).
NOTA: I ganci bocca consentono la manipolazione sicura del tessuto con una pinza e facilitano affondamento più efficiente e facile riconoscimento del tessuto durante il lavaggio. Sezionato EAD cambiamento morfologia relativamente veloce, conservato non fissato in PBS. Limitare il tempo di dissezione per 20-30 min. - Per trasferire il tessuto, cappotto un P20 micropipetta punta pipettando corpo restante carcasse più volte su e giù. Per trasferire i complessi EAD / cervello più grande, tagliare la punta micropipetta P20 con le forbici.
NOTA: La procedura di rivestimento è fondamentale per evitare che si attacchi e la perdita di tessuto sezionato durante il trasferimento. L'uso di una micropipetta P20 minimizza il trasferimento di PBS in soluzione fissativa, diluizione limite indesiderato.- Per immunostaining, trasferirela sezionato EAD in una provetta da 0,5 ml riempito con 400 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Utilizzare 1,5 ml di tubo con 1 ml di PFA per EAD grandi / complessi cerebrali pensati per il punteggio di invasività.
ATTENZIONE: PFA è altamente tossico. Indossare guanti e indumenti protettivi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. - Per l'isolamento di RNA trasferire l'EAD sezionato in un nuovo piatto di vetro riempita con PBS freddo. Utilizzare pinze per pulire EAD dalle ghiandole linfatiche ad anello e, per ridurre al minimo le contaminazioni del campione.
- Staccare la EAD dai ganci bocca tagliando il collegamento tra i dischi antenna e bocca ganci con pinze (Figura 2E). Per evitare la degradazione dell'RNA e manufatti di espressione genica, limitare il tempo dissezione a 30 min. Passare al punto 7.
NOTA: Un ricercatore esperto può sezionare circa 60 larve in 30 min escluso il tempo necessario per la raccolta delle larve e lavaggio. Totale rendimenti RNA dipendono dalle dimensioni EAD che variano tra i genotipi e Sviluppo deiL fasi. La dissezione di 80-100 coppie controllo EAD dalla fine del III larve instar dovrebbe produrre 5-8 mg di RNA totale.
- Per immunostaining, trasferirela sezionato EAD in una provetta da 0,5 ml riempito con 400 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Utilizzare 1,5 ml di tubo con 1 ml di PFA per EAD grandi / complessi cerebrali pensati per il punteggio di invasività.
4. Fissaggio, Immunocolorazione, e di montaggio
- Fix campioni in PFA fissativo per 25 min mentre oscillante a temperatura ambiente. Il tempo di fissaggio può essere estesa fino a 60 min senza alterare la morfologia dei tessuti e la antigenicità delle proteine.
- Rimuovere i campioni fissativo e lavare con PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) tre volte per 10 minuti utilizzando un nutator. Utilizzare un volume sufficiente di PBST per ogni fase di lavaggio (400 ml tubo / 0,5 ml).
NOTA: fisso EAD complessi / cervello pensati per il punteggio di invasività non richiedono immunocolorazione. segnale GFP rimane ben visibile dopo la fissazione. Passare al punto 4.4 per la dissezione finale.- Per immunostaining, blocco tessuto in 200 ml di una soluzione bloccante (PBST con 0,3% BSA) per 20 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
- Incubare con primanticorpi ary diluiti in 100 ml di una soluzione di saturazione notte a 4 ° C mentre delicatamente agitando. Fare riferimento alla scheda tecnica primaria anticorpo o letteratura pubblicata per la diluizione degli anticorpi consigliata.
NOTA: potrebbe aver bisogno di essere ottimizzato La diluizione anticorpo primario. - Dopo cinque 10 min lavaggi in PBST, tessuti macchia con gli anticorpi secondari fluorescenti diluito in soluzione bloccante mentre delicatamente agitazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C al buio.
- Lavare i campioni per tre volte 10 min in PBST.
- Incubare con primanticorpi ary diluiti in 100 ml di una soluzione di saturazione notte a 4 ° C mentre delicatamente agitando. Fare riferimento alla scheda tecnica primaria anticorpo o letteratura pubblicata per la diluizione degli anticorpi consigliata.
- Per immunostaining, blocco tessuto in 200 ml di una soluzione bloccante (PBST con 0,3% BSA) per 20 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
- Sostituire PBST con 500 ml di soluzione DAPI-colorazione. Per etichettare F-actina, aggiungere falloidina coniugato ad un colorante fluorescente per soluzione DAPI-colorazione. Dopo 15 min nutazione al buio, lavare tessuti volta per 10 min con PBST.
NOTA: etichettatura F-actina può essere effettuata indipendentemente dalla colorazione DAPI. - Per la fase di dissezione finale, il trasferimento del tessuto di nuovo in un piatto di vetro PBS-riempita con un pi 1 mlPette. Utilizzando le due coppie di pinze clip fuori i ganci bocca.
- Separare i cervelli che verranno utilizzati per la quantificazione della invasività dal EAD tagliando il gambo ottica come EAD invaso potrebbe ostacolare l'analisi.
- Mettere una goccia di mezzo di montaggio (15 microlitri per da 22 copri oggetto x 22 mm) su un vetrino oggettivo. Con l'aiuto di pinze punte, distribuire il medium in uno strato sottile. Trasferimento EAD, cervello o complessi EAD / cervello nel mezzo di montaggio con una micropipetta P20.
- Utilizzare i suggerimenti forcipe o una bacchetta di tungsteno per la distribuzione dei tessuti e raddrizzare il VNC sulla diapositiva.
- Per evitare la formazione di bolle durante il montaggio, prima verso un bordo di un vetrino al mezzo di montaggio e poi lentamente inferiore sul montante con l'aiuto di pinze. Usare piccoli pezzi di carta da filtro o tessuto wipe per assorbire mezzo di montaggio in eccesso intorno ai bordi coprioggetto.
NOTA: DABCO / Poli (vinil alcool) 4-88 montaggio indurisce mediea 4 ° C in un'ora. Le diapositive possono essere conservati per mesi a 4 ° C.
5. confocale Imaging
- Acquisire sezioni confocale singoli e pile utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con 20X, 40X obiettivi del petrolio e 60X.
- Evitare la saturazione dei pixel. Utilizzare stessi parametri di acquisizione delle immagini, tra cui la risoluzione dell'immagine, potenza in ingresso del laser, il guadagno, offset, cornice media, una dimensione di passo di una serie Z e mantenere queste impostazioni per tutti i genotipi per consentire il confronto di intensità dei pixel tra i diversi genotipi 21,22.
NOTA: Per la visualizzazione del complesso / cervello EAD, generare il massimo proiezioni e cucire rispettivi, immagini vicine. Per la preparazione immagine finale, utilizzare posta software di elaborazione delle immagini per il montaggio del pannello e per regolare la luminosità e il contrasto.
6. Quantificazione del tumore invasività
- Definire un sistema di punteggio che caratterizzano i diversi livelli di invasivenes tumoralis considerando il modello spaziale di invasione e la quantità di cellule GFP-positive diffusione nel cervello e VNC. Preparare schede di valutazione per la documentazione (Figura 3A).
- Mount almeno 80 fissato cervelli intatti per ogni genotipo su una diapositiva con 40 ml di mezzo di montaggio per 24 millimetri x 50 mm coprioggetto.
- Per consentire di punteggio imparziale, chiedere una parte neutrale a rendere anonima le diapositive, in modo che la procedura di punteggio è imparziale. Valutare diapositive anonimi di due membri del laboratorio indipendente. Divulgare genotipi solo dopo che il conteggio è finito.
- Valutare il grado di malignità da un punteggio cieca di cervelli montati sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri GFP. Usare un pennarello per etichettare i cervelli che sono stati già visti al fine di evitare il doppio conteggio (Figura 3B).
- Calcolare la percentuale di cervelli che rientrano in ciascuna delle categorie definite invasive per genotipo. Determinare le s statisticiignificance utilizzando un test chi-quadrato (Figura 3C).
7. Isolamento RNA, trattamento DNasi, e di verifica della qualità
NOTA: tutti i reagenti (soluzioni, plasticware) utilizzato nelle seguenti fasi dovrebbe essere libero di attività RNasi. Indossare sempre guanti e utilizzare una cappa chimica per il lavoro con solventi organici.
- Trasferire il EAD pulita con un rivestimento punta P20 micropipetta in 1,5 ml tubo.
- Let sink tessuto al fondo del tubo, rimuovere con attenzione PBS e sostituirlo con 100 microlitri di reagente di lisi RNA (sufficiente per fino a 140 EAD).
- Lyse tessuto nel vortex. A questo punto, i campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C o direttamente trattati con un protocollo di isolamento di RNA standard.
NOTA: I campioni di genotipi simili da vari cicli di dissezione possono essere raggruppati in una volta RNA reagente di lisi. - Riempire il volume del campione di 0,9 ml con il reagente RNA lisi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare campioni vigoroamente per 15-20 sec.
- Dopo 2 a 3 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire incolore superiore fase acquosa contenente l'RNA in una nuova provetta senza disturbare l'interfase. Stare lontano dal interfase in quanto contiene proteine e DNA genomico.
NOTA: Il volume recuperato dovrebbe essere circa il 60% del volume di reagente RNA lisi utilizzato per omogeneizzazione. - Precipitare l'RNA aggiungendo 0,5 ml di alcool isopropilico. Vortex e incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.
- Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA, una volta con 600 ml di etanolo al 75%. Dopo un breve vortice e centrifugazione (10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C) scartare tutte etanolo e lasciare che il pellet di RNA asciugare per 5-10 min posizionare il tubo aperto su un tessuto panno pulito.
NOTA: Il pellet di RNA potrebbe essere visibile come un piccolo opaco / bianco stmaturi sul fondo del tubo o invisibile. Le gocce di etanolo rimanenti possono essere accuratamente rimosso con la punta P10 micropipetta. - Sciogliere RNA in 50 ml di acqua DEPC trattati con il vortex o passando soluzione un paio di volte attraverso un puntale.
- Per ridurre al minimo la contaminazione con il DNA genomico, il trattamento di RNA totale con DNasi con l'aggiunta di 50 ml di una miscela contenente 1 ml di DNasi (2 U / mL) e 10 ml di 10x tampone DNasi in acqua DEPC-trattata. Vortex e spin down.
- Incubare i campioni a 37 ° C in un bagno d'acqua o di un blocco di riscaldamento per 30 a 40 min. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 ml di acqua DEPC trattati in ogni campione.
- Per inattivare l'attività enzimatica e RNA pulita dal DNasi, aggiungere 200 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1), soluzione vortex per 1 min e centrifugare i campioni a 10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C.
- Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore contenente RNA in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale (200 ml)di cloroformio, mescolare e ripetere la fase di centrifugazione dall'alto.
- Raccogliere accuratamente la fase superiore e precipitare RNA aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 preparata in DEPC H 2 O e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare bene nel vortex.
NOTA: L'aggiunta di 0,5 ml di glicogeno (20 mg / mL) per un mix di precipitazione aiuta a visualizzare il pellet di RNA. Per ridurre al minimo la perdita di RNA, usare, tubi siliconate bassi vincolante 1,5 ml microcentrifuga. - Precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 ora.
NOTA: L'incubazione può essere effettuata durante la notte. I campioni possono essere collocati a -80 ° C, come pure. - Pellet RNA mediante centrifugazione a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C. Lavare e asciugare pellet seguendo la descrizione in 7.9.
- Sciogliere RNA in 10-15 ml di acqua DEPC trattati. RNA Conservare a -80 ° C.
- Determinare la quantità e la purezza di RNA misurando OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Calcola RNA concentration applicando la convenzione che 1 OD a 260 nm è pari a 40 mg / ml di RNA.
NOTA: Il rapporto A 260/280 di RNA "puro" equivale 2.0 mentre un rapporto A 260/230 dovrebbe essere nell'intervallo 2.0-2.2. Campioni di RNA con un rapporto A 260/280 tra 1,7 e 2,0 sono adatti per applicazioni a valle come la sintesi del DNA. Per la preparazione di librerie mRNA-seq la qualità e la quantità di RNA dovrebbero essere controllati mediante un sistema di elettroforesi automatizzato. Il rapporto 28S / 18S deve essere superiore a 1,8.
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Representative Results
Per dimostrare le potenzialità della tecnica eyFLP-MARCM per generare patch GFP-marcato su genotipi definiti in Drosophila EAD, sono stati indotti tre tipi di cloni: (1) il controllo che esprimono GFP solo, (2) tumori maligni che esprimono una forma oncogenica del piccolo G-proteina Ras (Ras V12) in un contesto di perdita omozigote di uno scarabocchio gene soppressore del tumore (Scrib 1) e (3) overgrowing ma non invasivo ras V12 Scrib 1 JNK DN cloni, dove chinasi della jun-N-terminale (JNK) è stato inattivato dalla espressione della sua forma dominante-negativo (Figura 4, tabella 1 per i genotipi). E 'stato dimostrato che l'invasività della ras V12 Scrib 1 tumori clonali richiede l'attivazione aberrante di segnalazione JNK e la sua trascrizione a valle fattori 10,12,23,24. Inoltre, ras V12 Scrib 1 di Drosophila, con conseguente infiltrazione di cellule immunitarie (chiamate hemocytes) nel EAD 14,25.
Per monitorare i livelli e la distribuzione spaziale delle attività di JNK all'interno del tessuto mosaico e tra i tumori di genotipi distinti, il transgenico stabilita, JNK-reattiva TRE-DsRed reporter è stato impiegato 26. La microscopia confocale della EAD sezionato, fisso e EAD / complessi del cervello ha rivelato marcata sovraregolazione dell'attività di giornalista TRE-DsRed nei tessuti recanti maligno ras V12 Scrib 1 tumori (Figura 4B). Il DsRed segnale etichettato ras V12 Scrib 1 cloni di EAD (Figura 4B), così come le cellule tumorali diffusione sopra i lobi del cervello e invadere la VNC (Figura 4E, 4F). Al contrario, il giornalista Activi TRE-DsRedTy è rimasto limitato a una serie di cellule che si estendono dal antennale alla parte dell'occhio dei dischi di controllo (Figura 4A '). Blocco di segnalazione JNK portato ad una drastica riduzione del segnale di TRE-DsRed in clonale ras V12 Scrib 1 tumori JNK DN (Figura 4C, 4D). Questi dati forniscono la prova in tal modo funzionale per un requisito di JNK segnalazione per attivare la risposta trascrizionale TRE-dipendente maligna ras V12 Scrib 1 tumori. Un hmlΔ-DsRed giornalista specifico per lignaggio, ideato per il tracciamento Drosophila hemocytes 27,28 ha mostrato un accumulo di cellule immunitarie nel tessuto recanti maligna ras V12 Scrib 1 tumori (Figura 5B). Al contrario, solo singoli hemocytes o qualche macchia hemocyte localizzati sono stati rilevati nel controllo e ras V12 Scrib 1 JNK DN mosaico EAD e tessuti cerebrali(Figura 5A, 5C). Immunocolorazione con un pan-hemocyte anticorpo anti-Hemese (H2) 29 ha confermato l'identità delle cellule immunitarie di cellule positive hmlΔ-DsRed (Figura 5D, 5E). Coerentemente con rapporti pubblicati 12,23,24, la quantificazione imparziale di invasività tumorale confermato un ruolo centrale di JNK segnalazione nel promuovere l'invasione del tumore nei lobi cerebrali adiacenti e VNC (Figura 3C). Infine, l'RNA totale è stato isolato dal EAD mosaico. I campioni sono stati sottoposti sia per qRT-PCR o analizzati su un sistema di elettroforesi automatizzato per qualità e quantità. La figura 6A mostra significativa upregulation JNK-dipendente della metalloproteinasi della matrice 1 (MMP1) trascrizione in EAD cuscinetto ras V12 Scrib 1 tumori clonali maligni, a conferma della precedenza risultati pubblicati 12,24,30,31. Valutazione di RNA totale utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzato mostrato tcappello a tre campioni di EAD indipendenti avevano un rapporto di 28S / 18S sopra 1.8 (Figura 6B). Tuttavia, EAD 2 RNA è stato parzialmente degradato, riflessa da una macchia sul gel (Figura 6C). Al contrario, EAD 3 campione aveva una bassa concentrazione. Molteplici bande di alto peso molecolare immagine del gel (Figura 6B) e piccoli picchi sul dell'elettroferogramma (Figura 6C) in poi, ha anche suggerito la contaminazione del DNA. Pertanto, solo EAD 1 campione sarebbe adatto per una preparazione di libreria mRNA-seq.
Figura 1: Schema del sistema MARCM per la generazione di mosaici genetici nel Drosophila EAD e applicazioni a valle (A) Il sistema consente MARCM generazione di patch clonali con lesioni genetiche definiti in un tipo altrimenti selvatico (eterozigote).contesto. L'espressione FLP sotto il controllo di un promotore specifico di tessuto (ad esempio, senza occhi) catalizza la ricombinazione tra i due elementi FRT fiancheggianti la cassetta di STOP contrassegnati con (y) gene giallo (atto> y +> GAL4). Alla rimozione della cassetta di STOP, il ubiquitariamente espresso Gal4 trascrizionale attivatore (ACT-GAL4) in grado di guidare l'espressione di qualsiasi transgene UAS-based come UAS-GFP (anche UAS-ras V12). In una cellula parentale, tuttavia, l'attività GAL4 è bloccato da un repressore Gal80 cui espressione è controllata da un promotore tubulina (vasca-Gal80). Nella fase G2 del ciclo cellulare, FLP media lo scambio di cromatidi non fratelli tra i cromosomi omologhi distali ai siti FRT. La segregazione dei cromosomi durante la mitosi ricombinanti darà origine a due cellule figlie, una delle quali mutante omozigote per un particolare locus genomico (ad esempio, Scrib
Figura 2: Ordinamento di larve terzo instar e esempi rappresentativi di EAD e EAD / complessi del cervello usata per diverse applicazioni a valle (AB) micrografie fluorescenti del terzo instar controllo cuscinetto larve cloni GFP-etichettata indotte con il tester eyFLP-MARCM 82B Verde.. (A) larva di controllo Rappresentante con cloni ristretti ai EAD e cervello lobi. (B) Un esempio di un "leopardo larva" portare cloni GFP-positive in vari tessuti in tutto il corpo. Immagini (C) Brightfield di sezionato EAD e complessi (D) EAD / cervello attaccato ai ganci bocca, e (E) EAD ripulite da tutti i tessuti estranei tra cui ganci bocca. Barre di scala = 2 mm (AB) e 500 micron (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Quantificazione di invasività tumorale (A) immagini confocale a fluorescenza di cervelli sezionati da ras V12 Scrib 1 larve (7 giorni AEL) rappresentano gli esempi reali di quattro diversi gradi di invasività del tumore che vanno dal non-invasiva (Punteggio 0), un lobo del cervello invaso (Nota 1), entrambi i lobi del cervello invaso (Nota 2) a una forte invasione tumorale con tessuto clonale che copre entrambi i lobi del cervello e inserendo il VNC (Nota 3). Le immagini sono proiezioni di sezioni multiple confocale ed esempi per il punteggio 2 e 3 sono cuciti da 2 x 2 immagini confocali. Barre di scala = 100 micron. (B) Un esempio di un vetrino da microscopio anonimo con il cervello fissa utilizzata per imparzialesegnando allo stereomicroscopio a fluorescenza. cervelli Segnati sono contrassegnati con una penna per impedire la registrazione duplicato. Barra di scala = 500 micron (C) Rispetto al altamente invasive ras V12 Scrib 1 tumori, l'inibizione della segnalazione di JNK (ras V12 Scrib 1 JNK DN) invasione eliminato di cellule clonali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attivazione del trascrizionale giornalista TRE-DsRed in 'V12' ras maligni 1 tumori clonali Scrib 'è JNK-dipendente (A. TRE-DsRed giornalista etichettato una stretta striscia di cellule che funzionano da antenne a occhio parte (punte di freccia). (B) L'attività del reporter TRE-DsRed è stata notevolmente migliorata in ras V12 Scrib 1 cloni GFP-positive rispetto al circostante EAD dell'epitelio non clonale. (C) inibizione dell'attività JNK ha comportato una netta riduzione dell'intensità del segnale DsRed in ras V12 Scrib 1 JNK DN cloni. (D) Ulteriori potenziamento del segnale di DsRed rivelato di attivazione non autonomo di JNK segnalazione nelle cellule che circondano i ras V12 Scrib 1 JNK DN cloni. (E) Il giorno 8 AEL, ras V12 Scrib 1 le cellule si sviluppava fuori tutta la EAD e si sviluppa su i lobi del cervello alla VNC (freccia). (F) Le cellule clonali che invadono il VNC (close-up della regione marked dalla freccia E) stati arricchiti per il segnale DsRed. (AC) Mostra proiezioni di sezioni multiple confocale, (E) è cucita da 3x3 immagini confocale e (D, F) rappresentano singola sezione. Barre di scala = 50 micron. EAD, occhio / disco antenne; BL, lobi del cervello; VNC, cordone nervoso ventrale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Specifiche Lineage HML Δ -DsRed giornalista transgenico rivela arricchimento del ras V12 Scrib 1 hemocytes associata al tumore (A) In EAD di controllo, hmlΔ-DsRed giornalista marcato hemocyte clu sters sono intrappolati nelle rientranze dell'occhio e dell'epitelio antenne. (B) del tessuto EAD e il cervello composto da ras V12 Scrib 1 tumori GFP-marcato ha mostrato un aumento del numero di ematociti concentrati sparsi in tutto il tessuto clonale. (C) Il numero di ematociti concentrati associato drasticamente diminuita su inibizione del segnale di JNK a Ras V12 Scrib 1 JNK DN mosaico tessuto. (DE) HmlΔ-DsRed hemocytes positivi sono stati anche etichettati con un H2-anticorpo che rileva il marcatore Hemese pan-hemocyte. (AC) Mostra proiezioni di sezioni confocale multipla, (A) è cucita da 2 x 2 e (BC) sono cuciti da 3 x 3 immagini confocale. (DE) rappresentano singole sezioni. Barre di scala = 100 micron (AC) e 10 micron (DE). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:.. La valutazione della quantità e qualità di RNA totale isolato da EAD sezionato (A) Un esempio rappresentativo di risultati qRT-PCR usando quattro repliche biologiche per ogni genotipo livelli di trascrizione MMP1 stati normalizzati a rp49. Fold cambiamenti nell'espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo della curva standard relativa 32. I dati sono valori medi ± SEM; *** P <0,001 usando spaiati t-test a due code di Student con varianza diseguale. (B, C) Valutazione della qualità dell'RNA totale e quantità utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzato. L'immagine del gel virtuale (B) mostra i due bande di spicco delle 18S e 28S rRNA che corrispondono ai picchi ben definiti su elettroferogrammi (C). la contaminazione del DNA e la degradazione dell'RNA si riflettono comeMear (punte di freccia) e bande extranumerary e picchi (frecce). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Fly Ceppi | Fonte / Commenti |
| eyFLP1; atto> y +> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, vasca-Gal80 | eyFLP-82B MARCM verde Tester 11 |
| w; UAS-ras V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; UAS-ras V12; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| w; hmlΔ-DsRed; FRT82B | questo studio, w; hmlΔ-DsRed da Katja Brückner 28 |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | questo studio |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | questo studio |
| w; TRE-DsRed; FRT82B | questo studio, w; TRE-DsRed da Dirk Bohmann 26 |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | questo studio |
| w; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-JNK DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | questo studio |
Tabella 1: Sintesi delle linee di Drosophila utilizzati in questo studio.
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Discussion
Le tecniche per generare mosaici genetici in Drosophila sono tra gli strumenti più sofisticati per l'analisi e la manipolazione di funzione del gene 33. Il sistema eyFLP-MARCM ha dimostrato potente e robusto quanto consente l'induzione di marcate visivamente, cloni geneticamente definiti in modo spazialmente ristretta, cioè, in tessuti dove enhancer eyeless è attivo 9,18. Ciò è particolarmente importante quando più lesioni genetiche sono combinati nelle stesse cellule. Mentre queste patch altamente aberranti consentono sviluppo larvale quando ristretta all'EAD e cerebrale neuroepiteli, possono causare letalità quando sparsi in tutto il corpo larvale come nel caso di FLP (hsFLP) cloni shock termico controllati. Significativamente, l'induzione di cloni nell'epitelio mosca EAD in cui attivato oncogeni si combinano con la perdita di soppressori tumorali ricapitola la comparsa e la progressione dei tumori epiteliali solidi in alcuni tumori umani. HoWever, il sistema ha anche i suoi limiti che saranno discussi brevemente. Dato che gli insetti hanno un sistema circolatorio aperto, non si verificano vere metastasi come osservato nei tumori umani. Pertanto il complesso processo di diffusione metastatica non può essere fedelmente modellato in Drosophila. Tuttavia, i tumori EAD, come i cloni ras V12 Scrib 1 fanno visualizzare le proprietà maligne come abbattere la membrana basale che circonda la EAD e invadono il cervello adiacente 11,12,31. Il grado di aggressività del tumore può essere quantificato e comparato tra i diversi genotipi, come descritto in questo studio. E 'anche importante notare che la presenza di lesioni genetiche specifiche in mosaico EAD potrebbe influenzare i tempi di sviluppo e la durata della crescita delle larve. Messa in scena di larve dovrà stabilire se l'analisi del tessuto mosaico verrà fatto utilizzando animali della stessa fase cronologica o di sviluppo. Esecuzione di un esperimento pilota per valutare l'impatto di unnuovo genotipo clonale EAD sui tempi di sviluppo è auspicabile.
Ci sono limitazioni tecniche pure. In primo luogo, il numero dei diversi genotipi clonali che può essere costruito con lo strumento eyFLP-MARCM è grande, ma non è infinita. Per esempio, combinando due alleli mutanti che risiedono su diversi cromosomi è ostacolato dalla scarsa efficienza di ricombinazione su entrambi i cromosomi simultaneamente, e geni localizzati sul cromosoma piccolo quarta sono generalmente inaccessibili. Silenziamento genico mediante RNAi transgenico è una soluzione alternativa. Tuttavia, è importante rendersi conto che i transgeni non sono espressi immediatamente dopo la ricombinazione mitotica - non fino a quando il repressore Gal80 è degradata. L'attività del sistema di espressione / UAS GAL4 può essere migliorata coltivando larve a 29 ° C. E ', tuttavia, importante tenere a mente che la temperatura elevata influenza diversi parametri di sviluppo, fisiologici e molecolari tra cui il tasso di crescita, i tempi di sviluppo, Metabolism e l'espressione genica 34-37. Così, sarebbero necessari adeguamenti dei protocolli previsti, come messa in scena delle larve o il numero di EAD sezionato per trascrittoma profiling.
I tester eyFLP-marcm non sono tra i ceppi più sani. Le molteplici transgeni in un compromesso genoma volare il fitness e la fecondità. Queste scorte richiedono particolare attenzione deve essere mantenuta e ampliata per grandi collezioni di femmine vergini. Come documentato in questo studio, il tester linea MARCM 82B Verde 11, anche se fattibile quando omozigote, è geneticamente instabile. Questo è evidente dalla comparsa spontanea di "leopardo larve" da visualizzare per ectopiche, cloni GFP-etichettata all'interno di vari tessuti poliploidi tra cui l'intestino, trachee, grasso corporeo, e l'epidermide larvali. Questo fenomeno si verifica in tutte attraversa indipendente genotipo paterna. Si presume che le patch GFP ectopiche derivano dalla incontrollata, ricombinazione stocastica tra i due FRSiti T nella cassetta FLP-out, causando la rimozione del marcatore + giallo e il "STOP cassetta". Nei tessuti poliploidi, la tubulina promotore-driven Gal80 repressore potrebbe essere insufficiente a bloccare l'attività GAL4. La presenza di cellule geneticamente modificate in tessuti diversi dal EAD e cervello potrebbe suscitare segnali sistemici che potrebbero influenzare il comportamento dei cloni sperimentali. Questi "leopardo larve" dovrebbe quindi essere escluso dalle analisi. Inoltre, abbiamo quotidianamente ristabilire il tester MARCM 82B verde da singoli incroci maschio-femmina.
Nonostante le insidie di cui sopra, le applicazioni del sistema eyFLP-MARCM per studiare le funzioni del gene e le interazioni tra i tumori clonali e il loro ambiente sono molteplici. Introduzione dei sistemi di espressione / binario UAS-indipendente GAL4 quali Lexa / LexOp 38 o droga QF controllabile / QUAS / QS 39,40 fornirebbe un buon controllo su transgene expression e / o l'etichettatura simultanea e la manipolazione di diverse popolazioni di cellule, tra cui clonali, le cellule epiteliali non clonali e hemocytes. Tali tessuti mosaico potrebbero essere ancora una volta trattati secondo i protocolli descritti qui.
Il metodo per la dissezione di mosaico EAD e EAD complessi / cervello dalla terza larve instar (sezione relativa al protocollo 3) può essere applicato ai primi stadi di sviluppo pure. È importante sottolineare che il protocollo per i complessi EAD / cervello permetta il recupero dell'ala, haltere e gambe dischi immaginali. Nel caso questi siano utilizzati per l'isolamento di RNA (sezioni Protocollo 3.3.2 e 7), il disco di interesse deve essere pulito dal tessuto estraneo e trattati in modo simile a divisione EAD. Data la loro dimensione più piccola, il numero di dischi haltere e gambe raccolti dovrebbe essere aumentato per acquisire sufficiente quantità di RNA.
Il protocollo per l'estrazione di RNA totale da EAD (sezione Protocol 7) si riferiscono al RNA reagente di lisi disponibili da diversi v commercialeendors (vedi elenco dei materiali / attrezzature). Il successo complessivo della procedura dipende principalmente: (i) con numero sufficiente di larve, (ii) essere veloce e preciso durante la dissezione, e (iii) tenere i campioni privi di RNasi. Mantenere lo spazio e gli strumenti di lavoro pulito, indossando guanti, usando il software e le soluzioni in plastica priva di RNasi, e mantenendo i campioni in ghiaccio tutto Ridurre la degradazione dell'RNA. Per evitare la contaminazione di RNA con qualsiasi DNA genomico che potrebbero non essere completamente rimosso dal trattamento DNasi (sezione Protocol 7.11), è fondamentale per evitare interfase momento del ritiro della fase acquosa per la prima volta (sezione Protocol 7.6). Sia la contaminazione del DNA e la degradazione dell'RNA può essere rivelato eseguendo campioni su un sistema di elettroforesi automatica (Figura 6B, 6C). Il protocollo isolamento di RNA ha una più ampia applicazione. E 'stato usato con successo per l'estrazione di RNA da tutta larve in diversi stadi di sviluppo, da adulti, e variorgani larvali. L'RNA ottenuto era adatto sia per qRT-PCR e genome-wide analisi del trascrittoma da mRNA-Seq 20,24,41,42. Rispetto al qRT-PCR che quantifica decine di mRNA selezionati al massimo, imparziale mRNA sequenziamento consente analisi di espressione in tutto il genoma. Così, si può confrontare interi firme trascrittoma di tumori indotti da lesioni genetiche specifiche nelle fasi distinte di tumorigenesi 24. È importante tenere presente che l'RNA viene dai interi dischi, in modo che i risultati non riflettono soltanto cambiamenti nei cloni ma anche nel tessuto non-clonale circostante. Esecuzione di cellule fluorescenti attivare l'ordinamento (FACS) su dissociato EAD mosaico adattando protocolli disponibili 43,44 potrebbe essere applicato per determinare firma trascrizionale di specifiche popolazioni cellulari, ad esempio, clonale (GFP +) e non-clonale (GFP -) cellule.
Il protocollo fissazione e immunocolorazione qui descritto è adatto per simulvisualizzazione tanea di proteine di interesse con gli anticorpi e l'attività di reporter transgenici specifici. Sia la marcatura cellule clonali e DsRed fluorescenza prodotta da una delle due reporter transgenici utilizzati in questo studio segnale GFP sono conservati in tutta fissazione e immunostaining e può essere visualizzata direttamente mediante microscopia confocale. Tuttavia, gli anticorpi contro le proteine fluorescenti possono amplificare l'intensità del segnale. Analogamente, l'uso di un anticorpo anti-β-galattosidasi faciliterà rilevamento di reporter transgenici basato sul gene lacZ batterica. Attività di giornalista relativi possono essere valutati misurando le intensità dei pixel relativi dei cloni rispetto a non-clonale dei tessuti utilizzando il software di analisi di immagine (ad esempio, Figi, ImageJ). Quando si confrontano le attività giornalista tra i diversi genotipi clonali, le impostazioni di acquisizione delle immagini devono essere mantenuti costanti (sezione Protocollo 5 e riferimenti 21,22). Anche se il protocollo funziona bene con molti diversi unntibodies, potrebbe essere necessario per ottimizzare le concentrazioni di anticorpi consigliati. Alterazioni potrebbero anche essere richieste per tempo di fissazione, il tipo e la concentrazione di detersivo (Triton X-100, Tween-20, saponina) e fissativo (8% PFA, 4% di formaldeide, EtOH).
A differenza dei protocolli discussi sopra, quantificazione di invasività tumore è limitato al terzo stadio stadio larvale e il complesso EAD / cervello. Tuttavia, la sua logica complessiva può applicare a qualsiasi studi quantitativi dove pregiudizio cognitivo deve essere evitato. Il metodo richiede completezza. Come tumore malignità incrementi del tempo, è essenziale per confrontare le larve della stessa età (ad esempio, 7 o 8 giorni dopo la deposizione delle uova). Con il tempo un tumore clonale può invadere in maniera massiccia, ma le cellule tumorali possono rimanere all'interno della EAD. Il passo in cui cervelli sono separate dal EAD (sezione relativa al protocollo 4.4.1) è quindi fondamentale per evitare la conta invasività falsi-positivi. Montaggio del cervello con l'EAD allegato sarà Flatten i tessuti, provocando la EAD invaso per coprire le strutture cerebrali e prevenire qualsiasi quantificazione così. Idealmente, si vorrebbe catturare il processo invasivo direttamente nella larva di vita. giornalisti transgeniche di visualizzare le popolazioni cellulari coinvolte e tessuti sono disponibili e possono essere combinati con il sistema eyFLP-MARCM. Purtroppo, il processo invasivo richiede diverse ore o giorni, un lasso di tempo che non è compatibile con il mantenimento delle larve vivo mentre ancora.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
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