Summary
Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.
Introduction
Kanser insidans ve mortalite önemli ölçüde dünya çapında, özellikle yaşlılarda, artan hastalıkların en genetik olarak heterojen bir grup, birini temsil eder. Kanser doğasında tümör baskılayıcı mekanizmalarını kaçar ve kontrol dışı bölen bir tümör başlatan hücre klonal kaynaklanır. ölüm ve farklılaşmasını inhibe ederken işbirliği büyüme, çoğalma ve motilitesini teşvik genetik lezyonların kademeli birikimi yüksek, malign metastatik ve ölümcül tümör içine ilk selim üremesine dönüştürür. Bu genetik değişikliklerin yanı sıra, tümör ilerlemesi olan mikro-tümör ve çok sayıda hücre türleri (örneğin, fibroblastlar, immün ve endotel hücreleri) arasındaki çevre stroma ve çapraz-karışma değişiklik gerektiren belirgin hale gelmiştir. tümör stroma etkileşimleri de dahil olmak üzere malign transformasyon altında yatan moleküler ilkelerinin anlaşılması PREVEN geliştirmek için büyük önem taşıyoryon ve erken tarama stratejilerinin yanı sıra, yeni ve etkili tedavi, kanser metastazı ve ilaç direncine karşı koymak.
Meyve sineği Drosophila Melanogaster'in onun hızlı nesil zaman nedeniyle kanser araştırmaları 1-4 için çekici bir sistem haline gelmiştir sinekler ve insanlarda, hemen hemen herhangi bir genin işlenmesini kolaylaştıran gelişmiş genetik araçları sınırlı genetik yedekleme ve zenginlik arasındaki düğümleri sinyal olağanüstü koruma bir geçici ve mekansal kısıtlı bir şekilde. Değişen malignite genetik olarak tanımlanmış tümörler tekrarlanabilir MARCM tekniği 5 kullanan bir başka vahşi tip dokusunda progenitörlerin bir alt kümesi gain- ve zarar-fonksiyon mutasyonlar tanıtarak Drosophila tasarlanmış olabilir. MARCM aracı FLP / FRT (FLP rekombinaz / FLP Tanıma Hedef) FLP-out 7 ve Gal4 / UAS (yukarı aktivasyon dizisi) 8 hedef geni ile mitoz rekombinasyon 6 aracılı birleştiririfade sistemleri 9. dsRNA'nın indüklenen gen susturma onkogen ya da floresan proteini cDNA ya ters çevrilmiş DNA Tekrarlar dahil olmak üzere herhangi UAS göre transgenin bu yöntem ifade ile, spesifik bir genetik yeri ve rekombinasyon nedeniyle bir GAL4 represörü kaybetmiş bir hücre klonu ile sınırlı olacak (Şekil 1A). Klon yamalar yeşil floresan (GFP) veya kırmızı floresan proteinleri ile işaretlenmiş (örneğin, RFP, DsRed, mCherry) kolayca geliştirme, izole ve analiz boyunca izlenebilir. Önemli olarak, onların davranışları doğrudan bitişik vahşi tip dokuya karşılaştırılabilir. Böylece, sorular genetik lezyonların özerk ve özerk olmayan etkiler rahatlıkla ele alınabilir hücreye formüller verilmiştir. Memelilere benzer şekilde, sadece klonları olan çoklu onkojenik lezyonlar Drosophila malign olmak ve memeli kanser kilit işaretlerinden özetlemek kombine edilir. Onlar, apoptoz kaçmasına enflamasyon neden, ölümsüz ve InvAn haline overproliferatesive, sonuçta ev sahibi 10-17 öldürme.
Burada, bir protokol MARCM tekniği kullanılarak Drosophila larvalarının göz / anten ve beyin dokusunda genetik olarak tanımlanmış klonal tümörler oluşturmak için tarif etmektedir. Yöntem, eyeless arttırıcı (eyFLP) 18,19 kontrolü altında maya FLP yeniden bağlayıcı ifade eden bir MARCM test hisse senetleri dayanır. Bu şekilde, GFP etiketli klonlar peripodial ve kolumnar EAD epiteli ve embriyonik ve larva aşamaları (Şekil 1A, B ve referans 20) boyunca beynin neuroepithelium hem de oluşturulur. neuroepithelium farklılaştırılmış optik lob nöronlar üreten neuroblasts doğurmaktadır EAD yetişkin göz, anten ve baş kapsül içine geliştikçe klonlar kolayca yetişkinliğe kadar takip edilebilir.
Biz de mozaik doku geniş, moleküler fonksiyonel ve fenotipik karakterizasyonu kolaylaştırmak içinçubuk üçüncü instar larvaları EAD ve beyin diseksiyon için bir protokol ve üç farklı uygulamalar için işleme nasıl özetlemektedir: (i) transgenik flüoresan muhabir ve immün saptanması, tümör yayılımı ve (iii) analizi, (ii) ölçümü gen ekspresyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) veya yüksek verimli bir mRNA sıralaması (mRNA DİZİ) (Şekil 1C) ile değiştirir.
immün protokolü spesifik bir antikor ile çıkar proteini görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Transgenik floresan transkripsiyonel gazetecilere belirli bir sinyal yolunun aktivitesi üzerine uygun ve kesin uzaysal bilgi sağlar. Hücre soyu, belirli muhabir, diğer taraftan, mozaik doku içinde ve farklı genotipler tümörleri arasında hücre popülasyonlarının niteliksel ve niceliksel değişiklikler göstermektedir. invaziv davranış miktarının belirlenmesi genotipi arasındaki tümör malignite karşılaştırılmasını kolaylaştırırs. Son olarak, RNA izolasyonu için mozaik EAD toplanması ve işlenmesi tarif protokolü, sırasıyla QRT-PCR ve genom mRNA SEQ, ardından ters transkripsiyon hem küçük hem de büyük ölçekli alt uygulama için uygundur. Bu analizler sonucu elde edilen nitel ve nicel veriler klonal tümörlerin sosyal davranış içine yeni bakış açıları sağlayacaktır. Ayrıca, bireysel genler, genetik ağları ve farklı aşamalarında tümör mikro ve tümörogenez yönleriyle rolü üzerine fonksiyonel çalışmalar için sağlam bir temel oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu çalışma eyFLP1 kullanır; hareket> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, küvet-GAL80 MARCM 82B Yeşil test hattı 11. Böyle w suşların erkeklere MARCM 82B Yeşil test bakireler Geçiş; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotip mitotik rekombinasyon 3. homolog kromozomların doğru kolları arasında oluşacak olan soy verecektir. Bu şekilde, FRT82B sitesine uzak bulunan gen c klonlar homozigot mutant EAD ve beyin neuroepithelium içinde oluşturulur. Bu klonlar gen b (Şekil 1A) için GFP, transgen a ve dsRNA'larını ifade edecektir. X, 2L, 2R, 3L ve 3R üzerinde rekombinasyon için çeşitli eyFLP-MARCM test hatları kurulmuş ve sinek toplum içinde mevcuttur edilmiştir.
1. Fly Taşıma, Haçlar ve Evreleme
- Birden fazla bo doldurmamak oda sıcaklığında uygun MARCM test stok genişletmekAynı zamanda ttles. Bu yeterli bakireler sonraki haçlar için toplanan böylece her 2-3 günde bir taze şişeler içine yetişkin çevirin.
NOT: bakireleri toplarken, bu kadın doğurganlığını uzlaşma olarak CO 2 için uzun süreli maruz kalmasını önlemek. - Deney ölçeğine bağlı olarak, en az 10 MARCM test bakire ve (örneğin, floresan gazetecilere ve immün görüntülenmesi için) ya da en az 30 bakireler ve 10 erkek (örneğin, için olan şişelerde 4 erkek kullanarak şişeleri sinek haçlar kurmak RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü).
- Uzun bir günün 16 saat / 8 saat ışık-karanlık döngüsü altında 25 ° C'de soy kaldırın. larvaların tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak ve aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeler / şişelere her 24 saat anne çevirin.
NOT: yumurtlama (AEL) gün sonra 6 başlayarak, geç üçüncü evre kontrol larvaları durdurma besleme, dolaşıp başlatmak ve pupariation girin. Buna karşılık, larva-pupa geçiş başlangıcı de olabilirkoydu veya EAD hiperplastik veya habis klonal tümörleri taşıyan ile larva varolmayan.
2. Üçüncü dönem larva Toplama
- immün için, yaklaşık 20 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. hafifçe şişe ya da viyal larvaları almak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir embriyo cam tabak içine aktarmak için forseps kullanır.
- RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü için, en az 80 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. Yüzey kaplıdır kadar larvaları içeren bir sinek şişeye PBS fışkırtma bir bücür şişe kullanın.
- Bir spatula ile yiyeceklerin üst katmanlarını yumuşatır ve bir Petri kabı içine larvaları içeren gıda püre dökün. Forseps kullanarak, hafifçe larvaları almak ve PBS ile dolu bir embriyo cam tabak içine aktarabilirsiniz.
- PBS UNT ile larvaları yıkayınIL artıklarını yiyecek kaynağı kaldırılır. Larva vücuda rasgele GFP pozitif noktalar (Şekil 2A, 2B ve görmek Tartışma Bölüm) taşıyan tüm "leopar larvaları" atmak için 16X büyütme 8 ile floresan stereomicroscope altında larvaları inceleyin.
Not: RNA izolasyonu için 1 dakika için% 70 EtOH içinde sondan bir önceki yıkama aşamasını içerir. - diseksiyon kadar buz üzerinde PBS seçilen larvaları içeren çanak yerleştirin. 30 dakika içinde süreç larva soğuk ve açlık olumsuz etkilerini önlemek için.
Larva 3. diseksiyonu
- Bir stereomikroskop altında EAD incelemek için, yavaşça cam çanak alt karşı larva orta kısmı basın forseps bir çift kullanın. İkinci forseps ile larva ağız kanca kapmak ve vücuttan (Şekil 2C) onları çekin.
NOT: çekme kuvveti EAD pai bağlayan optik saplarını kırmak için çoğu zaman yeterlidirBeyin lobları r. Beyin veya parçaları EAD bağlı kalmak ve mevcudiyeti uygulamalar için arzu edilen ise, forseps iki çift bir yardımıyla optik sapları kesti. (Örneğin, ras V12 Scrib 1) EAD ve beyin lobları arasındaki bağlantı giderek overgrowing ve klonal hücrelerin göçmen zamanla gizlenmiş olur invaziv tümörlerde.- Bozulmamış bir ventral sinir kablosu (VNC) (Şekil 2B) ile EAD / beyin kompleksini hazırlamak için, vücudun ortasında bir larva kesmek için forseps kullanabilir. arka yarısını atın.
- Bir forseps uçları arasındaki larva vücudunun ön yarısını tutun ikinci forseps ucu ile ağız kanca iterek ve ilk forseps çifti ile üzerine manikür yuvarlayarak larva içten dışa çevirin.
- Dikkatle EAD çifti bırakarak tüm yabancı dokuları (örn, tükürük bezleri, yağ vücut ve gut) kaldırmak veya forseps kullanmaağız kanca bağlı EAD / beyin kompleksi. üstteki manikür ağız kanca disentangle. Vücut kaslarının ve epidermis (Şekil 1B, 2C, 2D) kadar uzanan aksonal projeksiyonları kesilmesinin VNC ücretsiz.
NOT: Ağız kancalar forseps ile doku güvenli manipülasyon için izin ve yıkama sırasında dokuda daha verimli batan ve kolay tanınmasını kolaylaştırmak. PBS içinde sabitlenmemiş tutulduğunda nispeten hızlı EAD değişim morfolojisi disseke. 20-30 dk diseksiyon zamanı sınırlayın. - doku aktarmak için, kat kalan vücudu pipetleme bir P20 mikropipet ucu yukarı ve aşağı birkaç kez nakli. Büyük EAD / beyin kompleksleri aktarmak için, makasla P20 mikropipet ucu kesilmiş.
Not: kaplama işlemi, aktarım sırasında yapışmasını ve çıkartılan doku kaybını önlemek için önemlidir. Bir P20 mikropipet kullanımı istenmeyen sınırlayıcı seyreltme, fiksatif çözelti içine PBS transferini en aza indirir.- immün için transfer400 ul% 4 paraformaldehit (PFA) sabitleyici ile dolu bir 0.5 ml'lik bir tüp içine EAD kesilir. Daha büyük EAD için 1 ml PFA 1.5 ml tüp kullanın / beyin kompleksleri invazivliğinin puanlama için geliyordu.
DİKKAT: PFA son derece toksiktir. Koruyucu eldiven ve giysiler giyin. cilt, göz veya mukoza ile temasından kaçının. - RNA izolasyonu için, soğuk PBS ile dolu yeni bir cam tabak içine parçalara EAD aktarın. Örnek kirliliklerinin en aza indirmek için, halka ve lenf bezlerinden EAD temizlemek için forseps kullanabilir.
- Forseps (Şekil 2E) kullanılarak anten diskler ve ağız kanca arasındaki bağlantıyı kesilmesinin ağız kancaları EAD ayırın. RNA bozulmasını ve gen sentezleme bozulmaları önlemek için, 30 dakika için diseksiyon zaman sınırı. 7. adıma geçin.
NOT: Deneyimli bir araştırmacı larva toplama ve yıkama için gerekli 30 dakika hariç zaman içinde yaklaşık 60 larva incelemek olabilir. Toplam RNA verim genotipleri ve developmentà arasında değişir EAD büyüklüğüne bağlıdırl aşamaları. geç üçüncü evre larvaları 80-100 kontrol EAD çiftlerinin Diseksiyon 5-8 ug toplam RNA boyun eğmek zorundadır.
- immün için transfer400 ul% 4 paraformaldehit (PFA) sabitleyici ile dolu bir 0.5 ml'lik bir tüp içine EAD kesilir. Daha büyük EAD için 1 ml PFA 1.5 ml tüp kullanın / beyin kompleksleri invazivliğinin puanlama için geliyordu.
4. Sabitleme, immün ve Montaj
- Oda sıcaklığında nutating ise 25 dakika süreyle PFA fiksatif örnekleri sabitleyin. sabitleme süresi doku morfolojisi ve proteinlerin antijenitesini değiştirmeden 60 dakikaya kadar uzatılabilir.
- Nutator kullanılarak 10 dakika boyunca üç kez (% 0.1 Triton X-100 içeren PBS) PBST ile tespit edici ve yıkama örnek alabilir. Her yıkama adımı (400 ul / 0.5 ml tüp) için PBST yeterli hacmi kullanın.
NOT: Sabit EAD / beyin kompleksleri immün gerekmez invazivliğinin puanlama için geliyordu. GFP sinyali tespit sonrasında iyice görünür kalır. Nihai diseksiyon için 4.4 adıma geçin.- immün, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 20 dakika boyunca (% 0,3 BSA ile PBST) bir bloke edici çözeltisi 200 ul blok dokusu.
- prim ile inkübehafifçe çalkalayarak li antikorlar, 4 ° C'de bir gece boyunca bir blokaj çözeltisinin 100 ul seyreltilmiş. Önerilen antikor seyreltme için birincil antikor veri sayfası veya yayınlanmış literatüre bakın.
NOT: Primer antikor seyreltme optimize edilmesi gerekebilir. - yavaşça karanlıkta 4 ° C de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalanarak ya da PBST içinde beş ila 10 dakika yıkama sonrasında, floresan ikincil antikorlarla leke doku çözüm engelleme seyreltilmiştir.
- Yıkama numuneleri üç kez PBST içinde 10 dakika.
- prim ile inkübehafifçe çalkalayarak li antikorlar, 4 ° C'de bir gece boyunca bir blokaj çözeltisinin 100 ul seyreltilmiş. Önerilen antikor seyreltme için birincil antikor veri sayfası veya yayınlanmış literatüre bakın.
- immün, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 20 dakika boyunca (% 0,3 BSA ile PBST) bir bloke edici çözeltisi 200 ul blok dokusu.
- DAPI-boyama çözeltisi 500 ul PBST değiştirin. F-aktin etiketlemek için, DAPI lekelemesi çözeltisine floresan boya konjuge Phalloidin ekleyin. Karanlıkta 15 dakika nutation sonra PBST ile 10 dakika boyunca bir kez doku yıkayın.
Not: F-aktin etiketleme DAPI lekelemesi bağımsız yapılabilir. - Nihai diseksiyon adım için, 1 ml pi kullanarak PBS dolu cam tabak içine geri doku transferiPette. ağız kanca off klibi forseps iki çift kullanma.
- analizi engel olabilecek büyümüş EAD olarak optik sap keserek EAD gelen invazivlik ölçümü için kullanılacak beyinleri ayırın.
- objektif sürgü üzerine monte edilen orta bir damla (22 mm x 22 mm'lik bir örtücü cam için 15 ul) yerleştirin. forseps ipuçları sayesinde, ince bir tabaka halinde orta dağıtın. Bir P20 mikropipet ile montaj ortama EAD, beyin veya EAD / beyin kompleksleri aktarın.
- doku dağıtmak ve slayt VNC düzeltmek için forseps ipuçları veya tungsten çubuk kullanın.
- Montaj sırasında kabarcık, ilk tarama bir montaj ortamına lamel kenarı ve forseps yardımıyla monte ortamı üzerine yavaşça düşük oluşumunu önlemek için. lamel kenarlarında aşırı montaj orta emmek için silme filtre kağıdı ya da doku küçük parçalar kullanın.
Not: DABCO / Poli (vinil alkol) 4-88 montaj orta sertleşirbir saat içinde, 4 ° C'de. Slaytlar, 4 ° C 'de ay depolanabilir.
5. Konfokal Görüntüleme
- 20X, 40X ve 60X petrol hedefleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanılarak tek konfokal bölümleri ve yığınlarını edinin.
- piksel doygunluk önlemek. Ofset görüntü çözünürlüğü, lazer giriş gücü, kazanç, çerçeve ortalama alma, z-serisi bir adım boyutu dahil, aynı görüntü elde etme parametrelerini kullanın ve farklı genotipleri 21,22 arasında piksel yoğunluğunun karşılaştırmalar için izin tüm genotiplerde bu ayarları korumak.
NOT: EAD / beyin kompleksinin görselleştirme için maksimum projeksiyonlar üretmek ve ilgili komşu görüntüleri dikiş. Son görüntü hazırlanması için, panel montajı için yazılan görüntü işleme yazılımı kullanmak ve parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için.
Tümör yayılmasını 6. sayısallaştırılması
- Tümör invasivenes farklı düzeylerde karakterize edecek bir puanlama sistemi tanımlamakistilası uzamsal desen ve beyin ve VNC yayılmasını GFP pozitif hücrelerin miktarı göz önüne alındığında bu. Belgeler (Şekil 3A) için değerlendirme sayfaları hazırlayın.
- Montaj en az 80, 24 mm x 50 mm'lik bir örtücü cam başına montaj orta 40 ul kullanılarak bir slayt her genotip için sağlam beyin sabit.
- tarafsız puanlama izin vermek için, puanlama prosedürü tarafsız böylece, slaytlar anonim bir nötr bir parti istiyoruz. bağımsız iki laboratuvar üyeleri tarafından anonim slaytlar değerlendirin. sayma bittikten sonra genotipleri ifşa.
- GFP filtre seti ile donatılmış bir floresan stereomikroskopta altına monte beyinleri kör skorlama ile malignite derecesi değerlendirin. Zaten çift sayımı (Şekil 3B) önlemek için incelendi var beyinleri etiketlemek için bir işaretleyici kullanın.
- genotip başına tanımlanan invaziv kategorilerin her düşen beyinleri yüzdesini hesaplayın. İstatistiksel s belirleyinignificance bir ki-kare testi (Şekil 3C) kullanarak.
7. RNA İzolasyon, DNaz Tedavi ve Kalite Kontrol
Not: Aşağıdaki adımlarda kullanılan tüm reaktifler (çözeltiler, plasticware) RNaz etkinliğinin arındırılmış olmalıdır. Her zaman eldiven giyin ve organik çözücüler ile çalışmak için bir kimyasal kaputu kullanın.
- 1.5 ml tüp içine kaplanmış P20 mikropipet ucu ile temiz EAD aktarın.
- tüpün dibine doku lavabo edelim, dikkatlice PBS kaldırmak ve 100 ul RNA parçalama reaktifi (en fazla 140 EAD için yeterli) ile değiştirin.
- vorteks Lyse doku. Bu noktada, örnekleri, sıvı nitrojen içinde dondurulur, derin ve -80 ° C'de saklandı veya doğrudan standart RNA izolasyon protokolü ile işlenmiş olabilir.
NOT: Birden fazla diseksiyon mermi benzer genotiplerin örnekleri RNA parçalama reaktifi kez toplanmış olabilir. - RNA parçalama reaktifi ile 0.9 ml örnek hacmi doldurun. kloroform 0,2 ml ilave edilir ve Vigoro örnekleri karıştırın15-20 saniye usly.
- Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübasyondan sonra, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj örnekleri.
- interfaz bozmadan yeni bir tüp içine renksiz üst sulu faz içeren RNA aktarın. proteinleri ve genomik DNA içerdiği uzak interfaz uzak durun.
Not: geri kazanılan birim homojenizasyon için kullanılan RNA liziz reaktifi hacminin yaklaşık% 60 olması gerekmektedir. - izopropil alkol, 0.5 ml ilave edilerek RNA hızlandırabilir. Vorteks ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri.
- Süpernatantı atın ve% 75 etanol 600 ul kez RNA pelet yıkayın. Kısa bir girdap ve santrifüj (4 ° C'de 7 dakika boyunca 10,000 x) Sonuçta etanol atmak ve 5-10 dk temiz bir kağıt mendille silin açık tüp yerleştirmek için RNA pelet hava kurumaya bırakın.
NOT: RNA pelet küçük opak beyaz / st olarak görünür olabilirtüp veya görünmez dibinde olgun. Kalan etanol damla dikkatle P10 mikropipet ucu ile temizlenebilir. - bir pipet ucu ile bir kaç kez vorteks ya geçirilmesiyle DEPC ile muamele edilmiş su 50 ul RNA çözülür.
- genomik DNA ile kirlenmesini en aza indirmek için, DNase 1 ul (2 U / ml) ve DEPC ile muamele edilmiş su içinde 10 x DNaz tamponu 10 ul ihtiva eden bir karışım, 50 ul ekleyerek DNaz ile total RNA tedavi. Vortex ve aşağı doğru döndürün.
- bir su banyosu ya da 30 ila 40 dakika için bir ısıtma bloğu içinde 37 ° C'de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir numune içine DEPC ile muamele edilmiş su, 100 ul ilave edin.
- DNaz gelen enzimatik aktivitesi ve temiz RNA inaktive fenol 200 ul için: 4 ° C'de 7 dakika boyunca 10,000 x g'de 1 dakika santrifüj için numune çözeltisi, girdap kloroform: izoamil alkol (1: 25: 24).
- Dikkatle yeni bir tüp içine RNA içeren üst sulu faz transfer. eşit hacim ekleme (200 ul)kloroform, mix ve yukarıdan santrifüj adımı tekrarlayın.
- Dikkatli bir şekilde, üst fazı toplayın ve 3 M sodyum asetat ve 1/10 hacimde eklenmesiyle RNA çökeltilmesi, pH 5.2% 100 etanol DEPC H2O ve 2.5 hacim hazırlandı. vorteks ile iyice karıştırın.
NOT: Bir yağış karışımı 0.5 ul glikojen (20 mg / ml) ekleme RNA pelet görselleştirmek için yardımcı olur. silikonlu düşük bağlayıcı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, RNA kaybı en aza indirmek. - en az 1 saat boyunca -20 ° C'de RNA hızlandırabilir.
Not: inkübasyon gece boyunca sürdürülür. Örnekler hem -80 ° C 'de yerleştirilebilir. - 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile pelet RNA. Yıkayın ve 7.9 açıklamasında şu kuru pelet.
- DEPC ile muamele edilmiş su 10-15 ul RNA eritin. -80 ° C'de saklayın RNA.
- 230 nm, 260 nm ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm'de OD ölçümü ile RNA miktarı ve saflık belirler. RNA co hesaplayınkongre uygulayarak ncentration 40 ug / ml RNA eşit nm 260 1 OD söyledi.
Not: A 260/230 oranı 2.0-2.2 aralığı içinde olması gerekirken "saf" RNA nın bir 260/280 oranı 2.0 eşittir. 1.7 ve 2.0 arasında bir bir 260/280 oranı RNA örnekleri örneğin cDNA sentezi alt uygulamalar için uygundur. mRNA DİZİ kütüphanelerinin hazırlanması için RNA niteliği ve miktarı, otomatik bir elektroforez sistemi kullanılarak kontrol edilmelidir. 28S / 18S oranı 1.8 üzerinde olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila EAD tanımlanan genotiplerin GFP işaretlenmiş yamalar oluşturmak için eyFLP-MARCM tekniğin potansiyel göstermek için, klon üç tip indüklenmiştir: Sadece (1) kontrol GFP ifade, (2) habis tümörler, küçük bir onkojenik biçimi eksprese bir tümör baskılayıcı geni Scribbles'ın homozigot kaybı (Scrib 1) 'in bir arka G-proteini Ras (RAS V12), ve (3) büyümeye devam fakat non-invazif ras V12 Scrib 1 JNK DN klonlar Jun-N-terminal kinaz (JNK), kendi negatif dominant formun, (Şekil 4, genotip için Tablo 1) ekspresyonu ile inaktive edilmiştir. Ras V12 Scrib 1 klonal tümörlerin invaziv JNK sinyalizasyon anormal aktivasyonunu gerektirir ve aşağı transkripsiyon 10,12,23,24 faktörleri olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, ras V12 Scrib 1 14,25 içine bağışıklık hücrelerinin (denilen hemocytes) infiltre sonuçlanan Drosophila larva güçlü bir inflamatuar yanıtı teşvik.
Düzeyleri ve mozaik doku içinde JNK aktivitesinin mekansal dağılımı ve farklı genotiplerin tümörleri arasında izlemek için kurulan transgenik, JNK duyarlı TRE-DsRed muhabiri 26 kullanılmıştır. Parçalara sabit EAD EAD Konfokal mikroskopi / beyin kompleksleri malign ras V12 Scrib 1 tümörleri (Şekil 4B) taşıyan dokularda TRE-DsRed raportör etkinliğinin belirgin bir şekilde düzenlenmesi saptandı. DsRed sinyali etiketli RAS V12 Scrib beyin loblar yayılan ve VNC (Şekil 4E, 4F) işgal EAD (Şekil 4B) ve tümör hücrelerinde 1 klon. Bunun aksine, TRE-DsRed raportör Activity kontrol diskleri (Şekil 4A ') göz kısmına anten uzanan hücrelerin bir dizi sınırlı kalmıştır. JNK sinyal bloke klonal ras V12 Scrib 1 JNK DN tümörleri (Şekil 4c, 4d) TRE-DsRed sinyalinin dramatik bir azalma ile sonuçlanmıştır. Bu veriler, bu şekilde kötü huylu ras V12 Scrib 1 tümörlerde TRE bağımlı kopyalanma yanıtı aktive etmek için sinyal JNK gereği fonksiyonel kanıt sağlar. Drosophila izlemek için tasarlanmış bir seri spesifik hmlΔ-DsRed raportör, 27,28 malign ras V12 Scrib 1 tümörler (Şekil 5B) taşıyan dokularda immün hücrelerin birikimi görüldü Hemocytes. Buna karşılık, sadece tek tek hemocytes ya da birkaç lokalize hemocyte yamalar kontrolü ve RAS V12 Scrib 1 JNK DN mozaik EAD ve beyin dokularında tespit edilmiştir(Şekil 5a, 5c). Bir pan-hemocyte anti-Hemese antikor ile immün (H2) 29 hmlΔ-DsRed pozitif hücrelerin (Şekil 5D, 5E) bağışıklık hücre kimliğini doğruladı. Yayınlanan raporlar 12,23,24 uyumlu olarak, tümör yayılımı tarafsız miktar bitişik beyin lob ve VNC (Şekil 3C), tümör invazyonu teşvik sinyal JNK merkezi bir rol doğrulanmıştır. Son olarak, toplam RNA, mozaik EAD izole edilmiştir. Numuneler kalite ve miktar için otomatik elektroforez sistemi üzerinde Mah-PCR ya tabi ya analiz edildi. Şekil 6A matriks metalloproteinaz önemli JNK bağımlı yükselişini göstermektedir 1 (MMP1) EAD önce teyit malign ras V12 Scrib 1 klonal tümörleri taşıyan transkript yayınlanan bulgular 12,24,30,31. otomatik bir elektroforez sistemi kullanılarak total RNA'nın değerlendirilmesi T gösterdiHat üç bağımsız EAD örnekler 1.8 (Şekil 6B) üstünde bir 28S / 18S oranında vardı. Ancak, EAD 2 RNA jel (Şekil 6C) bir smear yansıyan, kısmen bozulmuş oldu. Bunun aksine, EAD 3 örnek düşük bir konsantrasyonuna sahip olmuştur. Elektroforegramda (Şekil 6C) üzerinde jel görüntü (Şekil 6B) ve küçük tepe daha yüksek moleküler ağırlığa sahip çoklu şeritler, aynı zamanda DNA kontaminasyonu önerdi. Bu nedenle, sadece EAD 1 örnek mRNA DİZİ kütüphanenin hazırlanması için uygun olacaktır.
Şekil 1: Drosophila EAD ve alt uygulamalarda genetik mozaik üretimi için MARCM sisteminin Şemalar (A) MARCM sistemi bir başka vahşi tip tanımlanan genetik lezyonlar klonal yamaların üretilmesini sağlar (heterozigot).bağlam. Bir doku-spesifik promoter (ör eyeless) kontrolü altında FLP sentezleme DUR kasetini her iki yanındaki iki FRT rekombinasyon elemanları arasındaki san bir (y) geni (hareket> Y +> Gal4) ile işaretli olan katalize eder. DUR kaset çıkarılmasından sonra, yayg gibi UAS-GFP (aynı zamanda UAS-ras V12) gibi herhangi bir UAS-tabanlı transgen ifadesini sürebilirsin Gal4 transkripsiyonel aktivatör (hareket-Gal4) dile getirdi. Bir ebeveyn hücrede ise, Gal4 etkinliği olan ifade bir tübülin promotör (küvet-GAL80) tarafından kontrol edilir bir GAL80 bastırıcı tarafından engellenir. hücre döngüsünün G2 fazında, FLP FRT sitelerine uzak homolog kromozomlar arasındaki olmayan kardeş kromozomlardalerde değişimini aracılık eder. Mitoz sırasında yeniden birleştirici kromozom ayrımı iki yavru hücrelerin belirli bir genomik için bir olmak homozigoz mutant yol (örneğin, Scrib
Şekil 2: üçüncü instar larvaları ve EAD EAD temsili örneklerinin ayırma / beyin kompleksleri, çeşitli akım uygulamaları için kullanılan eyFLP-MARCM 82B yeşil test cihazı ile indüklenen üçüncü instar larvaları yatağı kontrol GFP etiketli klonun (AB) Floresan mikroskop.. EAD ve beyin lobları ile sınırlı klonları ile (A) Temsilcisi kontrol larva. (B) vücudun çeşitli dokularında GFP pozitif klonlar taşıyan bir "pars larva" bir örnek. Ağız kanca dahil olmak üzere tüm harici dokulardan temizlenir kesilir EAD ve ağız kanca takılı (D) EAD / beyin kompleksleri, ve (E) EAD (C) aydınlık ve görüntüler. Ölçek çubukları = 2 mm (AB), 500 um (CE).fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Tümör invazivliğinin miktarının belirlenmesi (A) beyinleri Floresan konfokal görüntüleri (7 gün AEL) (0 Puan) non-invaziv arasında değişen tümör invazivlik dört farklı sınıflarda gerçek örneklerini temsil ras V12 Scrib 1 larva disseke, işgal bir beyin lobu (1 Puan), klonal doku hem beyin lobları kapsayan ve VNC girerek güçlü bir tümör işgali işgal hem beyin lobları (2 puan) (3 puan). Görüntüler Score 2 için birden konfokal bölümleri ve örnekler projeksiyonları ve 3 2 x 2 konfokal görüntüleri dikilir. Ölçek çubukları = 100 mikron. (B) tarafsız kullanılan sabit beyinleri ile bir anonim mikroskop lamı bir örnekflöresanlı bir stereomikroskop altında puanlama. Attı beyinler yinelenen kayıt önlemek için bir kalem ile işaretlenir. Oldukça invaziv ras V12 Scrib 1 tümörler, JNK sinyal inhibisyonu (ras V12 Scrib 1 JNK DN) klonal hücrelerin ortadan işgali ile karşılaştırıldığında Ölçek çubuğu = 500 mikron (C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Scrib '1 klonal tümörlerin habis ras' V12 'transkripsiyonel TRE-DsRed muhabiri aktivasyonu JNK bağlıdır (A. TRE-DsRed muhabiri göz kısmı (ok başları) anten uzanan hücrelerin dar bir şerit etiketli. (B) TRE-DsRed muhabiri aktivitesi belirgin 1 GFP pozitif klonlar çevreleyen olmayan klonal EAD epiteline göre ras V12 Scrib içinde geliştirilmiştir. JNK aktivitesinin (C) inhibisyonu, ras V12 Scrib 1 JNK DN klonlar DsRed sinyal yoğunluğu net bir düşme ile sonuçlanmıştır. (D) DsRed sinyalinin kalitesinin daha da iyileştirilmesi ras V12 Scrib 1 JNK DN klonlar çevreleyen hücrelerde sinyal JNK özerk olmayan aktivasyon saptandı. Gün 8 AEL, ras V12 Scrib On (E) 1 hücreleri tüm EAD ve VNC (ok) beyin lobları yayılmış overgrew. (F) bölge m VNC (yakın çekim işgal klonal hücrelerE okla arked) DsRed sinyali için zenginleştirilmiştir. Birden fazla konfokal bölümlerin (AC) göster projeksiyonları, (E) 3x3 konfokal görüntüleri dikişli ve (D, F) tek bölüm temsil etmektedir. Ölçek çubukları 50 mikron =. EAD, göz / antennal disk; BL, beyin lobu; VNC, ventral sinir kordonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Köken özgü HML Δ -DsRed transjenik muhabir ras V12 Scrib zenginleştirme 1 tümörle ilişkili hemocytes ortaya Kontrollerde (A) EAD olarak hmlΔ-DsRed raporter etiketli hemocyte CLU sters göz ve antennal epitelyum çentikler içinde sıkışıp kalırlar. (B) ras V12 Scrib oluşan EAD ve beyin dokusu 1 GFP işaretli tümörler tüm klonal doku üzerinde dağınık hemocytes sayısında artma saptanmıştır. (C) ilişkili hemocytes sayısı önemli ölçüde ras V12 Scrib 1 JNK DN mozaik doku JNK sinyalizasyon inhibisyonu üzerine düşmüştür. (DE) HmlΔ-DsRed pozitif hemocytes pan-hemocyte markör Hemese tespit H2 antikor ile etiketlenmiştir. (AC) 2 x 2 ve (BC) dikişli birden çok konfokal bölmelerin (A) göster çıkıntılar 3 x 3 konfokal görüntülerden dikilir. (DE) tek bölümleri temsil eder. Ölçek çubukları = 100 mikron (AC) ve 10 mikron (DE). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:.. Miktar ve parçalara EAD izole edilmiş toplam RNA'nın kalitesinin değerlendirilmesi (A) her genotip MMP1 transkript seviyeleri dört biyolojik nümuneyle QRT-PCR sonuçları temsili bir örneği, rp49 normalize edilmiştir. Gen ekspresyonu katlayın, relatif standart eğri yöntemi 32 kullanılarak hesaplandı. Veri sem ± ortalama değerlerdir; *** Eşitsiz varyans ile Öğrenci unpaired iki kuyruklu t-testi kullanılarak p <0.001. Otomatik elektroforez sistemi kullanılarak total RNA kalite ve miktar (B, C) Değerlendirme. Sanal jel görüntüsü (B) elektroferogramlarda üzerinde iyi tanımlanmış zirveleri (C) karşılık 18S ve 28S rRNA iki tanınmış bantları gösterir. DNA kontaminasyonu ve RNA bozulması olarak yansıtılmaktadırmear (ok başları) ve extranumerary bantları ve zirveler (oklar). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Fly Suşlar | Kaynak / Yorumlar |
| eyFLP1; hareket> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, küvet-GAL80 | eyFLP-MARCM 82B Yeşil Tester 11 |
| W; UAS-ras V12; FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| W; UAS-ras V12; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | 12 |
| W; hmlΔ-DsRed; FRT82B | Bu çalışmada, w; Katja Brückner 28'den hmlΔ-DsRed |
| w; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | bu çalışma |
| W; UAS-ras V12 hmlΔ-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | bu çalışma |
| W; TRE-DsRed; FRT82B | Bu çalışmada, w; Dirk Bohmann 26'dan TRE-DsRed |
| W; UAS-ras V12 TRE-DsRed; FRT82B Scrib 1 / TM6B | bu çalışma |
| W; UAS-ras V12 TRE-DsRed; UAS-jnk DN FRT82B Scrib 1 / TM6B | bu çalışma |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Drosophila hatları özeti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikler Drosophila genetik mozaikler analiz ve gen fonksiyonu 33 işlemek için en gelişmiş araçlar arasında yer almaktadır oluşturmak için. O gözsüz arttırıcı aktif 9,18 olan dokularda, yani mekansal kısıtlı bir şekilde görsel olarak işaretlenmiş, genetik olarak tanımlanmış klonların indüksiyon izin verdiği eyFLP-MARCM sistemi güçlü ve sağlam olduğunu kanıtlamıştır. Birden çok genetik lezyonlar aynı hücrelerde birleştirilir, bu özellikle önemlidir. EAD ve beyin neuroepithelia sınırlı olduğunda, bu son derece olarak anormal yamalar larva gelişimi izin da ısı şok kontrollü FLP (hsFLP) klonları durumunda olduğu gibi larva vücut dağılmış olduğunda, ölümcül neden olabilir. Anlamlı, sinek EAD epitel klonların indüksiyon hangi onkogenler, tümör bastırma maddelerinin kaybı ile birleşerek bazı insan kanserlerinde ortaya çıkması ve katı epitelyal tümörlerin ilerlemesini özetlediği aktif. HoWever, sistem aynı zamanda kısaca ele alınacaktır sınırlamaları vardır. böcekler açık dolaşım sistemine sahip olduğu göz önüne alındığında, insan kanserlerinde gözlenen gerçek metastazları meydana gelmez. Bu nedenle, metastatik yayılım karmaşık bir süreç sadakatle Drosophila model olamaz. Bununla birlikte, bu tür ras V12 Scrib 1 klonlar olarak EAD tümörler EAD çevreleyen bazal membran yıkmak ve komşu beyin 11,12,31 işgal malign özelliklerini görüntülemek yapmak. Tümör saldırganlık derecesi sayısal ve bu çalışmada açıklandığı gibi farklı genotipleri arasında mukayese edilebilir. Mozaik EAD belirli genetik lezyonların varlığı gelişimsel zamanlaması ve larva büyüme süresini etkileyebilecek dikkat etmek de önemlidir. larva Evreleme mozaik doku analizi aynı kronolojik ya da gelişimsel aşamada hayvanlara kullanılarak yapılacaktır belirleyecektir. bir pilot deneyi yapan bir etkisini değerlendirmek içingelişimsel zamanlama yeni EAD klonal genotip arzu edilir.
teknik sınırlamalar da vardır. İlk olarak, eyFLP-MARCM aracıyla inşa edilebilir farklı klonal genotip sayısı büyük ama sonsuz değildir. Örneğin, farklı kromozomlar üzerinde bulunan birleştiren iki mutant allel aynı anda her iki kromozom üzerinde rekombinasyon düşük verimlilik tarafından engellendiği ve küçük dördüncü kromozomda bulunan genler genellikle erişilemez olduğunu. Transgenik RNAi kullanarak demonte Gen alternatif bir çözümdür. GAL80 bastırıcı düşer kadar değil - Ancak, transgenler hemen mitoz rekombinasyon üzerine ifade olmadığını anlamak önemlidir. GAL4 / UAS sentezleme sisteminin aktivitesi 29 ° C'de artan larvaları ile zenginleştirilebilir. Yüksek sıcaklık büyüme oranı, gelişim zamanlama, Metaboli dahil olmak üzere çeşitli gelişimsel, fizyolojik ve moleküler parametreler etkilediğini unutmayın, ancak, önemli olansm ve gen ifadesi 34-37. Bu durumda, bu larva evreleme ya transcriptome profili kullanılarak incelenmiştir EAD sayısı olarak sağlanan protokollere uyarlamalar gerekli olabilir.
eyFLP-MARCM test sağlıklı suşları arasında değildir. bir genom uzlaşma birden transgenlerin fitness ve doğurganlığı sinek. Bu hisse senetleri muhafaza ve bakire kadın büyük koleksiyonları için genişletilmiş ekstra dikkat gerektirir. Uygulanabilir olsa da, bu çalışmada, MARCM 82B yeşil test hattı 11, belgelendiği gibi, genetik olarak stabil olduğu zaman homozigot. Bu bağırsak, trakea, vücut yağ ve larva epidermis dahil olmak üzere çeşitli polyploid dokularda ektopik GFP-etiketli klonları görüntüler "leopar larvalarının" kendiliğinden görünüşünden açıktır. Tüm baba genotip bağımsız haçlar Bu olgu ortaya çıkar. Biz ektopik GFP yamaları iki FR arasındaki kontrolsüz, stokastik rekombinasyon sonucu olduğunu tahminSarı + işareti ve "DUR kaset" kaldırılmasını neden FLP-out kaset T siteleri. Poliploid dokularda, Tubulin promotör-tahrikli GAL80 represör GAL4 aktivitesinin engellemek için yeterli olabilir. EAD ve beyin dışındaki dokularda genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin varlığı deney klonlarının davranışını etkileyebilecek sistemik sinyalleri ortaya olabilir. Bunlar "leopar larva", bu nedenle analiz dışında tutulmalıdır. Ayrıca, rutin yeniden tesis tek erkek-dişi haçlar MARCM 82B Yeşil tester.
Yukarıda belirtilen tuzaklara rağmen, gen fonksiyonlarını incelemek için eyFLP-MARCM sistemi uygulamaları ve klonal tümörler ve çevreleri arasındaki etkileşimler çok çeşitlidir. Böyle LexA olarak Gal4 / UAS bağımsız ikili ifade sistemlerinin Tanıtım / LexOp 38 veya ilaç kontrol QF / Quas / QS 39,40 transgen exp üzerinde ince bir denetim sağlayacakdışarı yansıması ve / veya eş zamanlı etiketleme ve klonal olmayan klonal epitel hücreleri ve hemocytes dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarının manipülasyon. Bu gibi mozaik dokular yine burada tarif edilen usullere uygun olarak işlenebilir.
üçüncü instar larvaları (Protokol bölümü 3) için EAD mozaik EAD / beyin komplekslerinin diseksiyon için yöntemi de daha önce gelişim aşamalarında uygulanabilir. Önemlisi, EAD / beyin kompleksleri için protokol kanat, haltere ve bacak hayali diskler kurtarma izin verir. Bu RNA izolasyonu (Protokol bölümleri 3.3.2 ve 7), ilgilenilen disk, harici dokulardan temizlenir ve EAD benzer işleme tabi tutulmalıdır için kullanılmalıdır. daha küçük boyutu göz önüne alındığında, elde haltere ve bacak disklerin sayısı yeterli miktarda RNA elde etmek için artırılmalıdır.
EAD (Protokol Bölüm 7) toplam RNA'nın ekstre edilmesi için protokol, farklı ticari v temin edilebilen RNA liziz reaktifi dayanırendors (Malzeme / Ekipman Listesi bakınız). Işlemin genel başarısı büyük ölçüde bağlıdır: (i) larva yeterli sayıda olması, (ii) Anatomi, ve (iii) RNases ücretsiz numune tutarken hızlı ve hassas olmak. Temiz çalışma alanı ve araçların tutulması RNaz içermeyen plastik eşya ve çözümlerini kullanarak, eldiven giyme ve buz örnekleri tutmak tüm RNA bozulmasını azaltır. Tamamen DNAz muamelesini (Protokol bölümü 7.11) ile ayrılmıştır olabilir bir genomik DNA ile RNA kirlenmesini önlemek için, ilk olarak (Protokol Bölüm 7.6) sulu faz toplarken interfaz önlemek için önemlidir. Hem DNA kontaminasyonu ve RNA bozulması otomatik elektroforez sistemi (Şekil 6B, 6C) üzerinde örnekleri çalıştırarak ortaya çıkabilmektedir. RNA izolasyonu protokolü daha geniş bir uygulama alanına sahiptir. Başarıyla RNA farklı gelişim aşamalarında bütün larvaları ekstraksiyon, yetişkin ve çeşitli kullanılmaktadırlarva organlar. Elde edilen RNA QRT-PCR ve mRNA DİZİ 20,24,41,42 ile genom transcriptome analizi hem de uygundur. En seçilen mRNA onlarca rakamlarla Mah-PCR ile karşılaştırıldığında, tarafsız mRNA sıralama genom ifade analizleri verir. Böylece, bir tümörigenezinin 24 farklı aşamalarında belirli genetik lezyonlar neden olan tümörlerin tüm transcriptome imzalarını karşılaştırabilirsiniz. Sonuçlar sadece klonlar değil, aynı zamanda çevredeki olmayan klonal dokuda değişiklikleri yansıtmak olmaz ki, RNA tüm diskler gelen akılda tutmak önemlidir. Hücreler - Mevcut protokolleri uyarlayarak ayrışmış mozaik EAD floresan etkinleştirmek hücre sıralama (FACS) gerçekleştirme 43,44 özel hücresel popülasyonlar, örneğin, klonal (GFP +) ve non-klonal (GFP) transkripsiyonel imza belirlemek için uygulanabilir.
Burada tarif edilen tespit ve immün protokol Simul için uygundurözel antikorlar ve transjenik muhabir aktivitesi ile ilgi konusu olan proteinlerin spontan görselleştirme. Bu çalışmada kullanılan iki transgenik gazetecilere herhangi biri tarafından üretilen klonal hücreleri ve DsRed floresan işaretleme GFP sinyali Hem fiksasyon ve immün boyunca korunur ve doğrudan konfokal mikroskobu ile görülebilir. Ancak, floresan proteinleri karşı antikorlar sinyal yoğunluğu yükseltmek olabilir. Benzer şekilde bir anti-β-galaktosidaz antikorun kullanımı bakteriyel lacZ geni göre transjenik muhabir algılama kolaylaştıracaktır. Bağıl muhabir faaliyetleri olmayan klonal doku kullanarak görüntü analiz yazılımı (örneğin, Fiji, ImageJ) karşı klonların göreceli piksel yoğunlukları ölçerek değerlendirilebilir. Farklı klonal genotipleri arasında raportör aktivitesini karşılaştırırken, görüntü alma ayarları sabit (Protokol bölüm 5 ve referanslar 21,22) tutulmalıdır. protokol birçok farklı a ile iyi çalışır rağmenntibodies, önerilen antikor konsantrasyonları optimize etmek için gerekli olabilir. Değişiklikler, aynı zamanda sabitleme süresi, tip ve deterjan (Triton X-100, Tween-20, Saponin) ve sabitleyici (% 8 PFA,% 4 formaldehit, EtOH) konsantrasyonunda gerekli olabilir.
Yukarıda ele alındığı protokoller aksine, tümör yayılımı ölçümü üçüncü instar larvaları ve EAD / beyin kompleksi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, genel gerekçesi bilişsel önyargı kaçınılması gereken herhangi bir nicel çalışmalara uygulayabilirsiniz. yöntem, titizlik gerektirir. Zaman içinde tümör kanser arttıkça, aynı yaştaki larvaları karşılaştırmak için esastır (örneğin, yumurtlama sonrasında 7 veya 8 gün). Zamanla bir klonal tümör kitlesel büyümek olabilir, ancak tümör hücreleri EAD içinde kalabilir. beyinleri EAD (Protokol bölüm 4.4.1) ayrılır aşamasının, yanlış pozitif invaziv sayımları engellemek için kritik öneme sahiptir. Ekli EAD ile beyinleri montajı Flatt olacakdokuların tr, beyin yapılarını kapsayan ve böylece herhangi bir ölçümü önlemek için büyümüş EAD neden olur. İdeal olarak, bir yaşam larva doğrudan invaziv sürecini yakalamak istiyoruz. Transgenik muhabirler dahil hücre popülasyonları ve dokular mevcuttur ve eyFLP-MARCM sistemi ile kombine edilebilir görselleştirmek için. Ne yazık ki, invaziv işlem gün birkaç saat, süre hala hayatta larvaları tutmak ile uyumlu olmayan bir zaman çerçevesi alır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
- Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
- Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
- Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
- Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
- Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
- Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
- Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
- Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
- Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).
