Artículo de método

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

DOI:

10.3791/54641

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4 de noviembre de 2016

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

En este artículo

Resumen

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Se presenta un protocolo mediante el uso de células activadas por fluorescencia para aislar las células dendríticas plasmacitoides (PDC) con alta pureza a partir de la médula ósea de ratones propensos al lupus para los estudios funcionales de PDC.

Resumen

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La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es una técnica para purificar poblaciones celulares específicas basadas en fenotipos detectados por citometría de flujo. Este método permite a los investigadores comprender mejor las características de una sola población celular sin la influencia de otras células. En comparación con otros métodos de enriquecimiento celular, como la clasificación de células activadas magnéticamente (MCS), FACS es más flexible y preciso para la separación celular debido a la capacidad de detección de fenotipos por citometría de flujo. Además, FACS suele ser capaz de separar varias poblaciones celulares simultáneamente, lo que mejora la eficiencia y la diversidad de los experimentos. Aunque FACS tiene algunas limitaciones, se ha utilizado ampliamente para purificar células para estudios funcionales tanto en entornos in vitro como in vivo. Aquí presentamos un protocolo que utiliza la clasificación celular activada por fluorescencia para aislar una población muy rara de células inmunitarias, células dendríticas plasmocitoides (pDC), con alta pureza de la médula ósea de ratones propensos al lupus para estudios funcionales in vitro de pDC.

Introducción

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La separación eficiente de una población celular de elección de otras células permite estudios de la población que de otra manera no serían posibles. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un método para enriquecer una población celular interesante con alta pureza. 1,2 Los diferentes tipos de células generalmente expresan moléculas únicas, o una combinación única de varias moléculas, en la membrana plasmática que pueden distinguir una población celular de otra. Al unirse estas moléculas de la superficie celular mediante anticuerpos específicos conjugados con fluorescencia, una máquina de detección llamada citómetro/clasificador de flujo es capaz de excitar y detectar las señales de luz de diferentes tintes fluorescentes que representan diferentes marcadores de moléculas en las células a nivel de una sola célula. La información combinada que consiste en la presencia de una señal de luz (que representa la expresión positiva de la molécula de superficie correspondiente) o la ausencia de una señal de luz (que representa la expresión negativa de una molécula) define el fenotipo de la célula. Después de pasar por el detector, las células con el mismo fenotipo de interés se desvían hacia un tubo colector designado en función de la carga eléctrica.

FACS se aplica ampliamente en varios estudios siempre que la población a enriquecer esté marcada con fluorescencia. 3-7 Se ha utilizado para separar las bacterias recubiertas de inmunoglobulina (Ig)A de las bacterias no recubiertas de IgA en la microbiota intestinal 8 y clasificar las poblaciones de células modificadas genéticamente que expresan proteínas fluorescentes. 9 Es importante destacar que tiene la capacidad de separar más de una población simultáneamente, lo que no solo ahorra tiempo y reactivos, sino que también permite diseños de estudio más sofisticados. 10 Sin embargo, el FACS también tiene sus limitaciones. Si una población de interés es muy rara (menos del 1%), la eficiencia de clasificación puede reducirse, causando una pérdida significativa de células. Además, la unión de algunos anticuerpos puede activar la transducción de señales intracelulares que induce cambios funcionales en la población de células clasificadas. 11 Por lo tanto, el fenotipo utilizado para la clasificación debe seleccionarse cuidadosamente.

Existen otros métodos además de FACS que también se basan en marcadores de superficie celular para el enriquecimiento de poblaciones celulares específicas, como la clasificación celular activada magnéticamente (MCS). 12 Al igual que el FACS, los anticuerpos conjugados con perlas magnéticas pueden dirigirse a moléculas específicas de la superficie celular. Tras la interacción anticuerpo-antígeno, las células recubiertas de perlas magnéticas pueden separarse de las células no recubiertas después de pasar a través de un campo magnético. Sin embargo, solo se puede apuntar a un número limitado de moléculas en MCS, ya que las perlas magnéticas son, a diferencia de varios colores fluorescentes en FACS, indistinguibles. Por lo tanto, es difícil para la SQM definir un fenotipo celular con una combinación complicada de marcadores de superficie. 13,14 Además, la SQM también es capaz de provocar la activación no intencionada de las células diana.

En nuestros estudios de un modelo de ratón de lupus eritematoso sistémico (LES),15 nos propusimos purificar las células dendríticas plasmocitoides (pDC) para investigar sus cambios funcionales con la progresión de la enfermedad. Primero utilizamos MCS para enriquecer pDC de la médula ósea dirigiéndome a PDCA-1, una molécula que se expresa de manera alta y única en pDC murina en estado estacionario. 16 Sin embargo, la pureza celular fue inesperadamente baja, probablemente debido a la regulación positiva de PDCA-1 en otras poblaciones celulares en un entorno inflamatorio como el LES. 16 En última instancia, hemos utilizado FACS con una combinación de cuatro marcadores de superficie (CD11c, CD11b, B220 y PDCA-1) para separar la población de pDC de alta pureza como CD11c + CD11b-B220 + PDCA-1+. Murine pDC tiene otro marcador de superficie específico, Siglec-H. Decidimos no utilizar Siglec-H, ya que la unión de anticuerpos a esta molécula reprime la función de la pDC para producir IFNα. 11

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Protocolo

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NOTA: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) ratones propensos al lupus fueron criados y mantenidos en una instalación libre de patógenos específicos según los requisitos de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) en Número de Virginia Tech (Animal Aseguramiento de Bienestar: A3208-01). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo IACUC protocolo # 12-062.

1. Cultivo Celular Medio y ordenación de búfer

  1. Preparar medio de cultivo celular completo (C10) usando RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, piruvato de sodio 1 mM, 1% 100 MEM aminoácidos no esenciales, HEPES 10 mM, 55 mM 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Preparar tampón de clasificación (HBSS-completo) usando 1X solución de salina equilibrada de Hank (HBSS) suplementado con HEPES 10 mM, 2,5 mg / ml de albúmina de suero bovino,0,05 mM MgCl 2 y 0,2 U / ml de DNasa I.

2. Disección del ratón

  1. Preparar dos platos de diámetro de 6 cm que contenían 4 ml C10. Colocar las cápsulas en el hielo.
  2. La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2.
  3. Se recoge el bazo y guardarlo en un plato con C10 en hielo.
    1. Pin el ratón hacia abajo con el vientre hacia arriba en la placa de disección. Esterilizar el cuerpo por pulverización de 70% de etanol.
    2. Cortar la piel y separar la piel de la pared muscular debajo a lo largo de la línea media ventral desde la sínfisis púbica hasta el cuello.
    3. Cortar la piel a lo largo de la extremidad posterior de la primera incisión en el tobillo.
    4. Pin de la piel de la espalda en los lados y cortar la pared muscular a lo largo de los lados del primer lugar de la incisión al diafragma.
    5. Pin de la pared del músculo de la espalda en el lado derecho de la cabeza.
    6. Busque el bazo en el lado derecho del ratón debajo del intestino delgado y al lado del estómago. Recoger a un extremo de THe bazo y separarlo del estómago.
  4. Cortar ambas extremidades traseras a cabo, incluyendo fémur y la tibia, y eliminar todos los músculos tanto como sea posible.
    1. Cortar los músculos a lo largo de la extremidad posterior de la articulación de la pelvis / cadera hasta el tobillo con una tijera afilada, tratando de evitar los vasos sanguíneos.
    2. Se separa la extremidad posterior a cabo cortando en la articulación de la pelvis / cadera y la articulación del tobillo / pie sin la exposición de los contenidos de la médula ósea.
    3. restantes músculos limpias en los huesos por el rascado con una hoja de afeitar en varias ocasiones y cortar los músculos en los puntos de conjuntos.
  5. Mantener los huesos en una placa de 6 cm que contiene 4 ml C10 en el hielo. Proceder a la disección de la próxima ratón.

3. El aislamiento de esplenocitos

  1. Homogeneizar el bazo suavemente con un émbolo de la jeringa contra un filtro de células de 70 micras en la parte superior del plato que contiene 4 ml C10 hasta que no piezas rojas son visibles.
  2. Añadir adicional C10 6 ml en el plato a través del filtro unand a continuación, transferir la suspensión total de células 10 ml a un tubo cónico de 15 ml.
  3. Centrifugar el tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  4. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis 1 x de glóbulos rojos (RBC). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Después de la incubación, se centrifuga el tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  6. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml C10. Desechar los grumos grandes (células muertas) y mantener el tubo en hielo para más tarde.
    NOTA: Si hay muchos pequeños grumos, utilizar un filtro de células de 70 micras para filtrar la suspensión celular una vez.
  7. Contar el número de células con azul de tripano usando un contador de células automatizado.

Aislamiento de células de médula ósea 4.

  1. La transferencia de los huesos con 4 ml de C10 en un mortero y añadir 6 ml C10 para hacer un volumen de 10 ml en C10 total.
  2. Romper los huesos suavemente en el mortero mediante el uso apEstle.
  3. Agitar suavemente con la mano del mortero para liberar la médula ósea en C10.
  4. La transferencia de los C10 de 10 ml que contienen la médula ósea en un tubo cónico de 50 ml en hielo a través de un filtro de células de 70 micras. Añadir C10 10 ml fresco en el mortero que contiene todavía los huesos.
    NOTA: Pipetear la solución que contiene la médula ósea hacia arriba y abajo varias veces antes de pasar a través del filtro si aparecen grumos rojos son visibles.
  5. Repita los pasos 4.2 a 4.4 veces. Después del último lavado, los huesos deben aparecer blanco.
  6. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C. Mientras tanto, preparar 5 ml de medio de gradiente de densidad lista para su uso en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
  7. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml C10.
  8. capa lentamente la suspensión 10 ml de células en la parte superior del medio de gradiente de densidad de 5 ml, manteniendo interfaz clara entre las dos fases. Centrifugar a continuación el tubo cónico de 15 ml a 1.363 g durante 30 min aRT (20 ° C) con el conjunto de aceleración y desaceleración 9 establece como 0 (u OFF de freno).
  9. Después de la centrifugación, eliminar la solución de la parte superior 8 ml cuidadosamente y recoger la capa leucocitaria 2 ml en la interfaz (una capa de células mononucleares) en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
  10. Añadir C10 12 ml de hielo frío a los 15 ml tubo cónico que contienen células mononucleares de médula ósea, tapa e invierta varias veces para mezclar bien y centrifugar el tubo a 800 xg durante 10 min, 4 ° C.

5. celular tinción de la superficie de FACS

  1. tinción de las muestras
    1. Preparar CD16 / 32 solución de anticuerpo anti-ratón (dilución 1 a 100 en HBSS-completo, 5 mg / ml de concentración final).
    2. Después de la centrifugación en la etapa 4.10, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en solución de anticuerpo 100 l anti-ratón CD16 / 32 para bloquear los receptores Fc en las células mononucleares. Incubar en hielo durante 10 min.
    3. Preparar la mezcla de anticuerpos de fluorescencia de conjugado (hormigadilución i-ratón CD11c-PE 1:40, anti-ratón de dilución CD11b-APC-CY7 1:80, anti-ratón de dilución PDCA-1-FITC 1:40 y anti-ratón B220-V500 dilución 1:40 en HBSS completa según lo recomendado por el fabricante en un volumen final de 100 l por muestra).
      NOTA: Es importante para titular anticuerpos antes de su uso.
    4. Después de 10 min de incubación en el paso 5.1.2, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo y se centrifuga a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para eliminar el no unido anti-ratón CD16 / 32.
    5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 mezcla de anticuerpos de fluorescencia conjugado l. Incubar en hielo durante 15 min en la oscuridad.
    6. Después de 15 min de incubación, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo y se centrifuga a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para eliminar los anticuerpos de fluorescencia conjugado no unidos.
    7. Preparar la solución de carga FACS (500 ng / ml DAPI en HBSS-completo).
    8. Después de la centrifugación en el paso 5.1.6, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 μ; L FACS solución de carga. Transferir la suspensión celular en un 12 x 75 mm de tubo de fondo redondo (tubo FACS) y mantener el tubo en hielo en la oscuridad hasta la clasificación dentro de 1 hr.
  2. La tinción para la compensación
    1. Etiqueta de 6 tubos de FACS como PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI o sin teñir. Esplenocitos alícuotas de células de 1 x 10 6 / tubo en los tubos de FACS, y se lava con 4 ml de HBSS de su capacidad a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
      NOTA: colorante fluorescente, DAPI, Uso de unión al ADN para distinguir las células vivas de las células muertas. DAPI puede pasar a través de la membrana plasmática de las células muertas (pero no de células vivas) y el ADN cromosómico se unen.
    2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 100 l HBSS-completo.
    3. En cada tubo de FACS correspondiente, añadir uno de los siguientes anticuerpos: anti-ratón de dilución CD19-PE 1:40, anti-ratón de dilución CD11b-APC-CY7 1:80, anti-ratón de dilución PDCA-1-FITC o 1:40 B220-V500 anti-ratón dilución 1:40 según lo recomendado por el manufacturer. Deje el 5º (DAPI) y 6º (sin teñir) FACS tubos, ya que son. Mezclar bien por agitación e incubar todos los tubos de FACS en hielo en la oscuridad durante 15 min.
    4. Después de la incubación, añadir 4 ml de hielo frío HBSS-completo en cada tubo y centrifugar los tubos de FACS a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
    5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 l de hielo frío HBSS-completo excepto por el pellet en el tubo etiquetado DAPI, que se resuspendió en solución de carga de l 500 FACS. Mantener los 6 tubos en hielo en la oscuridad hasta la clasificación.

6. Clasificación en el clasificador de células

NOTA: El funcionamiento del procedimiento de clasificación en el citómetro y el software ha sido estandarizada con una instrucción detallada proporcionada por la empresa. Brevemente, utilizamos 100 micras boquilla a 20 psi, ajustar la concentración de células objetivo entre 5 hasta 10 millones por ml, y ajustar la eficiencia de 70% o más (es decir, conflictos mantienen bajo 30%).

  1. Preparar tubos de recogida de FACS con 500 l de FBS / tubo que contiene 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Ajustar los parámetros de compensación del clasificador de células usando tubos de compensación de una sola mancha desde el paso 5.2.
    1. Registrar 10.000 células en tubos sin teñir para fijar la puerta negativo para cada intensidad de fluorescencia.
    2. Registrar 10.000 células en otros tubos de compensación de una sola mancha para fijar puerta segura para cada intensidad de fluorescencia.
      NOTA: El software calcula automáticamente los parámetros de compensación.
  3. Utilice una muestra de la etapa 5.1 para configurar las puertas de las poblaciones de células clasificadas mediante el registro de 3.000 células. El uso de la intensidad de fluorescencia como parámetros de X y la gráfica del eje Y, población de células diana puerta manualmente como un grupo de puntos aparentemente separados de otros puntos.
    NOTA: Este conjunto gating es flexible y arbitraria en base a los requisitos de los investigadores. Si los investigadores esperan mayor pureza basado en uno o más marcadores, mover la puertasuperior basado en la intensidad de fluorescencia correspondiente.
  4. Cargar un tubo de recogida y empezar a ordenar la población de células diana.
  5. Mantenga el tubo de recogida en el hielo después de la clasificación hasta que todos los tubos de muestras se realizan.
  6. Añadir hielo frío C10 al tubo de extracción de hasta 4 ml, tapa e invierta para mezclar.
  7. Centrifugar el tubo de recogida a 800 xg durante 5 min, 4 ° C, y luego aspirar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 l con sedimento de células intactas.
  8. Añadir 1 ml de hielo frío C10 para volver a suspender el sedimento celular y transferir toda la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 1.5 ml.
  9. Centrifugar el tubo 1,5 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C y aspirar el sobrenadante, dejando 100 l con el sedimento de células intactas.
  10. Almacenar las poblaciones de células ordenados en hielo hasta su uso.

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Resultados

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El objetivo de enriquecer la médula ósea PDC con alta pureza, y sin la influencia de otros tipos de células, de MRL / lpr ratones propensos al lupus tanto de la edad joven y viejo para estudiar los cambios funcionales del PDC en cuanto a su capacidad de producir IFN. La primera estrategia de purificación usado fue MCS, que, como muestra la Figura 1, condujo a solamente 7,75% de pureza después de la enriquecimiento. En comparación con los MCS, FACS enriquecido PDC con una...

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Discusión

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El protocolo descrito en este manuscrito es para el enriquecimiento de alta pureza de pDC vivo que conserva la capacidad de producir IFNα. Las aplicaciones de este protocolo incluyen, entre otras, la purificación de pDC y / o cualquier otra célula mononuclear de la médula ósea de MRL / lpr y cualquier otra cepa de ratón para estudios de funciones celulares y moleculares. Varios pasos críticos en este protocolo son garantizar una alta viabilidad y pureza del pDC clasificado. El primer paso clave es la liberación de la méd...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Agradecimientos

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Agradecemos al Laboratorio de Citometría de Flujo de la Facultad de Medicina Veterinaria de Virginia-Maryland por el uso de las instalaciones centrales de citometría de flujo. Este trabajo contó con el apoyo de los fondos iniciales de XML. XL es Stamps Fellow en el programa de posgrado en Ciencias Biomédicas y Veterinarias.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI 1640gibco de life technologies11875-093
Suero fetal bovinoHyCloneSH30396.03
Piruvato de sodiogibco de life technologies11360-070
MEM aminoácidos no esencialesgibco de life technologies11140-050
HEPESgibco de life technologies15630-080
2-mercaptoetanolgibco de life technologies21985-023
L-glutamina gibco de life technologies25030-164
Penicilina-estreptomicinagibco de life technologies15140-122
1x Hank' s Solución salina equilibrada  gibco by life technologies14175-079
MACS BSA Solución madreMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNasa ISIGMAD4527
Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) eBioscience00-4300-54
Medio de gradiente de densidadGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
anti-ratón CD19-PEBD Pharmingen553786
anti-ratón CD11c-PEeBioscience12-0114-82
anti-ratón CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
anti-ratón PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
anti-ratón B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Kit de aislamiento de células dendríticas plasmocitoide II, ratónMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I citómetro de flujo BD Biosciences643178
BD FACS Diva versión 6BD Biosciences

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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