Summary
Vi rapporterar ett protokoll med användning av fluorescensaktiverad cellsortering för att isolera plasmacytoid dendritiska celler (PDC) med hög renhet från benmärgen hos lupus-benägna möss för funktionella studier av pDC.
Protocol
OBS: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus-benägna möss avlades och hölls i ett visst patogen-fri anläggning enligt kraven i Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Virginia Tech (djurskydds Assurance Antal: A3208-01). Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Alla djurförsök genomfördes under IACUC protokollet # 12-062.
1. Cell Culture Medium och Sortering buffert
- Förbereda fullständigt cellodlingsmedium (C10) med användning av RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% 100 MEM icke-essentiella aminosyror, 10 mM HEPES, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin och 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Förbereda sorteringsbuffert (HBSS-full) med användning av 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml bovint serumalbumin,0,05 mM MgCl2 och 0,2 U / ml DNas I.
2. Mus Dissection
- Iordningställ två skålar 6 cm diameter innehållande 4 ml C10. Placera skålarna på is.
- Euthanize musen genom CO 2 inandning.
- Skörda mjälten och hålla den i en skål med C10 på is.
- Pin musen ner med magen uppåt på dissekering plattan. Sterilisera kroppen genom sprutning 70% etanol.
- Skär huden och separera huden från muskel väggen nedanför längs den ventrala mittlinjen från blygdbenssammanfogningen till halsen.
- Skära in i huden längs bakbenet från det första snittet för att vristen.
- Stift huden tillbaka på sidorna och skär muskelväggen längs sidorna från det första snittet plats att membranet.
- Stift muskeln väggen tillbaka på den högra sidan av huvudet.
- Lokalisera mjälten på den högra sidan av musen under tunntarmen och bredvid magen. Plocka upp ena änden av the mjälte och separera den från magen.
- Skär båda bakbenen ut, inklusive lårben och skenben, och ta bort alla muskler så mycket som möjligt.
- Skär musklerna längs bakbenet från bäcken / höftleden till ankeln med en vass sax, försöker undvika blodkärl.
- Separera bakbenet ut genom att skära vid bäcken / höftleden och fotled / fotled utan exponering av benmärgs innehåll.
- Rengör resterande muskler på benen genom att skrapa med ett rakblad upprepade gånger skära musklerna vid de gemensamma punkter.
- Håll benen i en 6 cm skål innehållande 4 ml C10 på is. Fortsätt till dissekera nästa mus.
3. splenocyt Isolering
- Homogenisera mjälten försiktigt med en sprutkolv mot en 70-fim cell sil ovanpå skålen innehållande 4 ml C10 tills inga röda bitar är synliga.
- Lägg till ytterligare sex ml C10 i skålen genom silen ennd sedan överföra den totala 10 ml cellsuspension till en 15 ml koniska rör.
- Centrifugera den koniska röret vid 800 xg under 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 2 ml 1 x röda blodkroppar (RBC) lysbuffert. Inkubera vid RT i 5 min.
- Efter inkubation, centrifugera den koniska röret vid 800 xg under 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml C10. Kasta några stora klumpar (döda celler) och hålla röret på is under senare.
OBS: Om det finns många små klumpar, använder en 70-ìm cell sil för att filtrera cellsuspensionen gång. - Räkna antalet celler med trypanblått med användning av en automatiserad cellräknare.
4. benmärgsceller Isolering
- Överföra benen med 4 ml C10 i en mortel och tillsätt 6 ml C10 för att göra en volym av 10 ml C10 totalt.
- Spricka benen försiktigt i morteln med apestle.
- Rör om försiktigt med mortelstöten för att frigöra benmärgen till C10.
- Överför 10 ml C10 innehåller benmärg i ett 50 ml koniskt rör på is genom en 70-ìm cell sil. Tillsätt 10 ml färsk C10 i murbruk som fortfarande innehåller ben.
OBS: Pipettera lösningen innehållande benmärg upp och ned flera gånger innan det passerar genom silen, om röda klumpar är synliga. - Upprepa steg från 4,2 till 4,4 gånger. Efter den sista tvättningen, bör ben visas vita.
- Centrifugera 50 ml koniskt rör vid 800 xg under 5 min, 4 ° C. Under tiden, förbereda 5 ml färdig att använda densitetsgradient-medium i ett 15 ml koniskt centrifugrör vid RT.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml C10.
- Sakta lager 10 ml cellsuspensionen ovanpå 5 ml densitetsgradient medium upprätthålla tydliga gränssnitt mellan de två faserna. centrifugera sedan den 15 ml koniska rör vid 1363 g under 30 minuter vidRT (20 ° C) med acceleration uppsättning som nio och retardation in som 0 (eller broms OFF).
- Efter centrifugering, ta bort den övre 8 ml lösning noggrant och samla in 2 ml buffy coat vid gränsytan (ett lager av mononukleära celler) in i ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Lägga 12 ml iskall C10 till de 15 ml koniskt rör innehållande benmärgsmononukleära celler, lock och invertera flera gånger för att blanda väl, sedan Centrifugera röret vid 800 xg under 10 min, 4 ° C.
5. Cell Surface Färgning för FACS
- prov-färgning
- Förbereda anti-mus CD16 / 32 antikroppslösning (1 till 100 utspädning i HBSS-fullt, 5 | ig / ml slutlig koncentration).
- Efter centrifugering i steg 4,10, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 100 | il anti-mus CD16 / 32 antikroppslösning för att blockera Fc-receptor på mononukleära celler. Inkubera på is under 10 min.
- Förbereda fluorescens-konjugerad antikropp blandning (anti-mus CD11c-PE 01:40 utspädning, anti-mus CD11b-APC-CY7 1:80 utspädning, anti-mus PDCA-1-FITC 1:40 utspädning och anti-mus B220-V500 1:40 utspädning i HBSS- fullständig som rekommenderas av tillverkaren på 100 ul slutvolym per prov).
OBS: Det är viktigt att titrera antikroppar före användning. - Efter 10 minuters inkubation i steg 5.1.2, tillsätt 4 ml iskall HBSS-fullständig och centrifugera vid 800 xg under 5 min, 4 ° C för att avlägsna obunden anti-mus CD16 / 32.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 100 | j, l fluorescens-konjugerad antikropp-blandning. Inkubera på is under 15 minuter i mörker.
- Efter 15 minuters inkubation, tillsätt 4 ml iskall HBSS-fullständig och centrifugera vid 800 xg under 5 min, 4 ° C för att avlägsna obundna fluorescens konjugerade antikroppar.
- Förbereda FACS laddningslösning (500 ng / ml DAPI i HBSS-full).
- Efter centrifugering i steg 5.1.6, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 500 μ; L FACS laddningslösning. Överför cellsuspensionen till ett 12 x 75 mm rundbottnad rör (FACS-rör) och hålla röret på is i mörker tills sortering inom en timme.
- Färgning för ersättning
- Etikett 6 FACS rör som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller ofärgade. Alikvota splenocyter på 1 x 10 6 celler / röret i de FACS rör och tvätta med 4 ml HBSS-fullt vid 800 xg under 5 min, 4 ° C.
OBS: Använd DNA-bindande fluorescens färgämne, DAPI, att skilja levande celler från döda celler. DAPI kan passera genom plasmamembranet av döda celler (men inte levande celler) och binda kromosom-DNA. - Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 100 ^ HBSS full.
- I varje motsvarande FACS rör, tillsätt en av följande antikroppar: anti-mus CD19-PE 01:40 utspädning, anti-mus CD11b-APC-CY7 1:80 utspädning, anti-mus PDCA-1-FITC 1:40 utspädning eller anti-mus B220-V500 1:40 utspädning som rekommenderas av manufacturer. Låt 5: e (DAPI) och 6: e (ofärgade) FACS rören som de är. Blanda väl genom att skaka och inkubera alla FACS rör på is i mörker under 15 min.
- Efter inkubationen, till 4 ml iskall HBSS-fulla i varje rör och centrifugera FACS rör vid 800 xg under 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 500 ul iskall HBSS full utom för pelleten i röret märkt DAPI, som suspenderades i 500 pl FACS laddningslösning. Hålla alla 6 rören på is i mörker tills sortering.
- Etikett 6 FACS rör som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller ofärgade. Alikvota splenocyter på 1 x 10 6 celler / röret i de FACS rör och tvätta med 4 ml HBSS-fullt vid 800 xg under 5 min, 4 ° C.
6. Sortering på Cell Sorter
OBS: Användning av sorteringsproceduren på cytometern och programvaran är standardiserad med en detaljerad instruktion som tillhandahålls av företaget. Kortfattat använder vi 100 mikron munstycke vid 20 psi, sätta mål cellkoncentrationen mellan 5 till 10.000.000 per ml, och justera effektivitet till 70% eller högre (dvs konflikter hålls under 30%).
- Förbereda uppsamlings FACS rör med 500 mikroliter FBS / rör innehållande 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Justera kompensations parametrar cellsorterare med hjälp av en enda fläck ersättning rören från steg 5,2.
- Registrera 10.000 celler i ofärgade röret för att ställa negativ grind för varje fluorescensintensitet.
- Spela 10.000 celler i andra enda fläck ersättning rör för att ställa positiva grind för varje fluorescensintensitet.
OBS: Programvaran beräknar automatiskt parametrarna ersättning.
- Använd ett prov från steg 5,1 för att ställa in portar sorterade cellpopulationer genom att spela in 3000 celler. Med användning av fluorescensintensitet som parametrar för X och Y-axel graf, gate målcellpopulationen manuellt som en grupp av punkter som synes separerade från andra punkter.
OBS: Denna grinduppsättning är flexibel och godtyckligt baserat på kraven för forskare. Om forskarna räknar med högre renhet baserat på en eller flera markörer, flytta grindenhögre baserat på motsvarande fluorescensintensiteten. - Ladda en uppsamlingsrör och börja att sortera målcellspopulationen.
- Hålla uppsamlingsröret på is efter sortering tills alla provrör är klar.
- Lägg iskall C10 till uppsamlingsröret upp till 4 ml, mössa och vänd blanda.
- Centrifugera uppsamlingsrör vid 800 xg under 5 min, 4 ° C, och sedan aspirera supernatanten, vilket lämnar omkring 200 | j, l med cellpelleten orörd.
- Tillsätt 1 ml iskall C10 för att resuspendera cellpelleten och överföra alla cellsuspension i en 1,5 ml centrifugrör.
- Centrifugera 1,5 ml rör vid 800 x g under 5 min, 4 ° C och aspirera supernatanten, vilket lämnar 100 | il med cellpelleten orörd.
- Lagra de sorterade cellpopulationer på is fram till användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi syftar till att berika benmärg pDC med hög renhet, och utan påverkan av andra celltyper, från MRL / lpr lupus-benägna möss av både unga och gamla ålder för att studera de funktionella förändringar PDC om deras förmåga att producera IFNa. Den första reningsstrategi som användes var MCS, som, såsom figur 1 visar, ledde till endast 7,75% renhet efter anrikning. Jämfört med MCS, FACS berikat pDC med renhet så hög som 96,4%. För att säkerställa hög renhet, var en steg-för-steg-gating strategi utförs. Såsom visas i figur 2, var mononukleära celler gated och separeras från debris genom framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) parametrar. Använda FSC-bredd (FSC-W) mot FSC-höjd (FSC-H) och SSC-W vs SSC-H, har enstaka celler gated att undvika falska positiva signaler som alstras av aggregat. Levande enskilda celler därefter gated som DAPI - populationen (DAPI + celler är döda eller apoptotiska).Från levande enskilda celler, CD11c + CD11b - var befolkningen gated, som B220 + PDCA-1 + befolkningen ytterligare gated som PDC. Den sorterade pDC var inte bara av hög renhet, men också funktionellt normalt. De hade förmågan att producera IFNa in vitro på CpG-stimulering som visas i Figur 3 (Re-print med tillstånd från vår tidigare publikation 17.
Figur 1. Renhet PDC Sorterade antingen genom MCS och FACS metod representant flödescytometri siffror som visar andelen PDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). I sorterade celler genom MCS (överst) och FACS (botten), respektive. Den CD11c + CD11b - befolkningen gated från total levande celler (vänster), och sedan PDC B220 + PDCA-1 + Celler gated inom CD11c + CD11b -. Befolkning (höger) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Gating strategi för pDC berikning av FACS Ett steg-för-steg-grind strategi i följande ordning:. Mononukleära celler till enskilda celler FSC, till enstaka celler SSC, till DAPI - levande celler, till CD11c + CD11b - samt B220 + PDCA-1 + som levande pDC. PDC totala enskilda celler är 2,95 ± 1,42%; sorterade pDC nummer är 0,88 ± 0,28 x 10 5 per mus med en återvinningsgrad cirka 50%. (N = 12 MRL / lpr möss, är data visas som medelvärde ± SD i 95% CI av medelvärdet). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3. IFNa Produktion av FACS-sorterade pDC Sorterat benmärg pDC behandlades med klass A CpG (ODN1585, 5 M) under 6 timmar in vitro. I figuren, "y" står för yngre, 6 veckor gamla möss; "O" står för äldre, 16 veckor gamla möss. Gränsvärde står för MRL möss som friska kontrollmöss; LPR står för MRL / lpr-möss som lupus-benägna möss. Koncentrationen av IFNa i odlingssupematanten mättes med ELISA. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, envägs-ANOVA. Data visas som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (n = 3 möss per grupp). Denna siffra reproduceras från vår publikation i Journal of Immunology med tillstånd. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
