Summary
Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.
Protocol
NOTA: MRL / Mp-Fas LPR (MRL / lpr) mice lupus inclini sono stati allevati e mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni conformemente ai requisiti del Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC) a Numero Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto IACUC protocollo # 12-062.
1. cellulare terreno di coltura e ordinamento Buffer
- Preparare completa mezzo di coltura cellulare (C10) con RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale bovino, 1 mM di sodio piruvato, 1% 100 MEM aminoacidi non essenziali, 10 mM HEPES, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
- Preparare tampone di smistamento (HBSS-pieno) utilizzando la soluzione di 1x Hank salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina,0.05 mM MgCl 2 e 0,2 U / ml I. DNase
2. mouse Dissection
- Preparare due piatti di diametro 6 cm contenente 4 ml C10. Porre le capsule in ghiaccio.
- Eutanasia il mouse da CO 2 inalazione.
- Raccolto la milza e tenerlo in un piatto con C10 sul ghiaccio.
- Pin il mouse verso il basso con la pancia rivolta verso l'alto sulla piastra di dissezione. Sterilizzare il corpo a spruzzo 70% di etanolo.
- Tagliare la pelle e separare la pelle dalla parete muscolo sotto lungo la linea mediana ventrale dalla sinfisi pubica al collo.
- Tagliare la pelle lungo l'arto posteriore dalla prima incisione per la caviglia.
- Pin la pelle posteriore sui lati e tagliare la parete muscolare lungo i lati dal primo posto incisione per diaframma.
- Pin la parete muscolare posteriore sul lato destro della testa.
- Trova la milza sul lato destro del mouse sotto tenue e accanto stomaco. Pick up una estremità di The milza e separarlo dallo stomaco.
- Tagliare entrambi gli arti posteriori fuori, compreso femore e tibia, e rimuovere tutti i muscoli il più possibile.
- Tagliare i muscoli lungo dell'arto posteriore dal bacino / anca giunto alla caviglia con una forbice tagliente, cercando di evitare i vasi sanguigni.
- Separare il arto posteriore fuori tagliando al bacino / anca e caviglia / piede senza l'esposizione dei contenuti del midollo osseo.
- Pulire muscoli rimanenti sulle ossa graffiando con una lametta ripetutamente e tagliando i muscoli nei punti comuni.
- Mantenere le ossa in un piatto 6 centimetri contenente 4 ml C10 su ghiaccio. Procedere alla dissezione il mouse successivo.
Isolamento 3. splenocyte
- Omogeneizzare la milza delicatamente con un pistone siringa contro un filtro cella 70 micron sulla parte superiore della capsula contenente 4 ml C10 fino a quando non pezzi rosso sono visibili.
- Aggiungere ulteriore C10 6 ml nel piatto attraverso il filtro di unand poi trasferire la sospensione cellulare 10 ml totali di un tubo da 15 ml.
- Centrifugare il tubo conico a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 ml 1 x globuli rossi (RBC) tampone di lisi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta conica a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml C10. Eliminare le grandi grumi (cellule morte) e mantenere la provetta in ghiaccio per più tardi.
NOTA: Se ci sono molti piccoli ciuffi, usare un filtro cella di 70 micron per filtrare la sospensione cellulare una volta. - Contare il numero di cella con trypan blu utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
L'isolamento delle cellule 4. midollo osseo
- Trasferire le ossa con 4 ml C10 in un mortaio e aggiungere 6 ml C10 per fare un volume di 10 ml C10 in totale.
- Crack le ossa dolcemente nel mortaio utilizzando apestle.
- Mescolare delicatamente con il pestello per liberare il midollo osseo in C10.
- Trasferire i ml C10 10 contenenti midollo osseo in un tubo conico da 50 ml su ghiaccio attraverso un colino cella di 70 micron. Aggiungere 10 ml C10 fresche nella malta contenente ancora le ossa.
NOTA: Pipettare la soluzione contenente midollo osseo su e giù diverse volte prima di passare attraverso il filtro se ciuffi rossi sono visibili. - Ripetere i passaggi tra 4,2 e 4,4 volte. Dopo l'ultimo lavaggio, le ossa dovrebbero apparire bianco.
- Centrifugare il tubo conico da 50 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C. Nel frattempo, preparare 5 ml di mezzo gradiente di densità ready-to-use in un 15 ml provetta da centrifuga conica a RT.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml C10.
- Lentamente strato sospensione 10 ml di cellule sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità 5 ml, mantenendo interfaccia netta tra le due fasi. Poi centrifugare la provetta conica da 15 ml a 1.363 g per 30 min aRT (20 ° C) con set accelerazione 9 e decelerazione impostato come 0 (o freno OFF).
- Dopo la centrifugazione, rimuovere la parte superiore soluzione 8 ml attenzione e raccogliere il mantello 2 ml buffy all'interfaccia (uno strato di cellule mononucleate) in un nuovo tubo da 15 ml.
- Aggiungere C10 12 ml di ghiaccio freddo al tubo da 15 ml contenenti cellule mononucleari del midollo osseo, tappo e capovolgere più volte per mescolare bene, poi centrifugare la provetta a 800 g per 10 min, 4 ° C.
5. cellulari di superficie di colorazione per FACS
- colorazione del campione
- Preparare Topo anti-CD16 / 32 soluzione di anticorpi (1 a 100 diluizione in HBSS-pieno, 5 mg / ml concentrazione finale).
- Dopo la centrifugazione al punto 4.10, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 ml soluzione anti-topo CD16 / 32 anticorpi per bloccare il recettore Fc sulle cellule mononucleari. Incubare in ghiaccio per 10 min.
- Preparare miscela di anticorpi a fluorescenza coniugato (anti-topo CD11c-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione e anti-topo B220-V500 01:40 diluizione nel HBSS- pieno come consigliato dal produttore in 100 volume finale ml per campione).
NOTA: E 'importante per titolare anticorpi prima dell'uso. - Dopo 10 min di incubazione nel passo 5.1.2, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere non legato anti-topo CD16 / 32.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 100 miscela di anticorpi fluorescenza coniugato microlitri. Incubare in ghiaccio per 15 minuti al buio.
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno e centrifugare a 800 xg per 5 min, 4 ° C per rimuovere gli anticorpi fluorescenza coniugato non legato.
- Preparare la soluzione di carico FACS (500 ng / ml DAPI in HBSS-pieno).
- Dopo la centrifugazione al punto 5.1.6, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μ; L FACS soluzione di carico. Trasferire la sospensione cellulare in un 12 x 75 mm tubo fondo rotondo (tubo FACS) e tenere il tubo in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento entro 1 ora.
- La colorazione di risarcimento
- Etichetta 6 FACS tubi PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI o senza macchia. Splenociti aliquote a 1 x 10 6 cellule / tubo nei tubi FACS, e lavare con 4 ml HBSS-pieno a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
NOTA: Utilizzare DNA-binding colorante fluorescente, DAPI, di distinguere le cellule vive dalle cellule morte. DAPI può passare attraverso la membrana plasmatica delle cellule morte (ma non di cellule vive) e il DNA cromosomico legano. - Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri HBSS-pieno.
- In ogni tubo FACS corrispondente, aggiungere uno dei seguenti anticorpi: anti-topo CD19-PE 01:40 diluizione, anti-topo CD11b-APC-Cy7 1:80 diluizione, anti-topo PDCA-1-FITC 01:40 diluizione o anti-topo B220-V500 01:40 diluizione come raccomandato dal manufacturer. Lasciare il 5 ° (DAPI) e 6 ° (senza macchia) FACS tubi così come sono. Mescolare bene agitando e incubare tutti i tubi FACS su ghiaccio al buio per 15 min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 4 ml di ghiaccio freddo HBSS-pieno in ogni provetta e centrifugare i tubi FACS a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di ghiaccio freddo HBSS-completo tranne per il pellet nella provetta etichettata DAPI, che viene risospeso in 500 microlitri soluzione tampone FACS. Mantenendo tutti i 6 tubi in ghiaccio al buio fino a quando l'ordinamento.
- Etichetta 6 FACS tubi PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI o senza macchia. Splenociti aliquote a 1 x 10 6 cellule / tubo nei tubi FACS, e lavare con 4 ml HBSS-pieno a 800 xg per 5 min, 4 ° C.
6. Ordinamento sul cell sorter
NOTA: Il funzionamento di smistamento procedura sul citometro e il software è standardizzato con istruzioni dettagliate fornite dalla società. In breve, usiamo 100 ugelli micron a 20 psi, impostare la concentrazione cellulare bersaglio compresa fra 5 - 10 milioni per ml, e regolare l'efficienza al 70% o superiore (per esempio, i conflitti tenuti sotto 30%).
- Preparare le provette FACS di raccolta con 500 ml FBS / provetta contenente 100 U / ml di penicillina-streptomicina.
- Regolare i parametri di compensazione del cell sorter utilizzando tubi di compensazione singola macchia dal punto 5.2.
- Registrare 10.000 cellule in provetta senza macchia per impostare cancello negativo per ogni intensità fluorescente.
- Registrare 10.000 cellule in altri tubi di compensazione singolo-macchia per impostare cancello positivo per ogni intensità fluorescente.
NOTA: Il software calcola automaticamente i parametri di compensazione.
- Utilizzare un campione dal punto 5.1 per impostare le porte di popolazioni cellulari ordinate registrando 3.000 cellule. Usando intensità fluorescente come parametri di X e grafico Y, popolazione di cellule bersaglio cancello manualmente come un gruppo di punti apparentemente separati dagli altri punti.
NOTA: Questo insieme gating è flessibile e arbitraria in base alle esigenze dei ricercatori. Se i ricercatori si aspettano maggiore purezza sulla base di uno o più indicatori, muovere il cancellosuperiore basato sulla intensità di fluorescenza corrispondente. - Caricare un tubo di raccolta e iniziare a ordinare la popolazione di cellule bersaglio.
- Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio dopo la cernita fino a quando tutte le provette dei campioni sono fatti.
- Aggiungere il ghiaccio freddo C10 al tubo di raccolta fino a 4 ml, tappo e miscelare.
- Centrifugare il tubo di raccolta a 800 xg per 5 min, 4 ° C, e quindi aspirare il surnatante, lasciando circa 200 microlitri con pellet di cellule intatte.
- Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo C10 per risospendere il pellet cellulare e trasferire tutto sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml centrifuga.
- Centrifugare la provetta da 1,5 ml a 800 xg per 5 min, 4 ° C e aspirare il surnatante, lasciando 100 microlitri con il pellet di cellule intatte.
- Conservare le popolazioni di cellule ordinati sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbiamo puntato ad arricchire il midollo osseo pDC con elevata purezza, e senza l'influenza di altri tipi di cellule, da MRL / lpr topi lupus inclini di giovani e meno giovani di età per studiare i cambiamenti funzionali del pDC quanto riguarda la loro capacità di produrre IFNα. La prima strategia di purificazione usato era MCS, che, come mostra la figura 1, portato a solo 7,75% di purezza dopo l'arricchimento. Rispetto alla MCS, FACS arricchito PDC purezza alto come 96,4%. Per garantire elevata purezza, una strategia gating passo-passo è stato eseguito. Come mostrato in figura 2, le cellule mononucleari sono state gated e separati da detriti dal forward scatter (FSC) e parametri di dispersione laterale (SSC). Utilizzando FSC larghezza (FSC-W) vs. FSC-altezza (FSC-H) e SSC-W e SSC-H, singole cellule sono state gated per evitare i falsi segnali positivi prodotti da aggregati. Singole cellule in diretta sono state poi gated come il DAPI - popolazione (cellule DAPI + sono morti o apoptosi).Da singole cellule vive, CD11c + CD11b - popolazione è stata gated, da cui B220 + PDCA-1 + popolazione è stata ulteriormente sorvegliato come PDC. Il PDC ordinato erano non solo di elevata purezza, ma anche funzionalmente normale. Hanno avuto la capacità di produrre IFNα in vitro in seguito a stimolazione CpG come mostrato in figura 3 (Re-stampa con il permesso dalla nostra precedente pubblicazione 17.
Figura 1. La purezza del pDC Ordinati attraverso sia la MCS e metodo FACS flusso rappresentante citometria dati che indicano la percentuale di PDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). Nelle celle ordinate per MCS (in alto) e FACS (in basso), rispettivamente. Il CD11c + CD11b - popolazione è stata recintata dalle cellule totali dal vivo (a sinistra), e poi pDC come B220 + PDCA-1 Cellule + sono stati gated all'interno del CD11c + CD11b -. Popolazione (a destra) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. strategia di gating per pDC arricchimento da FACS Una strategia di gating passo-passo nel seguente ordine:. Cellule mononucleate a singole cellule FSC, di singole cellule SSC, per DAPI - cellule vive, a CD11c + CD11b -, e per B220 + PDCA-1 +, come vivo pDC. PDC in totale singole cellule è 2.95 ± 1,42%; ordinati numero di PDC è 0,88 ± 0,28 x 10 5 per mouse con un tasso di recupero del 50% circa. (N = 12 MRL / lpr topi, i dati sono mostrati come media ± SD nel 95% CI della media). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3. IFNα Produzione per FACS-ordinato pDC osso Ordinati osseo pDC sono stati trattati con classe A CpG (ODN1585; 5 micron) per 6 ore in vitro. Nella figura, "y" significa più giovani 6 settimane di età topi,; "O" sta per anziani 16 settimane di età topi,. MRL acronimo di topi MRL topi di controllo come sani; LPR è sinonimo di topi MRL / lpr come topi lupus-prona. La concentrazione di IFNα nel supernatante di coltura è stato misurato con ELISA. * P <0.05, ** P <0,01, *** p <0,001, ANOVA. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (n = 3 topi per gruppo). Questa figura è riprodotto dalla nostra pubblicazione in Journal of Immunology con il permesso. 17PLOAD / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
