Summary
Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.
Protocol
NOT: MRL / Mp-Fas lpr lupus eğilimli fareler yetiştirilen ve Virginia Tech (Hayvan Refahı Güvencesi sayısı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) gereklerine itibaren belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi (MRL / lpr): A3208-01). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri IACUC protokolü # 12-062 altında gerçekleştirilmiştir.
1. Hücre Kültürü Orta ve Sıralama Tampon
- Tüm hücre kültürü ortamı (C 10),% 10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat,% 1, 100 MEM temel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ile hazırlayın 100 U / ml penisilin-streptomisin.
- ayırma tamponu hazırlayın 10 mM HEPES ile desteklenmiş 1 x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile (dolu HBSS), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini,0,05 mM MgCl2 ve 0.2 U / ml DNaz I
2. Fare diseksiyonu
- 4 ml C10 içeren iki 6 cm çapında yemekleri hazırlayın. buz üzerinde yemekleri yerleştirin.
- CO 2 inhalasyon yoluyla fare Euthanize.
- dalak hasat ve buz üzerinde C10 ile bir tabak içinde tutmak.
- diseksiyon plaka üzerinde yukarı bakacak şekilde karın fare aşağı pin. % 70 etanol püskürtülerek vücudu sterilize edin.
- Cildi kesin ve altında boyun pubis eklemi ventral orta hat boyunca kas duvarından cilt ayırmak.
- Ayak bileği ilk kesi arka bacak boyunca cildi kesin.
- arka yüzlerine cilt pin ve diyafram ilk kesi yerden kenarlarında kas duvarı kesti.
- kafanın sağ tarafında kas duvarı geri pin.
- ince bağırsak altında ve mide yanında farenin sağ tarafta dalak bulun. inci bir ucunu Pick upe dalak ve mide ayırın.
- femur ve tibia da dahil olmak üzere, her iki arka bacaklarda kesip, ve mümkün olduğunca tüm kasları kaldırın.
- kan damarları önlemek için çalışıyoruz, keskin bir makas ile ayak bileği pelvik / kalça ekleminden arka bacak boyunca kasları kesti.
- Kemik iliği içeriğinin maruz kalmadan pelvis / kalça eklemi ve ayak bileği / ayak eklem keserek arka uzuv ayırmak.
- tekrar tekrar jilet ile çizilme ve ortak noktalarda kasları keserek kemikler üzerinde temiz kalan kaslar.
- buz üzerinde 4 ml C10 içeren 6 cm çanak kemikleri tutun. Bir sonraki fare diseksiyon geçin.
3. splenosit yalıtımı
- Resim kırmızı renkli görünür olana kadar 4 mi C10 ihtiva eden çanak üzerine 70 mikron hücre süzgecinden karşı şırınga pistonu yavaşça dalak homojenize edilir.
- süzgeç a ile çanak içine ilave 6 ml C10 eklend sonra 15 ml konik tüp toplam 10 ml hücre süspansiyonu aktarın.
- 5 dakika, 4 ° C, 800 xg'de konik tüp santrifüjleyin.
- Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 2 ml 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu içinde hücre pelletini. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj konik tüp.
- Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 1 ml C10 hücre pelletini. herhangi bir büyük kümeleri (ölü hücreler) atın ve daha sonra buz üzerinde tüp tutun.
NOT: Birçok küçük kümeleri varsa, bir kez hücre süspansiyonu filtre 70 mikron hücre süzgeç kullanın. - otomatik bir hücre sayacı tripan mavisi ile hücre sayısı.
4. Kemik iliği Hücre İzolasyonu
- bir havan içine 4 mi C10 kemik aktarın ve toplam 10 mi C10 lik bir hacim oluşturmak için 6 ml C10 ekleyin.
- ap kullanarak harç yavaşça kemikleri çatlakestle.
- C10 içine kemik iliği serbest bırakmak için tokmak ile hafifçe karıştırın.
- 70 mikron hücre süzgecinden buz üzerinde bir 50 ml konik tüp içine kemik iliği içeren 10 ml C10 aktarın. hala kemikleri içeren harcın içine 10 ml taze C10 ekleyin.
NOT: Pipet kırmızı kümeleri görülebilir ise süzgecinden geçirmeden önce kemik iliği yukarı ve aşağı birkaç kez içeren solüsyon. - Tekrarlayın kez 4.4'e 4.2 adımları tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kemikler, beyaz görünmelidir.
- 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. Öte yandan oda sıcaklığında bir 15 mL konik santrifüj tüpü içinde 5 ml Ready-to-use yoğunluk gradyan hazırlarlar.
- Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 10 ml C10 hücre pelletini.
- Yavaş yavaş iki faz arasındaki net arayüzü koruyarak, 5 ml yoğunluk gradyan ortamının üstüne 10 ml hücre süspansiyonu katman. Daha sonra 30 dakikada için 1.363 g 15 ml konik tüp santrifüj0 (Fren KAPALI) olarak ayarlanmış hızlanma 9 olarak set ve yavaşlama ile RT (20 ° C).
- Santrifüj işleminden sonra, dikkatle üst 8 ml solüsyon kaldırmak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine arabirimi (mononükleer hücrelerin tabakası) 2 ml buffy coat toplamak.
- Kemik iliği tek çekirdekli hücreleri, kap ihtiva eden 15 ml konik tüp, 12 ml buz soğukluğunda C10 ekleyin ve daha sonra iyice karıştırın, 10 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj tüpü birkaç kez ters çevirin.
FACS 5. Hücre Yüzey Boyama
- örnek boyama
- anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi (İN 1-100 seyreltme HBSS-dolu / ml son konsantrasyon 5 ug) hazırlayın.
- Adım 4.10 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve tek çekirdekli hücreler üzerindeki Fc reseptörü bloke etme 100 ul anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi hücre pelletini. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- (Karınca floresan konjuge antikor karışım hazırlayınI-fare CD11c-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ve anti-fare B220-V500 HBSS- bölgesindeki 1:40 seyreltme örnek başına 100 ul nihai hacim) üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, tam.
NOT: Kullanmadan önce antikorlar titre önemlidir. - Aşama 5.1.2 içinde 10 dakika inkübe edildikten sonra, anti-fare CD16 / 32 bağlanmamış kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin.
- Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 100 ul floresan konjuge antikor karışımı içinde hücre pelletini. karanlıkta 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
- 15 dakika inkübasyondan sonra, bağlanmamış floresans-konjuge antikor kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin.
- FACS yükleme solüsyonu (HBSS-tam 500 ng / ml DAPI) hazırlayın.
- Aşama 5.1.6 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire 500 mikron hücre pelletiniL FACS yükleme çözümü. 12 x 75 mm yuvarlak tabanlı tüpü (FACS tüpü) içine hücre süspansiyonu aktarın ve 1 saat içinde sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde tüp tutun.
- Tazminat boyanma
- PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI veya boyasız olarak etiket 6 FACS tüpleri. 1 x 10 6 hücre / FACS tüplere boru ve en kısım splenositler, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi HBSS-Tam ile yıkayın.
NOT: ölü hücrelerden canlı hücreleri ayırt etmek floresan boya, DAPI, DNA-bağlayıcı. DAPI Ölü hücrelerin plazma zarına (fakat canlı hücre) ve bağlama kromozom DNA geçebilir. - Süpernatantı aspire ve 100 ul HBSS-tam hücre pelletini.
- anti-fare CD19-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ya: her bir karşılık gelen FACS tüpü içinde, aşağıdaki antikorların birisi ekleme manufa tarafından tavsiye edildiği gibi anti-fare B220-V500 01:40 seyreltmecturer. Oldukları gibi 5 inci (DAPI) ve 6. (boyasız) FACS tüpler bırakın. sallayarak iyice karıştırın ve 15 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde tüm FACS tüpleri kuluçkaya yatmaktadır.
- İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında, her bir tüp ve santrifüj içine FACS tüpler 4 mi buz gibi soğuk HBSS dolu ekleyin.
- Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 500 ul buz hücre pelletini 500 ul FACS yükleme çözeltisi içinde tekrar süspansiyon haline getirilir DAPI işaretli tüp, pellet haricinde soğuk HBSS dolu yeniden süspanse edin. sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde 6 tüpleri tutarak.
- PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI veya boyasız olarak etiket 6 FACS tüpleri. 1 x 10 6 hücre / FACS tüplere boru ve en kısım splenositler, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi HBSS-Tam ile yıkayın.
6. Hücre Sıralayıcısı üzerinde sıralama
NOT: sitometresindeki ve yazılım prosedürü sıralama Operasyonu şirket tarafından sağlanan ayrıntılı bir talimat ile standardize edilmiştir. Kısaca, biz 20 psi 100 mikron nozul, 5 arasında ayarlanabilir hedef hücre konsantrasyonunu kullanmak - ml başına 10 milyon ve% 70 ya da daha yüksek verimlilik ayarlamak (yani, çatışmalar 30 yaşın altında tutulan%).
- 100 U / ml penisilin-streptomisin içeren 500 ul FBS / tüp ile toplanması FACS tüpü hazırlayın.
- Adım 5.2 den tek leke kompanzasyon tüpleri kullanılarak hücre sıralayıcı tazminat parametrelerini ayarlayın.
- Her florasan yoğunluğu için negatif bir kapı ayarlama boyanmamış bir tüp içinde 10,000 hücre kaydedin.
- Her floresan yoğunluğu için pozitif kapısı ayarlamak için diğer tek leke tazminat tüplerde 10.000 hücreleri kaydedin.
NOT: Yazılım otomatik olarak tazminat parametrelerini hesaplar.
- 3000 hücrelerini kaydederek sıralı hücre popülasyonlarının kapılarını ayarlamak için adım 5.1 bir örnek kullanın. el görünüşe göre diğer noktalardan ayrı noktalar grubu olarak X ve Y ekseni grafik geçit hedef hücre popülasyonunun parametre olarak floresan yoğunluğunu kullanılması.
NOT: Bu yolluk seti araştırmacıların ihtiyaçlarına göre esnek ve keyfidir. Araştırmacılar, bir ya da daha fazla belirteçler dayalı yüksek saflıkta bekliyorsanız, kapı hareketyüksek gelen floresan yoğunluğuna göre. - Bir koleksiyon tüp yükleyin ve hedef hücre popülasyonunu sıralamak başlar.
- Tüm örnek tüpleri yapılır kadar sıraladıktan sonra buz üzerinde toplama tüpü tutun.
- 4 ml, sınıra kadar toplama tüpüne buz C10 ekleyin ve karıştırın ters.
- 5 dakika, 4 ° C için 800 xg'de toplama tüpü Santrifüj ve sonra el değmemiş hücre pelet ile yaklaşık 200 ul bırakarak süpernatant aspire.
- hücre pelletini tekrar süspansiyon ve 1,5 ml santrifüj tüpüne Tüm hücre süspansiyonu transfer 1 ml buz gibi soğuk C10 ekleyin.
- Santrifüj bakir hücre peleti 100 ul bırakarak 1.5 mi, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında boru ve süpernatan aspire.
- kullanılana kadar buz üzerinde sıralanmış hücre popülasyonlarının saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz yüksek saflıkta kemik iliği PDC zenginleştirmek amaçladık ve IFNa üretme kabiliyetleri konusunda pDC fonksiyonel değişiklikleri incelemek için genç ve yaşlılık hem MRL / lpr lupus eğilimli farelerin diğer hücre türleri etkisi olmadan. Kullanılan ilk arıtma stratejisi Şekil 1'de görüldüğü gibi zenginleştirme sonra sadece% 7,75 saflıkta yol açtı, MCS, oldu. MCS ile karşılaştırıldığında, FACS% 96.4 gibi yüksek saflıkta PDC zenginleştirilmiş. Yüksek saflık sağlamak için, bir adım adım Ayırıcı stratejisi uygulandı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tek-çekirdekli hücreler, işlenir ve hem ileri dağılım (FSC) ve yan saçılma (SSC) parametreleri ile artıklardan ayrıldı. FSC-genişliği (FSC-W) FSC yüksekliği vs (FSC-H) ve SSC-H vs SSC-W kullanılarak, tek hücreler agrega tarafından üretilen yanlış pozitif sinyaller önlemek için kapı bulundu. Canlı tek hücreler daha sonra DAPI olarak çevrilmiştir - nüfusun (DAPI + hücreler ölü ya da apoptoz).Canlı tek hücrelerden, CD11c + CD11b - Nüfus hangi B220 + PUKÖ-1 + nüfus daha pDC olarak Geçitli, Geçitli. kriteri pDC yüksek saflıkta değil, aynı zamanda işlevsel olarak normal değil sadece idi. Onlar Şekil 3 (bizim önceki yayının 17 izniyle yeniden baskı gösterildiği gibi CpG stimülasyon üzerine in vitro IFNa üretme yeteneği vardı.
Şekil 1. MCS ve FACS Yöntem pDC yüzdesini (CD11c + CD11 b - B220 + PUKÖ-1 +) gösteren rakamlar sitometri Temsilcisi akış yoluyla ya pDC sıralanmıştır Saflık. MCS (üstte) ve FACS (altta) tarafından sıralı hücrelerde, sırasıyla. CD11c + CD11 b - Nüfus B220 + PUKÖ-1 olarak toplam canlı hücreler (solda) ve sonra PDC Geçitli + Hücreler CD11c + CD11b içinde kapılı edildi -. Nüfusun (sağda) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yolluk FACS tarafından pDC Zenginleştirme Stratejisi aşağıdaki sırayla bir adım-adım yolluk stratejisi:. FSC, tek hücrelere SSC, DAPI tek hücrelere mononükleer hücreler - canlı hücreler, CD11c + CD11b için -, ve B220 + PUKÖ-1 + canlı pDC olarak. toplam tek hücrelerde pDC 2.95 ± 1.42% ve; kriteri pDC numarası kurtarma oranı% 50 civarında olan fare başına 0.88 ± 0.28 x 10 5'tir. (N = 12 MRL / fareler lpr, veri ortalama ortalama ± SS% 95 CI olarak gösterilmiştir). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. FACS-kriteri PDC tarafından Şekil 3. IFNa üretimi sıralama kemik iliği pDC sınıfı bir CpG ile muamele edilmiştir (ODN1585; 5 um), in vitro olarak 6 saat. Şekilde "y", daha küçük olan, 6 haftalık fareler temsil eder; "O" eski, 16 haftalık farenin anlamına gelir. MRL MRL farelerin sağlıklı kontrol fareleri için duruyor; lpr lupus eğilimli fare gibi MRL / lpr fareler için duruyor. Kültür yüzey maddesindeki IFNa konsantrasyonu ELISA ile ölçüldü. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, tek yönlü ANOVA. Veriler ortalama ± ortalama (grup başına n = 3 fare) standart hatası gösterilmiştir. Bu rakam izni ile İmmünoloji Journal bizim yayınından yeniden üretilir. 17Güncelle / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
