Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

El objetivo general de este experimento es aislar células dendríticas plasmocitoides, o PDC, de alta pureza de la médula ósea de ratones propensos al lupus para el estudio de su función. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con las características de una población de células inmunitarias en particular, como el PDC productor de interferón alfa durante la etapa tardía del desarrollo del lupus. La principal ventaja de esta técnica es que una o varias poblaciones objetivo pueden enriquecerse hasta una mayor pureza que mediante la clasificación magnética de perlas.

Después de la cosecha, transfiera los huesos de las extremidades traseras y cuatro mililitros de medio completo a un mortero. Agregue seis mililitros de medio completo fresco para llevar el volumen total a 10 mililitros. Y rompe los huesos suavemente con un mortero.

Revuelva suavemente el mortero para liberar la médula ósea. Luego, transfiera todo el medio a través de un colador de 70 micras a un tubo cónico de 50 mililitros con hielo. Agregue 10 mililitros de medio completo fresco al mortero.

Y filtra el sobrenadante dos veces más hasta que los huesos aparezcan blancos. Luego, centrifugar las células de la médula ósea y volver a suspender el pellet en 10 mililitros de medio completo fresco. A continuación, coloque las células en capas de cinco mililitros de medio de gradiente de densidad recién preparado en un tubo cónico de 15 mililitros, teniendo cuidado de no interrumpir las capas.

Y separar las células por centrifugación. Luego, retire con cuidado los ocho mililitros superiores de la solución y recoja la capa de leucocitismo de dos mililitros en la interfase. Agregue 12 mililitros de medio completo helado a las celdas mononucleares aisladas y tape el tubo para mezclar por inversión.

A continuación, granular las células por centrifugación. Para teñir las células de FACS, vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de anticuerpo bloqueante CD1632FC a cuatro grados centígrados. Después de 10 minutos, lave las células en cuatro mililitros de tampón de clasificación helado y etiquete las células con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de tinción de superficie celular adecuado.

Durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Lave las células con cuatro mililitros de tampón de clasificación helado para eliminar cualquier anticuerpo conjugado de fluorescencia no unido. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de solución de carga de FACS y transfiera la muestra a un tubo de FACS con hielo.

Para teñir los controles de compensación, alícuota una vez 10 a 6 esplenocitos por tubo. Lave las celdas con cuatro mililitros de tampón de clasificación y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de clasificación. A continuación, añada el anticuerpo conjugado de fluorescencia adecuado del cóctel de anticuerpos de la superficie de la célula maestra a cada tubo de compensación correspondiente y agite los tubos para mezclar.

Después de 15 minutos en la oscuridad, a cuatro grados centígrados, lavar todas las muestras con tampón de clasificación y volver a suspender los pellets en 500 microlitros de tampón de clasificación helado. Excepto el tubo DAPI, que se vuelve a suspender en 500 microlitros de solución de carga FACS. Para purificar la población de células objetivo mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia, cargue tubos de recolección que contienen 500 microlitros de FBS suplementados con antibióticos debajo de las válvulas de clasificación.

A continuación, cargue el tubo sin teñir y recopile 10.000 eventos para establecer la puerta negativa para cada intensidad fluorescente. Y 10.000 eventos en los tubos de compensación de tinción individuales para establecer la puerta positiva para cada intensidad fluorescente. Recopile 3.000 eventos de la muestra experimental para establecer las puertas de la población de células ordenadas.

Uso de las intensidades de fluorescencia como parámetros del gráfico de acceso X e Y para controlar manualmente la población de células objetivo. A continuación, clasifique la población de células objetivo en el tubo de recolección. Al final de la clasificación, agregue hasta cuatro mililitros de medio completo de hielo a las celdas.

Luego, tape el tubo y mezcle las celdas por inversión. Granular las células purificadas por centrifugación, aspirando todos menos los últimos 200 microlitros del sobrenadante. Luego, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio completo helado y transfiera las celdas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para una segunda centrifugación.

Finalmente, aspire todos menos los últimos 100 microlitros del sobrenadante y almacene la población celular clasificada en hielo hasta su uso. La clasificación de células dendríticas plasmocitoides de médula ósea de ratones propensos al lupus da como resultado solo una pureza del 7,75% después del enriquecimiento. Sin embargo, las células dendríticas plasmocitoides enriquecidas con FACS demuestran una pureza de hasta el 96,4% después de la clasificación.

Para garantizar una alta pureza, las células mononucleares de la médula ósea primero se comprimen y se separan de los desechos mediante parámetros de dispersión frontal y lateral. Utilizando la anchura de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa y la anchura de dispersión lateral frente a la altura de dispersión lateral, las celdas individuales se limitan aún más para evitar las señales de falsos positivos producidas por los agregados. A continuación, las células vivas negativas para DAPI individuales se activan mediante su expresión de superficie celular CD11c positivo y CD11B negativo, lo que permite una mayor activación de la población de células dendríticas plasmocitoides de médula ósea positivas para B220 y PDCA-1 positivo.

La población de PDC clasificada no solo es de alta pureza, sino también funcionalmente normal, con la capacidad de producir IFNalfa tras la estimulación de CPG in vitro. Al intentar este procedimiento, es importante recordar romper los huesos y remover suavemente la médula ósea liberada para preservar la viabilidad celular. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de ARN o el cultivo y la estimulación in vitro, para responder preguntas adicionales sobre la expresión génica o la función de las poblaciones de células enriquecidas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores de PDC exploraran el papel de esta poderosa célula en el desarrollo de modelos de ratones con lupus y propensos al lupus. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población de PDC altamente purificada de la médula ósea de ratones propensos al lupus.