Introduction
Epilepsi er en vanlig nevrologisk lidelse som tilbakevendende anfall gjennom pasientens levetid. De fleste epileptiske tilbakefall kan være godt kontrollert av antiepileptika (AED). Men ca 30% av pasienter med epilepsi utvikle refraktær epilepsi en. Epilepsi årsaker søvnforstyrrelser, noe som ytterligere kan forverre gjentakelse. Bevis viser at epilepsi kan enten forstyrre søvnen om natten eller kan føre til overdreven søvnighet på dagtid 2,3. Våre tidligere studier indikerer videre at epilepsi forekommer på zeitgeber tid (ZT) 0, dvs. i begynnelsen av lyset periode i lys: mørke syklus, minsker søvn; Dette er mediert av kortikotropin-frigivende hormon (CRH), en homeostatisk faktor. Epilepsi ved ZT13 (begynnelsen av den mørke periode) øker ekspresjonen av en annen homeostatisk faktor, interleukin-1 (IL-1), noe som øker søvn. Søvn døgnrytme endres når epilepsi skjer på ZT6, midt pålys periode 4,5. På den annen side, søvnproblemer ytterligere forverre progresjon og gjentakelse av epilepsi 6. Basert på det ovennevnte bevis, prøver vi å avsløre en optimal terapeutisk metode for samtidig å kontrollere epilepsi og forebygge søvnforstyrrelser hos epilepsipasienter. Vi har tidligere funnet at elektro (EA) med en 10-Hz stimulering frekvens, i hvilket en viss mengde strøm blir levert inn i acupoint gjennom en rustfritt stål nål, med hell undertrykker electrocorticogram (ECOG) epileptiske aktiviteter og epilepsi-induserte søvnforstyrrelser 7 . EA med en 100-Hz stimulering frekvens forverres ytterligere epileptiske aktiviteter og søvnforstyrrelser hos rotter 8,9. Denne vellykkede eksperimentet avhenger av tre faktorer: For det første, en mulig epileptisk dyremodell; for det andre, en fremgangsmåte for søvn registrering og analyse hos gnagere; og for det tredje, nøyaktig ytelse av akupunktur og nøyaktigheten av acupoint beliggons.
Epilepsi har blitt kategorisert i to hovedtyper: focal epilepsi og generalisert epilepsi. Vi er interessert i samlingstinninglappen epilepsi (TLE), generalisert epilepsi, status epilepticus (SE), og gjentakelse av spontan generalisert epilepsi. Derfor er forskjellige manipulasjoner anvendes til å lage egnede epilepsimodeller for våre eksperimenter. For å etablere fokal TLE, er en lav dose av pilokarpin administrert inn i den venstre sentrale kjerne av amygdala (CEA). For å bekrefte denne modellen, er seks ECOG elektroder implantert på frontpartiet (F1 og F2), parietal (P1 og P2) og occipital (O1 og O2) fliker i både venstre og høyre hjernehalvdel, og ytterligere to referanseelektroder (R1 & R2) er plassert over cerebellum i begge halvkuler. En ekstra mikroinjeksjon guide kanyle implantert i venstre CEA (AP, 2,8 mm fra bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i forhold til bregma). Koordinatene blir tilpasset fra Paxinos og Watson rotte atlas 10. Hvis fokus TLE er vellykket indusert, bare opptaket fra elektroden på venstre parietal cortex (P1), som er nær venstre CEA, bør skaffe seg de dominerende epileptiske ECoGs, uten vesentlige epileptiske ECoGs registrert fra de andre ECOG elektroder. Intraperitoneal (IP) injeksjoner av pilokarpin i rotter indusere generalisert epilepsi og SE, men dette kan være dødelig. Fem IP-injeksjoner av pentylentetrazol (PTZ) med en en-dagers intervall mellom hver injeksjon med hell indusere spontan generalisert epilepsi hos mus, og også sørge for mus overlevelse. To ledning ECOG elektroder implantert i frontal og parietal cortex i mus for å motta ECOG-signaler og for å verifisere spontant tilbakevendende epilepsi.
Polysomnografi (PSG) er en omfattende metode for å registrere fysiologiske endringer som oppstår under søvn, og det kan objektivt klassifisere søvn inn i ulike stadier av non-rapid eye movement (NREM) og rAPID øyebevegelser (REM) søvn. PSG registrerer parametre av kroppens funksjoner, inkludert hjernen bølger (elektroencefalogram, EEG), øyebevegelser (electrooculogram, EOG), skjelettmuskel toner (elektromyogram, EMG), hjerterytme (elektrokardiogram, EKG), og blod oksygen nivå og luftveis parametere. Hos rotter registrerer vi ECoGs, EMGS, kortikal temperatur og muskelaktivitet for å klassifisere årvåkenhet tilstander i våkenhet, NREM søvn, og REM søvn. Sleep analyse i mus er utført ved ECoGs, EMGS og bevegelsesaktivitet resultater. Rotter er implantert med tre ECOG skru elektroder på frontal, parietal og kontralaterale lillehjernen cortex av stereotaktisk kirurgi. Post-oppkjøpet bestemmelse av årvåkenhet stater (våkenhet, NREM søvn, og REM søvn) er gjennomført i henhold til parametrene ervervet fra ECoGs, EMG, hjernetemperatur og bevegelsesaktivitet. Detaljerte kriterier for kategorisering av dyrets oppførsel i både rotter og mus er beskrevet i than protokollen.
Både rotter og mus må bedøves med en lav dose av zoletil (25 mg / kg), som er halvparten av den dosering av bedøvelse som normalt administreres i løpet av stereotaksisk kirurgi, før utfører manuell akupunktur eller EA. Denne dosen kan dyrene våkne opp 30 til 35 minutter etter injeksjonen. Enten manuell akupunktur eller EA blir utført ved begynnelsen av den mørke perioden, med et konstant tidsrom på 30 min, og hvert dyr blir behandlet etter hverandre i to til tre dager. Stimulerende EA strømmer som leveres til et bestemt acupoint gjennom en rustfritt stål nål som settes inn i acupoint. Den stimulus strøm er et tog av bifasiske firkantede pulser, hvor pulsvarigheten er 150 ms, og stimuleringen intensitet er 1 mA. Hvis en tørr nål brukes for manuell akupunktur, blir satt inn i akupunktene nål rykket 10 ganger hvert 5. min. Den vanskeligste delen av manuell akupunktur eller EA er å lokalisere akupunkturpunkter i gnagere. den locasjon av akupunkturpunkter i rotter eller mus ligner de anatomiske plassering hos mennesker. For eksempel er de bilaterale Fengchi akupunkturpunkter ligger 3 mm fra bakre midtlinjen på halsen, mellom de to ørene, som er lik sin anatomisk plassering hos mennesker 11. Videre kan akupunktene med lav impedans på huden bli ytterligere bekreftet. Narreakupunktur eller narre EA manipulasjon er nødvendig for akupunktur eller EA eksperimenter. Bør narreakupunktur eller narre EA utføres på en ikke-acupoint ligger nær acupoint, for eksempel i nærheten armhulen 12.
For å kunne undersøke effekten av akupunktur eller EA om epilepsi og epilepsi-indusert søvn forstyrrelser, må følgende faktorer være på plass: en mulig epileptisk dyremodell, presis analyse av epileptiske ECoGs og gjentakelse av epilepsi, en metode for å klassifisere årvåkenhet tilstander og nøyaktig ytelse av akupunktur eller EA hos gnagere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøksprotokoller er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Taiwan University.
1. stereotaxic kirurgi for å implantere ECOG Elektroder, EMG elektroder, Brain Termistor, og Injection guide kanyle
- For rotter (250-350 g, 6- til 8 uker gamle Sprague-Dawley-rotter)
- Anesthetize rottene ved IP-injeksjon med 50 mg / kg zoletil. Bekreft riktig dybde av anestesi ved å observere en mangel på respons etter å knipe bakfot. Påfør øye salve, barbere pelsen, og sterilisere hud med povidon-jod-løsning og 75% etanol. Injisere et antibiotikum (penicillin G) for å hindre smitte.
- Forbered skalpeller, sakser, hemostats, trådnett, og kirurgi maskin for kirurgi. Sterilisere kirurgisk utstyr og trådnett med en autoklav og kirurgi med 75% etanol.
- Plasser et øre bar inn i øregangen og montere rotte til stereotaxis.
- Ved hjelp aven skalpell, lage en tilnærmet 2-cm midtlinjesnitt på skallen langs en linje mellom to ørene, flytting caudally. Clip huden klaffer med hemostats å avsløre skallen og fjerne vev over skallen ved hjelp av en skalpell.
- Bor åtte hull (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 og R2), hvert lag 0,7 mm i diameter, på skallen med et roterende verktøy. Skru åtte ECOG elektroder på frontpartiet, parietal og occipital lobes og lillehjernen i både venstre og høyre hjernehalvdel. Disse elektroder anvendes for fokal epilepsi deteksjon.
- Bruk følgende koordinater for opptak elektroder: frontal (F1 og F2): 2,0 mm anterior til Bregma og 2,5 mm fra midtlinjen, parietal (P1 og P2): -2,0 mm anterior til Bregma og 3,0 mm fra midtlinjen og occipital (O1 og O2): -5,5 mm anterior til bregma og 3,0 mm fra midtlinjen.
- Plasser to referanseelektroder (R1 og R2) over lillehjernen (-11,0 mm anterior til Bregma og 4,0 mm fra midline).
- I en separat grupper av rotter, bore tre hull og plassere to skrue EEG elektroder over høyre frontal (F2) og parietallappene (P2) av ekser med samme koordinater som beskrevet i trinn 1.1.5.1. Plasser en tredje EEG elektrode over venstre lillehjernen (R1), som tjener til å jorde dyr og redusere signal gjenstander. Disse elektroder blir brukt til å bekrefte generalisert epilepsi og analyse av årvåkenhet etapper.
- Skill nakke hud og muskel og sette inn to EMG elektroder inn i halsen muskel.
- Bor et hull på skallen og plassere en mikroinjeksjon guide kanyle i venstre CEA (AP, 2,8 mm fra bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm i forhold til bregma) hos rotter. Koordinatene er tilpasset fra Paxinos og Watson rotte atlas 10.
- Bore et større hull (med en diameter på 1,6 mm) på skallen og sette inn en kalibrert 30-kV termistor på overflaten av parietal cortex, som vil bli sementert senere, for å Monitor det kortikale temperatur i rotter.
- Bruk gasbind og kirurgi for å stoppe blødning når det skjer.
- Route de isolerte ledningene fra ECOG elektroder og EMG elektroder til en pidestall og koble termistoren til fortøyningen. Cement pidestallen og veilede kanyle til skallen med dental akryl.
- Unn snittet lokalt med Polysporin (bacitracin sink / polymyxin B sulfat) for å hindre smitte. Gi dyrene både ibuprofen og penicillin G i vann i en uke etter operasjonen.
- For mus (20 - 30 g, 6- til 8 uker gamle C57BL / C mus)
- Anesthetize mus ved IP-injeksjon med 50 mg / kg zoletil og bekrefte riktig dybde av anestesi ved å observere en mangel på respons etter å knipe bakfot. Påfør øye salve. Etter barbering av pels, sterilisere hud med povidon-jod-løsning og 75% etanol. Injisere et antibiotikum (penicillin G) for å hindre smitte.
- Plasser et øre bar inn i øregangen ogmontere mus til stereotaxis.
- Ved hjelp av en skalpell, foreta en tilnærmet 1,5 cm midtlinjesnitt på skallen langs en linje mellom de to ører, flytting kaudalt. Clip huden klaffer med hemostats å avsløre skallen og fjerne vev over skallen med en skalpell.
- Poke to hull på skallen med kirurgiske sakser og plassere to ledningen ECOG elektroder på høyre frontallappen (F2: +2,0 mm til Bregma og 1,5 til midtlinjen) og venstre isselappen (P1: -3.0 mm til Bregma og -2,5 mm til midtlinjen).
- Skill nakke hud og muskel og sette inn to EMG elektroder inn i halsen muskel.
- Koble de isolerte ledningene fra ledningen ECOG elektroder og EMG elektroder til de kvinnelige terminaler og til en 2.54-mm-kontakt, og deretter sement til skallen med dental akryl.
- Unn snittet lokalt med Polysporin (bacitracin sink / polymyxin B sulfat) for å hindre smitte. Gi dyrene både ibuprofen og penicillin G i vann for en week etter operasjonen.
- Tillat alle dyr for å gjenvinne i syv dager før initiering av forsøkene.
- Huset rotter eller mus separat, i enkelte opptaks bur, i det isolerte rom hvor temperaturen holdes ved 23 ± 1 ° C og lys: mørke (L: D) rytme blir styrt i en 12: 12-timers syklus (40 W x 4 rør belysning). Gir mat og vann ad libitum.
- Koble ECOG, EMG, og termistor gjennom en tjore til forsterkerne en uke etter operasjonen for å starte opptak.
2. Etablering av Focal TLE Epilepsi, SE, og spontant Regelmessig Epilepsi
- for rotter
- Administrer 0,5 mL av pilokarpin (2,4 mg / mL) i venstre CEA gjennom injeksjons guide kanyle ved hjelp av en mikroinjeksjon pumpe. Injeksjonsraten bør settes til 0,2 mL / min for å indusere samlings TLE.
- IP injisere 300 mg / kg pilokarpin for å indusere generalisert epilepsy med tilbakevendende SE.
- for mus
- IP administrere PTZ (0,035 mg / g musekroppsvekt) ved et spesielt punkt ZT annenhver dag. Fem påfølgende injeksjoner kan føre til utvikling av spontant og recurrently generalisert epilepsi.
- For både rotter og mus
- Forsterker ECOG signaler ved 5000 og filtrere den analoge båndpass mellom 0,1 og 40 Hz.
- Bruk en A / D-konvertering av brettet for å konvertere de analoge ECoGs signaler til digitale signaler med en 128-Hz samplingsfrekvens.
- Bruke en programvare for visuell skåring og analysere starten og varigheten av epilepsi. Måle tidsskalaen for å representere varigheten.
- Definer ECOG epilepsi av utseendet epileptiske pigger med amplituder større enn 2 mV og med varighet på mer enn 30 s 13.
3. Klassifisering av Årvåkenhet States
- for rotter
- Bestem årvåkenhet tilstander ved hjelp av parametere anskaffet fra ECoGs, EMG, hjerne temperaturer og bevegelse innenfor en 12-s episode av opptaket. Koble ECOG, EMG, og termistor gjennom en tjore til forsterkerne en uke etter operasjonen for å starte innspillingen. Resultat statene med en skreddersydd programvare i henhold til trinn 3.1.5 - 3.1.7.
- Mål locomotor aktiviteter ved hjelp av en infrarød bevegelsesdetektor, integrere signalene hver 1 s, og lagre signalene.
- Mål kortikal temperatur og lagre signalene.
- Gi din årvåkenhet statene i henhold til våre tidligere definerte kriterier 14.
- Resultat våkenhet ved hjelp av følgende egenskaper: liten amplitude ECoGs med høy frekvens spektra, høyere delta strøm (0,5 til 4,0 Hz), og lavere theta strøm (6,0 til 9,0 Hz); dominerende bevegelsesaktivitet; høy EMG aktivitet; og gradvis øke cortical temperatur.
- Resultat NREM søvn ved hjelp av following egenskaper: delta-bølge dominerende ECoGs med store amplituder, falt EMG aktivitet, redusert kortikal temperatur, og ingen bevegelsesaktivitet.
- Resultat REM søvn ved hjelp av følgende egenskaper: redusert amplitude av ECoGs med den dominerende theta frekvens, plutselig økt kortikal temperatur, minimal EMG aktivitet og lav bevegelsesaktivitet med kroppen rykninger.
- for mus
- Gjenta klassifisering av årvåkenhet tilstander i mus som ble utført på rotter, bortsett fra det er ingen cortical temperatur registrert fra termistoren.
4. Gjennomføring av manuell akupunktur og EA i rotter
- Rotten bedøves for EA-protokollen.
- Finn acupoint av anatomi og bekreft lav hudimpedansen på acupoint. Lyset blinker når detektere lave hudimpedansen. Merk: Fengchi akupunkturpunkter er plassert 3 mm fra bakre midtlinjen værelom de to ører, på halsen.
- Sett av rustfritt stål nåler inn akupunktene i en dybde på 2 mm.
- Twitch de innsatte nåler 10 ganger hvert 5 min.
- Ved hjelp av en funksjonell elektrisk stimulator, leverer et tog av pulser bifasiske (150-us varighet hver) med en intensitet på 1 mA til akupunkturpunkter gjennom nålen.
- Utfør et narreakupunktur eller hykle EA som en kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finnes forskjellige rotte- og musemodeller for å tilfredsstille behovene til forskjellige epilepsi typer. Å indusere focal TLE, 0,5 mL av pilokarpin (2,4 mg / mL) administreres i venstre CEA. De dominerende epileptiske ECoGs er ervervet fra ECOG elektrode på parietallappen av venstre hemisfære (Figur 1A: b), og sjeldne epileptiske aktiviteter er plukket opp fra resten av ECOG elektroder (figur 1A: a, c, d, e og f) når pilokarpin administreres. Epileptiforme ECoGs primært registreres umiddelbart etter pilokarpin administrasjon. Disse resultatene er adoptert fra 8. Disse resultatene indikerer vellykket induksjon av fokal TLE i rotter etter direkte injeksjon av lav-dose pilokarpin i CEA.
Innen 5 min, IP ijection på 300 mg / kg pilokarpin induserer alvorlige kolinerge effekter på atferd, som for eksempel piloereksjon, spyttsekresjon, røde øyne, skjelving, og ansikts automatisms. Alvorlighetsgraden av disse atferdsmessige tegn øker gradvis til en ECOG generalisert anfall oppstår (figur 1B, blå boks). SE oppstår også som følge av generalisert epilepsi (figur 1B, rød boks). Disse resultatene er adoptert fra 13. Våre resultater tyder på at en IP-injeksjon av 300 mg / kg pilokarpin er en pålitelig metode for å indusere ECOG-dokumentert generalisert epilepsi og SE. Imidlertid er overlevelsesraten etter SE utvikling mellom 15% og 20%. PTZ-kindling epilepsimodell hos mus brukes til å utvikle spontant og recurrently generalisert epilepsi. PTZ i en dose på 0,035 mg / g kroppsvekt mus er injisert IP ved et bestemt punkt ZT (f.eks begynnelsen av mørkeperioden ZT13) er annenhver dag, og hver injeksjon adskilt av en en-dagers intervall. Det er ingen epileptiformECoGs funnet under den mørke perioden etter 1. injeksjon av PTZ (figur 1C: a) eller under følgende mørketiden, når det er en av dag for injeksjon (figur 1C: b). Ingen signifikant epileptisk aktivitet er funnet etter 2., 3., og 4. injeksjoner (data ikke vist her). Imidlertid er epileptiske ECoGs induseres etter den 5. PTZ-injeksjon (figur 1C: c og d), sammen med spontant og recurrently generalisert epilepsi (figur 1C: e og a ').
Vi klassifisert årvåkenhet tilstander i våkenhet, NREM søvn, og REM søvn i henhold til kriteriene vi nevnte i protokollen. Våkenhet er visuelt scoret av desynchronized ECoGs med lav amplitude og høy frekvens. strømtetthetsverdier i deltafrekvensbåndet (0,5 til 4 Hz) er generelt større enn de itheta frekvensbåndet (6 - 9 Hz) under våkenhet, og mer høyfrekvent spektra (> 10 Hz) blir funnet. Våkenhet viser en høy amplitude av EMG og massevis av bevegelsesaktivitet. Videre gradvis øker kortikal temperatur når årvåkenhet statlige transporter fra enten NREM søvn eller REM-søvn til våken tilstand (figur 2). NREM-søvn er karakterisert ved synkroniserte ECoGs med høy amplitude og lav frekvens. makt tetthetsverdier de er dominerende i deltaet frekvensbåndet. EMG amplitude gradvis avtar, og ingen bevegelsesaktivitet er utstilt under NREM søvn. Kortikale temperaturen synker når årvåkenhet statlige transporter fra våkenhet til NREM søvn (figur 2). Under REM søvn i en ECOG-bølge desynkronisert, amplituden reduseres, oppstår det dominerende EEG effekttettheten i theta frekvens (6,0-9,0 Hz), EMG-aktivitet er den laveste, fasisk legeme rykk observeres, og kortikale temperatur øker hurtig(Figur 2).
Vi demonstrerte de forskjellige virkninger av EA for epileptisk aktivitet når EA stimulerer Fengchi akupunkturpunkter med enten et høyfrekvent stimulering (100 Hz) eller en lav-frekvens stimulering (10 Hz). I figur 3A, en mikroinjeksjon av 0,5 ul av pilokarpin (2,4 mg / mL) i den venstre CEA induserer fokal TLE, som nevnt tidligere (B). Men 100-Hz EA bilaterale Fengchi akupunkturpunkter forverrer pilokarpin-indusert epileptiske ECoGs (C). Disse resultater er tilpasset fra 8. I motsetning til 10-Hz EA bilaterale Fengchi undertrykker pilokarpin-indusert epileptiske ECoGs (Figur 3B: C). Disse resultater er tilpasset fra 7. Administrering av pilokarpin inn i venstre CEA undertrykker også NREM søvn i løpet av lys periode av 12-timers lys: mørke-syklus (figur 4A og 4B). Reduksjonen av NREM søvn i løpet afew timer mørketiden er først og fremst på grunn av effekten av anestesi, og er ikke en direkte effekt av EA 15. Påføring av 100-Hz EA forverres ytterligere pilokarpin-indusert undertrykkelse av NREM søvn (figur 4A). I kontrast, en 10-Hz EA bilaterale Fengchi akupunkturpunkter øker NREM søvn per se i løpet av mørketiden og blokkerer pilokarpin-indusert reduksjon i NREM søvn i løpet av lys perioden (figur 4B). Disse resultatene er adoptert fra 9.
Figur 1: Ulike Epilepsi Modeller i rotter og mus. A viser det sentrale TLE i rotter. B elucidates generalisert epilepsi med SE hos rotter. C viser den spontane og tilbakevendende epileptiske ECoGs. (A) (a), (b), (c), (d), (e) og (f) representerer ECog registrerte signaler fra elektroder plassert på venstre frontal, venstre isse, venstre occipital, høyre frontpartiet, høyre isse, og høyre occipital cortices, henholdsvis. (B) Pilen indikerer IP injeksjon av pilokarpin. Den grå boksen (a) demonstrerer baseline ECoGs innhentet før pilokarpin injeksjon. Den blå boksen viser epileptiske ECoGs av generalisert epilepsi. Den røde boksen (b) representerer SE. De ECOG signaler trukket ut fra (a) og (b) er vist i (a ') og (b'). (C) (a) representerer ECoGs ervervet etter 1. PTZ injeksjon og (b) representerer ECoGs registrert dagen etter den 1. PTZ injeksjon i mus. Epileptiske aktivitetene skjer etter 5 th PTZ injeksjon (c) og etterpå. Den tilbakevendende epileptiske ECoGs som skjer dagen etter 5 th PTZ injeksjon er vist i (d). Den tilbakevendende epileptiske ECoGs registrert 5 dager etter 5 th PTZ injeksjon er vist i (e) . Figuren nederst (en) representerer ECoGs hentet fra den røde boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Klassifisering av Årvåkenhet States: våkenhet, NREM søvn, og REM søvn. Årvåkenhet tilstander av rotter er klassifisert av parametrene fra ECoGs, ECOG spektra, EMGS, bevegelsesaktivitet, og kortikal temperatur. Årvåkenhet tilstander av mus er preget av de samme parametrene, bortsett kortikal temperatur er ikke aktuelt.
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Figur 3: Virkninger av 100 Hz og 10 Hz EA på epilepsi. I (A), demonstrerer den første ECOG spor grunnlinjen ECoGs (a). Mikroinjeksjon av pilokarpin inn i venstre CEA induserer fokal TLE (b). Påføring av 100-Hz EA på bilaterale Fengchi akupunkturpunkter forverrer epileptiske ECoGs (c). I (B), demonstrerer den første ECOG spor baseline ECoGs (a). Den mikroinjeksjon av pilokarpin inn i venstre CEA induserer fokal TLE (b). Anvendelsen av 10-Hz EA ved bilaterale Fengchi akupunkter undertrykker epileptiske ECoGs (c). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Virkninger av 100 Hz og 10 Hz EA på Epilepsy-indusert søvn forstyrrelser. (A) Focal TLE indusert ved mikroinjeksjon av pilokarpin inn i venstre CEA reduserer NREM søvn i løpet av lys periode. 100 Hz EA forverres epilepsi-indusert søvnforstyrrelser videre. (B) Anvendelse av 10-Hz EA blokkerer epilepsi-induserte reduksjon av NREM søvn i løpet av lysperioden. Videre 10 Hz EA forbedrer NREM søvn i løpet av mørketiden. Verdier er representert som gjennomsnitt ± SEM. Den svarte sirkelen representerer verdiene oppnådd før mikroinjeksjon av pilokarpin, viser den åpne sirkelen dataene ervervet etter pilokarpin injeksjon, og den åpne trekanten viser verdiene oppnådd etter EA stimuli. Den svarte linjen representerer den mørke perioden av 12-timers lys: mørke syklus, og den hvite linjen viser lyset periode. * Representerer den statistiske forskjellen mellom 100-Hz EA + pilokarpin og kontrollgruppen (ANOVA, P <0,05) og # indikerer statistisk stilles på forskjelligee mellom 10 Hz EA + pilokarpin-gruppen og pilokarpin gruppe (ANOVA, p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å velge en mulig epilepsi dyremodell er essensiell for hver eksperimentelle formål. Et av våre mål er å belyse effektene av EA på epilepsi undertrykkelse. EA er en alternativ medisin som kan utvise terapeutisk effekt ved epilepsi og har blitt dokumentert i gamle kinesiske litteratur. Men det er en mangel på vitenskapelig bevis for å bevise det. For å fastslå effekten av EA på epilepsi, vi primært fokusert på effekten av EA på mild fokal epilepsi, snarere enn på alvorlig generalisert anfall eller SE. Vår tidligere studie brukte et samlings TLE modell hos rotter for å demonstrere effekten av lav frekvens (10 Hz) og høy frekvens (100 Hz) EA bilaterale Fengchi akupunkturpunkter på pilokarpin-indusert fokale TLE og fokale TLE-indusert søvn forstyrrelser 7- 9. Våre resultater tyder på at 10-Hz EA bilaterale Fengchi akupunkturpunkter undertrykker samlings TLE og søvn avbrudd, mens 100-Hz EA forverrer både samlings TLE og TLE-induserte søvnforstyrrelser. Et annet eksempel er to demonstrere effekten av dyp hjernestimulering på refraktær epilepsi, spesielt generalisert anfall og SE. Vi har fastslått at ensidig dyp hjerne stimulering av fremre kjernen i thalamus (ANT) med høy frekvens og lav intensitet strømmer med hell hindrer tilbakefall av generalisert epilepsi og varigheten av SE-13. Vi har også utviklet spontant og recurrently generalisert epilepsi med PTZ-kindling metode i mus. Dette PTZ-opptenningsved modellen kan bli mye brukt til epilepsi studier. Det kritiske trinnet for å etablere disse epilepsimodeller er bruken av passende doser. En mikroinjeksjon av større mengder pilokarpin inn i CEA kan utvikle sekundær generalisert epilepsi. IP administrering av mer enn 300 mg / kg pilokarpin induserer generalisert epilepsi og SE; Men, de fleste rotter ikke overleve etter at SE utviklet. I tillegg doser lavere enn 280 mg / kg kunne ikke lykkes å etablere generalisert epilepsi og SE. Det samme situation skjer med PTZ-kindling modell. Større doser av PTZ kan forårsake SE, men mange mus som ikke overleve. I motsetning til dette lave doser av PTZ krever flere injeksjoner for å etablere spontant tilbakevendende epilepsi.
Klassifiseringen av ulike årvåkenhet tilstander hos rotter og mus er i hovedsak basert på funksjonene i polysomnografi spilt inn fra mennesker. Vi endret protokollen for å analysere sove-våkne aktivitet ved de verdiene som er registrert fra ECOG, spektral fordeling, EMG, bevegelsesaktivitet, og kortikal temperatur. Det som kjennetegner ECOG, spektral fordeling, EMG, lokomotorisk aktivitet, og kortikal temperatur er tatt opp fra våkenhet og NREM-søvn er lik de som er ervervet fra mennesker. Imidlertid er REM søvn noen ganger tvetydig og vanskelig å klassifisere i gnagere. Mest litteratur beskriver REM-søvn hos gnagere i henhold til sine ECoGs og EMGS. Den theta frekvensbåndet av ECoGs er dominerende og muskel tone av EMG er lavest når rotter eller mus enre i REM søvn. For å øke tilliten til scoring REM søvn, registrerte vi ytterligere bevegelsesaktivitet og kortikal temperatur. Phasic kroppen rykk er observert og kortikal temperaturen øker raskt når rottene skriv REM søvn. Lokomotorisk aktivitet og kortikal temperatur, i tillegg til de ECoGs, spektrale fordeling, og EMGS, forbedre nøyaktigheten for REM-søvn analyse. Jo flere parametre som er inkludert, kan mer presise klassifikasjoner gjøres.
To hovedpunkter har alltid blitt kritisert når forskere utføre manuell akupunktur eller EA eksperimenter. Det første problemet er hvordan forskere identifisere og bekrefte akupunktene hos rotter. Meridian systemet og akupunkturpunkter i mennesker er godt etablert, men det er ingen meridian system og acupoint kartet bekreftet hos gnagere. Derfor er den lokalisering av akupunkturpunkter tilsvarende hos gnagere bestemt i henhold til den relative anatomisk lokalisering. For eksempel, Fengchi akupunkturpunkter (GB 20) ersom ligger i fordypningen mellom det øvre parti av musculus sternocleidomastoideus og musculus trapezius hos mennesker. Vi fant den tilhørende anatomiske beliggenhet i gnagere og ytterligere bekreftet det ved å måle lav hudimpedansen. Impedansen til en acupoint er lavere enn den omgivende hud. Det andre problemet er hvordan akupunktur doser er kontrollert i løpet av eksperimentet. Hvis manuell akupunktur anvendes for forsøket, bør manipulering av rykninger nålen skal utføres av den samme forsker på samme måte for hver manipulasjon. Det ville være lettere å kontrollere akupunktur dose hvis EA er brukbar, da EA sikrer en konsistent stimulering frekvens og strømstyrke. Videre i analgesi, viser EA mer effektivitet enn manuell akupunktur 16. Imidlertid kan manuell akupunktur og EA med lavfrekvent og høyfrekvent stimulering på samme acupoint aktivere forskjellige områder av hjernen til 17, noe som kan innebære forskjellig underlying mekanismer.
Oppsummert, dette papiret demonstrerer flere kjemiske-indusert epileptiske modeller i rotter og mus, inkludert fokus TLE, generalisert epilepsi, SE, og spontant og recurrently generalisert epilepsi. Vi har også etablert den tradisjonelle og raske elektriske-opptenningsved epileptisk modell hos rotter. Hvis lesere er interessert i den elektriske-kindling modell, se Referanser 4 og 5. Vi tilbyr også kriteriene for å analysere sove-våkne aktivitet hos rotter og mus. For å evaluere effekten av EA på epileptisk aktivitet og søvn, beskriver vi hvordan å lokalisere de relaterte acupoints hos rotter og hvordan du utfører akupunktur, og vi presenterer også noen representative resultater for å demonstrere effekten av EA om epilepsi og epilepsi-indusert søvnforstyrrelser .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
