Introduction
Um dos principais desafios da saúde no século 21 são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação 1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD.
Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada 2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos 3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível 4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular.
Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS 5.
espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação 6 - 8. RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados 6 - 8. Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações 9.
na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) 10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.
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Protocol
1. Produção de 15 N, 13 C-tau (Figura 1)
- Transformar pET15b-tau recombinante de T7 expressão plasmídeo 13,14 em BL21 (DE3) competente de Escherichia coli, células bacterianas 15.
NOTA: o ADNc que codifica para o mais longo (441 resíduos de aminoácidos) isoforma da tau é clonado entre os locais de restrição Ncol e Xhol no plasmídeo pET15b.- Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 7 colónias por ug de DNA de plasmídeo, com 100 ng de DNA de plasmídeo em um tubo de plástico de 1,5 ml BL21 competente.
NOTA: Codon-uso otimizado estirpes bacterianas para a expressão de cDNA eucariótica não são essenciais para a produção de Tau humana. - Coloque a mistura de células em gelo durante 30 min e em seguida choque térmico durante 10 segundos a 42 ° C. Colocar o tubo de volta em gelo durante 5 min e adicionar 1 ml de meio LB à temperatura ambiente (Luria Bertani). Incubar a suspensão bacteriana a 37 ° C durante 30 min sob suaveagitação.
- Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 7 colónias por ug de DNA de plasmídeo, com 100 ng de DNA de plasmídeo em um tubo de plástico de 1,5 ml BL21 competente.
- Espalhe usando uma ansa de inoculação de 100 uL de suspensão de células uniformemente sobre uma placa de agar de meio LB contendo 100 ug / ml do antibiótico ampicilina.
- Incubar a placa de selecção durante 15 horas a 37 ° C.
- Manter a placa de selecção, a 4 ° C até se proceder à etapa de cultura, para um máximo de cerca de 2 semanas.
NOTA: um stock de glicerol de cultura bacteriana (50% de glicerol), armazenada a -80 ° C, pode ser preparado para iniciar a cultura, numa fase posterior. - Adicionar 1 ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de CaCl 100 mM de 2, 10 ml de 100x MEM vitamina complemento, 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina para 1 L de sais M9 autoclavados (6 g de Na 2 HPO 4, 3 g de KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl).
NOTA: se um precipitado branco irá formar após a adição da solução de CaCI2 para os sais M9 que se dissipa rapidamente. - Solubilizar 300 mg de N 15, média 13 C-completo, 1 g de 15De NH 4 Cl e 2 g de 13 C 6 -glucose em 10 ml de meio M9. Filtro-esterilizar a solução isótopo utilizando um filtro de 0,2 um, directamente para o meio M9.
- Suspender usando um laço de inoculação uma colónia de pET15b-Tau bactérias transformadas a partir da placa de selecção em 20 ml de meio LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina.
- Incubar o meio inoculado a 37 ° C durante cerca de 6 h.
- Medir a densidade óptica a 600 nm (OD 600) em 1 ml de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro.
NOTA: turbidez da cultura bacteriana correspondente a DO600 de 3,0-4,0 indica que a fase de crescimento de saturação é atingida. - Adicionar 20 ml da cultura LB saturado a 1 L de meio de crescimento M9 suplementado com ampicilina (100 ug / ml de concentração final), em 2 L de Erlenmeyer frasco de cultura de plástico confundido.
- Colocar o frasco de cultura numa incubadora programável definido para 10 °C e 50 rpm. Programar a incubadora para mudar para 200 rpm e 37 ° C no início da manhã do dia seguinte.
- Medida OD600 em 1 ml de cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro. Adicionar 400 ul de 1 M de IPTG (β-D-1-tiogalactopiranosido de isopropilo) solução de estoque (mantido a -20 ° C) quando DO600 atinge um valor de cerca de 1,0 a induzir a expressão da proteína tau recombinante.
- Continuar a incubação a 37 ° C durante mais 3 h. Recolher as células bacterianas por centrifugação a 5000 xg durante 20 min.
- Congelar o sedimento bacteriano a -20 ° C. Manter congelado até que o passo de purificação, por um período prolongado, se necessário.
2. A purificação de 15 N, 13 C-tau (Figura 2)
- permuta catiónica autoclave (CEX) tampões de purificação a 121 ° C sob 15 psi durante 20 min. buffers armazenar a 4 ° C.
- Descongelar o sedimento de células bacterianas e ressuspender completamente em 45 mlextracção de CEX num tampão (50 mM de tampão NaPi, pH 6,5, EDTA 1 mM) suplementado fresco com 1x cocktail inibidor de protease (1 comprimido) e DNAseI (2000 unidades).
- Dissociação das células bacterianas, utilizando um homogeneizador de alta pressão a 20000 psi. 3-4 passagens são necessárias. Centrifuga-se a 20000 xg durante 40 min para remover o material insolúvel.
- Aquecer o extracto de células bacterianas durante 15 min a 75 ° C usando um banho de água.
NOTA: um precipitado branco é observada depois de alguns minutos. - Centrifugar a 15000 xg durante 20 min e manter o sobrenadante contendo a proteína tau estável ao calor.
- Armazenar a -20 ° C até que o seguinte passo de purificação, se necessário.
- Executar uma cromatografia de permuta catiónica numa resina de CEX fortes embalado como uma coluna de 5 mL utilizando um leito de proteína rápida sistema de cromatografia líquida (FPLC) (Figura 3 A).
- Ajustar a taxa de fluxo de 2,5 ml / min.
- Equilibrar a coluna em tampão A CEX
- Carregar a 60-70 ml heated-extracto contendo tau utilizando uma bomba de amostra, ou alternativamente bomba A, dependendo do sistema. Recolhe-se o fluxo através de análise para verificar que a proteína de tau é eficiente ligação à resina (ver 2.8).
- Lava-se a resina de CEX com um tampão até que a absorvância a 280 nm é de volta ao valor da linha de base.
- Eluir tau a partir da coluna usando um gradiente de NaCl em três fases obtidas por aumento progressivo de tampão B CEX (CEX Um tampão com 1 M de NaCl). Programa do FPLC como se segue: primeiro passo do gradiente de 25% de tampão de CEX B em 10 volumes de coluna (CV) para chegar a 250 mM de NaCl, segundo passo de 50% de tampão de CEX B em 5 VC de alcançar NaCl 500 mM, e o terceiro passo a 100% de tampão B, em CEX 2 CV para chegar a 1 M de NaCl. Recolha fracções de 1,5 ml durante os passos de eluição.
- Analisar 10 ul das fracções recolhidas durante o passo de eluição por SDS-PAGE (12% de gel de SDS-acrilamida) e coloração com Coomassie (Figura 3 A) 16. Verificar o passo de carregamento sobre a coluna, assim por Analyzing 10 ul de fluxo de passagem.
- Escolha as fracções contendo tau e agrupar as fracções para o passo seguinte.
- Executar uma troca de tampão em frações Tau contendo agregados (Figura 3 B).
- Equilibrar a coluna de dessalinização de 53 ml de G25 resina de leito fixo (26 x 10 cm) em bicarbonato de amónio 50 mM (tampão volátil) utilizando um sistema de FPLC.
- Ajustar a taxa de fluxo de 5 ml / min. Injectar a amostra Tau em coluna através de uma ansa de injecção de 5 ml. Recolha fracções correspondentes ao pico de absorção a 280 nm.
- Repetir a injecção 3-4 vezes, dependendo do volume da piscina CEX inicial.
- Calcula-se a quantidade de proteína tau purificada usando a área do pico do cromatograma de 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mAU * mL).
NOTA: O coeficiente de extinção da proteína tau a 280 nm é 7550 M -1 cm -1. O Tau não contém quaisquer resíduos de Trp. - Piscina todas as fracções Tau.
- aliquot a amostra para tubos contendo o equivalente a 1 a 5 mg de Tau. Escolha estes tubos de modo que o volume da solução é pequeno comparado com o volume do tubo (por exemplo, 5 ml de solução em um tubo de 50 ml).
- Faça furos nas tampas de tubos usando uma agulha. Congele as amostras Tau-se a -80 ° C.
- amostras Liofilizar Tau. proteína Tau liofilizado pode ser conservado a -20 ° C durante longos períodos de tempo.
3. A fosforilação in vitro de 15 N-Tau
- Dissolve-se 5 mg de liofilizado da tau em 500 ul de tampão de fosforilação (Hepes 50 mM-KOH, pH 8,0, MgCl 2 12,5, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM).
- Adicionar ATP 2,5 mM (25 ul de uma solução de estoque 100 mM mantida a -20 ° C), 1 mM de DTT (1 ul de uma solução de estoque 1 M mantido a -20 ° C), 1 mM de EGTA (2 ul de um estoque 0,5 M solução), 1x cocktail inibidor de protease (25 ul de uma estoque 40x obtida por dissolução de um comprimido em tampão de fosforilação 1 ml) e 181; H activado His-ERK2 (250 ul em tampão de conservação 10 mM de Hepes, pH 7,3, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, NaCl 100 mM e glicerol a 10%, armazenado a -80 ° C) num volume total de amostra de 1 ml.
NOTA: O activada His-ERK2 pode ser preparada in-house 5,8 por fosforilação com a quinase MEK. - Incubar 3 horas a 37 ° C.
- Aquece-se a amostra a 75 ° C durante 15 minutos para inactivar a quinase ERK.
- Centrifugar a 20000 xg durante 15 min. Recolher e guardar o sobrenadante.
- Dessalinizar a amostra de proteína em bicarbonato de amónio 50 mM, utilizando uma coluna de 3,45 ml de G25 resina de leito empacotado (1,3 x 2,6 cm), que é apropriado para uma amostra de 1 ml.
- Executar um 12% de SDS-PAGE a 16 com 2,5 mL da amostra de proteína, para verificar a sua integridade e a fosforilação eficiente (Figura 4).
- Liofilizar a amostra tau fosforilada. Armazenar o pó a -20 ° C.
4. A aquisição de espectros (Figura 5)
- Solubiliza-se 4 mg de liofilizado de 15 N, 13 C-ERK fosforilada-tau em 400 ul de tampão RMN (NaPi 50 mM ou 50 mM de Tris-deuterados .cl D11, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM e DTT 1 mM).
- Adicionam-se 5% de D 2 O para o bloqueio de campo do espectrómetro de RMN e TMSP 1 mM (3- (trimetilsilil) 4 sal de sódio de ácido propiónico-2,2,3,3-d)) como sinal de referência RMN interna. Adicionam-se 10 ul de uma solução de estoque de 40x cocktail completo de inibidor de protease.
- Transfira a amostra num tubo de RMN de 5 milímetros usando uma seringa com uma agulha electrónico longo ou pipeta de Pasteur. Fechar o tubo de RMN utilizando o êmbolo. Remover qualquer bolha de ar presa entre êmbolo e líquidos por movimentos de êmbolo.
- Coloque o tubo de RMN em um spinner. Ajustar a sua posição vertical no elemento rotativo com o calibre adequado para a cabeça da sonda de RMN utilizado, de tal modo que a maior parte da solução da amostra estará dentro da bobina de RMN.
- Inicie o fluxo de ar: clique elevador in janela do sistema de controle imã. Cuidadosamente colocar o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do magneto. Parar o fluxo de ar (clique elevador) e deixar o tubo descer no lugar dentro da cabeça sonda no ímã.
- Ajuste da temperatura a 25 ° C (298 K).
- Executar o ajuste semi-automático e correspondência da cabeça da sonda para otimizar a transmissão de energia. Digite ATMM na linha de comando.
- Bloquear a frequência espectrómetro usando o sinal D 2 O, a amostra gravada no canal de deutério. Clique cadeado na janela do sistema de controle imã.
- Iniciar o procedimento de calços para optimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra. Digite topshim gui na linha de comando para abrir a janela calço. Clique em Iniciar na janela de calço. Verifique o valor da variação padrão B0 residual para verificar se os calços são ideais (menos de 2 Hz é bom).
- Calibrar o parâmetro P1 (comprimento de um protãoimpulso de radiofrequência em ms), o que é necessário para se obter uma rotação de 90 ° de protão rotações. Alvo para o pulso de 360 ° usando um espectro 1D dos protões da água (Figura 6).
- Ajustar o deslocamento definindo o parâmetro o1 (em Hz) para a freqüência de água de prótons no espectro de 1D (Figura 6) frequência.
- Comece a aquisição de um espectro de protão 1D (sequência de impulsos com a sequência comporta para a supressão do sinal da água, por exemplo zggpw5) para verificar os sinais a partir da amostra (Figura 7). Adaptar o número de varreduras com a concentração relativa de proteína. Digite zg na linha de comando para iniciar a aquisição.
- Configurar parâmetros adicionais para a aquisição de um 2D [1 H, 15 N] HSQC espectro (pulso sequência hsqcetfpf3gpsi, as Figuras 8-9).
- Para a 15 N, 13 C rotulado de exemplo, dissociar 13 C durante a evolução indireta 15 N.
NOTA: Adaptar o número de pontos de dados de aquisição para o campo espectrômetro para manter um número semelhante de Hz por ponto e para limitar tempos de dissociação: use 3.072 pontos em 900 MHz e 2.048 pontos em 600 MHz, na dimensão 1H. - Otimizar os parâmetros adicionais nas sequências de pulso, correspondente a atrasos, comprimentos de onda, a compensação frequências, níveis de potência. Tipo ased na linha de comando para exibir todos os parâmetros relevantes para o experimento.
5. Identificação de sítios de fosforilação
- Os espectros de processo utilizando software de aquisição e processamento de RMN.
- Executar uma transformação de Fourier dos dados (Figura 7). Tipo ft para um espectro de 1D, XFB para um espectro 2D ou ft3d para um espectro 3D, na linha de comando.
- Fase e todos os espectros de referência (Figura 7C) utilizando as janelas interactivas.
- Identificar ressonâncias de interesse na HSQC 2D potencialmente correspondente aos resíduos fosforilados Ser e Thr (Figura 9, caixa vermelha).
- Planos de extracção (isto é, 2D 1 H- 13 C espectros) deo espectro de C 3D 1 H- 15 N- 13 usando os desvios químicos de 15N de ressonâncias de interesse no 2D. Usar o cursor de dimensão dois (W2) para escolher a frequência de 15 N correspondente ao plano (W1-W3) para ser visualizado (Figura 10B).
- Escolha as frequências de ressonância de 'CA' e 'CB' 13 C núcleos do 'i' e resíduos 'i-1' (set mais fraca de sinais em comparação com aqueles do resíduo i) para cada [1 H, 15 N] ressonância de interesse no espectro HNCACB 3D clicando na ressonância, no menu do modo de ponteiro encontrar / adicionar pico, para adicionar o valor de desvio químico em um arquivo de lista de pico.
- Identificar o tipo i resíduo, pSer ou Pthr, comparando-se os deslocamentos químicos na lista de pico para valores conhecidos de CA e mudanças CB químicos de pSer e Pthr 17.
- Identificar a presença de um resíduo Pro na posição i + 1 por uma característica adicional 2 ppm O deslocamentof o valor da deslocação CA química 18.
- Comparar os valores dos desvios químicos das ressonâncias Ca e Cb correspondentes ao resíduo i-1 a uma tabela de desvios químicos previstos para os resíduos de aminoácidos da tau 19 para identificar a natureza do resíduo na posição i-1.
- Escolha as frequências de ressonância de 15 N núcleos do 'i' e 'i-1' resíduos para cada ressonância [1 H, 15 N] de interesse no espectro HNCANNH.
- Comparar os valores dos desvios químicos de 15N para a atribuição de desvio químico da proteína Tau 20-23.
- Compare as dip�tidos identificados com a sequência de Tau para definir a atribuição específica de sequência.
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Representative Results
A Figura 3A mostra um pico principal de absorção a 280 nm observados durante o gradiente de eluio. Este pico corresponde à proteína Tau purificada como visto no gel de acrilamida sobre o cromatograma. A Figura 3B mostra um pico de absorção bem separadas a 280 nm e o pico de condutividade, assegurando que a dessalinização da proteína é eficiente. A Figura 4 mostra a proteína de desvio em gel observada por análise de SDS-PAGE a 16 característica de fosforilação de proteínas múltiplas (comparar as pistas 2 e 3). A Figura 6 mostra uma série de protão (1H) os espectros de 1D com o aumento do comprimento de impulso (em ms). Para configurar o comprimento do impulso que vai rodar 1H magnetização rotação de 90 °, um impulso que corresponde a uma rotação de 360 ° é usado na prática, uma vez que é mais fácil de calibrar através da minimização do sinal. O sinal dos protões da água é nulo quando o comprimento de 360 ° pulso é definido adequadamente. O valor correspondente para um 36076; a rotação é então dividido por 4. P1 nesta experiência é de 10,5 ms. Região alargada: A frequência do sinal residual é usado para definir o parâmetro o1p (desvio de frequência para um H). Figura 7 A. mostra um decaimento de indução livre (FID), visualizado para assegurar que um sinal de NMR é detectado. Figura 7B. mostra um espectro H 1D 1 com uma fase incorreta, como visto por ressonâncias aparecem como picos assimétricos. A Figura 7C mostra um espectro H 1D 1 com boa relação sinal-ruído, o que indica que os parâmetros de aquisição de base foram correctamente ajustado e um sinal a partir da amostra de proteína pode ser detectada. A Figura 8 mostra 2D 1 H, 15 N espectros HSQC de 15N recombinante-Tau a 900 MHz; Figura 8A com boa sensibilidade e resolução e Figura 8B. com detecção de proteólise na amostra, como visto pelo aparecimento de PE adicionalaks no espectro (caixa azul) a. A Figura 9 mostra 2D 1 H, 15 N espectros HSQC de 15N recombinante-Tau Figura 9A a 600 MHz, com boa sensibilidade mas menos resolução em comparação com a Figura 8A. A Figura 9B a 600 MHz, mostra aparecimento de picos adicionais no espectro correspondentes aos resíduos fosforilados (caixa vermelha). Figura 9C a 900 MHz, mostra picos no espectro correspondentes aos resíduos fosforilados (caixa vermelha). A resolução é melhor do que na Figura 9B. A Figura 10 A mostra projecções a partir do espectro 3D de RMN utilizados para avaliar uma experiência de sucesso. A Figura 10B mostra um plano 1 H- 13 C extraído do 1 H- 15 N- 13 espectro C 3D com boa intensidade de sinal que permite detectar sinais de 13 C de ambos os I e I-1 resíduos.
Figura 1: Esquema das principais etapas de produção de proteína recombinante e marcação isotópica. A poucos passos da transformação bactérias para a produção de proteína recombinante são descritas como descrito no parágrafo 1 do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema dos principais passos de purificação de proteína tau recombinante. Passos de células bacterianas de lise para a purificação de proteínas recombinantes estão descritos conforme descrito no parágrafo 2 do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.
Figura 3: passos de cromatografia líquida de protocolo. Fracionamento cromatografia (A) de troca catiônica do extracto bacteriano aquecida. A absorvância a 280 nm, 260 nm e da condutividade correspondem, respectivamente, às linhas pretas a cheio e a tracejado e a linha vermelha pontilhada. 12% A análise de SDS-PAGE das fracções recolhidas é mostrada acima do cromatograma. (B) A dessalinização da proteína Tau em um tampão adequado para liofilização. A quantidade de proteína tau purificada estimada a partir da área de pico (2260 mAU * mL) é de 16 mg de TAU. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: 12% A análise de SDS-PAGE de tau. Pista 1, marcador de peso molecular; pista 2, 10 ug de tau; pista 3, 10 ug de tau ERK fosforilado. Tau, como outros deslocados, é executado de uma maneira anómala em SDS-PAGE, com um peso molecular aparente de cerca de 60 kDa em vez do esperado 46 kDa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquema das principais etapas para a preparação de amostras de RMN, RMN de aquisição de dados de espectroscopia e processamento de dados. A poucos passos da preparação da amostra de RMN para aquisição e processamento de dados são descritos como descrito no parágrafo 4 do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura.
Figura 6: Configuração do parâmetro p1 para aquisição de dados de RMN. Este parâmetro é diferente entre as amostras e é principalmente dependente da concentração de sal. Uma curva de nutação 1H padrão para 80% de H2O em D 2 O está mostrado. espectros-scan único com um atraso de reciclagem de 30 segundos foram coletadas e plotado horizontalmente. O pulso (P1) foi variada de 1 ms a 55 ms em passos de 1 ms. Em teoria, o sinal deve ser máxima para um pulso de 90 ° C e igual a zero para um pulso de 180 °. No entanto, na prática, amortecimento de radiação provoca assimetria e distorção de fase problemas que tornam difícil para determinar os 90 ° ou 180 ° pulsos diretamente. O segundo ponto nulo corresponde a uma duração de pulso de 360 °. A região ampliada mostra um sinal residual para uma rotação de 360 ° pulsação que é usado para definir o parâmetro de frequência o1p. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: processamento de dados de RMN. (A) decaimento do sinal de indução gratuito no domínio do tempo. 1D espectros de protões (B) resultante da transformação de Fourier do FID a partir do painel A para o domínio da frequência, mas com fase incorreta (PhC0 -206 °). (C) faseado (PhC0 -113 °) e referenciado (sinal TMSP a 0 ppm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 8: 2D 1 H, 15 N espectros HSQC de 15N recombinante-tau em 900 MHz. 3,072 e 416 pontos de dados de aquisição foram registados utilizando larguras espectrais de 14 e 25 ppm na 1 H (F2) e 15 n dimensões (F1), respectivamente. 16 varrimentos foram registados por incremento F1, levando a uma duração da experiência de 4 h 30 min. (A) da amostra Tau boa amostra da qualidade Tau (B) mostrando a degradação como revelado pelo aparecimento de ressonâncias adicionais em uma determinada região do espectro (alto campo 1 H, baixo campo 15 N), aqui encaixotado em azul. Esta última amostra foi preparada sem os inibidores de protease. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: 2D 1 H, 15 N espectros HSQC de 15N recombinante-tau. (A) tau não fosforilada, 600 MHz espectro (B) tau fosforilada, 600 MHz espectro e (C) fosforilados da tau, 900 MHz espectro. ressonâncias adicionais em uma determinada região do espectro, aqui em caixa em vermelho, são observadas em espectros Tau fosforilada. Estas ressonâncias, as quais correspondem ao protão da amida (1 H- N 15) correlações de resíduos pSer e Pthr, são facilmente visualizado na região em torno 8,5-9,5 ppm para 1 H e 117 a 125 ppm para 15 N, no exterior da massa do 1 H, 15 N correlações do espectro da tau não fosforilada. (A e B) correspondem aos espectros adquiridos a 600 MHz, 2.048 e 256 pontos de dados com larguras espectrais de 14 e 25 ppm foram registados no 1 H (F2) e 15 n dimensões (F1), respectivamente.Foram utilizados 32 exames, ea duração total da aquisição foi de 2 h 44 min e (C) a 900 MHz, 3.072 e 416 pontos de dados em larguras espectrais de 14 e 25 ppm foram registrados no 1 H (F2) e 15 N ( F1) dimensões, respectivamente. Foram utilizados 48 exames, ea duração total da aquisição foi de 6 h 37 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: 3D 1 H, 15 N, 13 espectro de C RMN, projeções e planos 2D extraídos. 2.048, de 72 anos, e 256 pontos de dados foram registrados no 1 H (F3), 15 N (F2), e 13 C (F1) dimensões, respectivamente. As larguras espectrais são 14, 25, e 61 ppm, centrado em 4,7, 119, e 41 ppm no 1 H,15 N e 13 dimensões C, respectivamente. Duração da aquisição usando 16 scans é de 4 dias e 6 horas. Representação (A) do cubo correspondente ao conjunto de dados 3D transformada de Fourier de um espectro HNCACB de Tau-ERK fosforilado obtidos a 600 MHz. O 2D 1 H, 15 N e 1 H, 13 aviões C são obtidas por projeção dos dados 3D ao longo do 13 C e dimensão 15 N, respectivamente. processamento de dados e representação foram feitas usando aquisição RMN e software de processamento. (B) 2D 1 H, 13 C a partir do plano extraída 3D 1 H, 15 N, 13 C RMN conjunto de dados a uma mudança 15N química de 121,8 ppm. Um zoom (à direita) centrada sobre o desvio químico de 1H 9,38 ppm mostra os 13 CA e CB 13 ressonâncias tanto de resíduo i (pThr153) e I-1 (Ala152). A ressonância 13 CB é alias devido à largura dos sjanela pectral. representação gráfica e pico de colheita foram realizadas utilizando software de análise de RMN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada de 15 N, 13 C. Dado o custo de isótopos, um bom rendimento é necessário no passo de expressão recombinante. A glicose é o factor limitante para o crescimento bacteriano no meio M9, por conseguinte, a quantidade de 13 C 6 -glucose pode ser aumentada para 4 g por litro de meio de crescimento para aumentar o rendimento. A adição de vitaminas completas médio e MEM não são obrigatórias, mas ajudar a estimular o crescimento e melhorar o rendimento. Dado o elevado custo do meio marcado completa, este produto é usado apenas como um meio de crescimento suplet. O crescimento bacteriano é lento em meio M9. Geralmente, culturas bacterianas usando mídia M9 suplementado com 3% concluída tempo alcance médio de indução após cerca de 4 horas de incubação. Uma DO 600 de 1,6-1,8 é normalmente obtido no final da cultura. rendimento esperado da proteína Tau recombinante é de cerca de 15 mg por litro de cultura bacteriana. O uso de uma incubadora programável permite programar convenientemente a produção de proteína, recolha do sedimento bacteriano e controlo analítico de produção de proteína durante as horas de dia de trabalho.
A concentração da amostra é importante para se obter um espectro de boa qualidade. Uma amostra típica Tau suficiente para um espectro 2D conteria 1 mg em 200 ul (isto é 100 | iM) A proteína tau. Para um espectro 3D, pelo menos, 200 uM em 300 ul são necessários, desde que uma cabeça de sonda criogénico é usado. O acesso a um espectrómetro de alto campo, tal como o instrumento de 900 MHz usado neste estudo irá proporcionar uma melhor relação sinal-ruídoe reduzir as restrições sobre a concentração da amostra (Figura 8). Dado que a proteína tau é uma grande proteína desordenada, seus espectros de RMN são caracterizados por sobreposição considerável de sinal, e um espectrómetro de RMN de alto campo também será a melhor escolha em termos de resolução (Figura 8). No entanto, as ressonâncias correspondentes aos sítios de fosforilação são numa região distinta do espectro e são fáceis de detectar mesmo com um espectrómetro de 600 MHz (comparar as Figuras 9 e 9-C) B. Além disso, devido à sua natureza desordenada, a proteína Tau é sensível a proteólise (Figuras 8B).
Esterilização de buffers é aconselhado a limitar a degradação Tau. A adição de inibidores de protease para a amostra de RMN ajuda a proteger contra a degradação da tau durante períodos de aquisição de dados que podem durar de horas a dias, dependendo da sequência de impulsos. PH baixo (ou seja, pH abaixo de 7,0) é necessária para a Avoid troca muito rápido entre prótons proteína e prótons de água, o que leva para sinalizar ampliação. O pH da amostra deve também ser bem controlada para assegurar a reprodutibilidade dos espectros. Com efeito, uma vez que os valores de pKa de pSer e Pthr estão perto do pH ideal para a espectroscopia de RMN, os desvios químicos de resíduos fosforilados são muito sensíveis a variações de pH. Ajustamento do pH da amostra de RMN pode ser feita directamente utilizando um medidor de pH com um eléctrodo de pH de micro, adaptado para pequenos volumes. Tau é uma proteína solúvel e não se agregam em condições padrão. A adição de polianiões, tais como sulfato de heparina, e incubação a 37 ° C, pode iniciar a agregação nas amostras de Tau. Neste caso, dada a natureza sólida dos agregados, a maioria das ressonâncias no espectro de RMN correspondentes alargar para além de detecção. Mesmo as amostras de tau fosforilados não agregado nas condições descritas aqui para aquisição de dados de RMN.
Em comparação com a análise de anticorpos, proporciona um O RMNvista verall de PTMs. A espectrometria de massa pode também ser utilizada para identificar o padrão de fosforilação de uma proteína de amostra. rotulagem isotópica não é necessário para esta técnica, e as quantidades de amostra necessários são muito menores. No entanto, a caracterização de uma proteína com vários fosfolarização, tais como a tau, permanece um desafio. fosfolarização adjacentes irá produzir peptídeos isobáricos em estratégias de baixo para cima de identificação. identificação completa, em seguida, precisa de MS / MS sequenciamento dos peptídeos obtidos por proteólise amostra. Uma vantagem de RMN consiste na natureza quantitativa intrínseca da técnica. A intensidade de um sinal de RMN pode ser relacionada com o valor do grupo químico presente num local específico. Podemos assim definir a proporção de modificação química em cada local. A maioria dos progressos recentes em aplicações de MS têm, porém, mostraram que MS de Tau fosforilação múltipla é viável 24, mesmo de forma quantitativa após a normalização adequada 25.
Aqui, nós apresentamos Tau fosforilação de ERK-2 activada, mas a metodologia pode ser utilizada para a fosforilação com outras cinases, bem 6,7,26 - 28. Experimentos cinéticos pode ser realizada, o que pode ajudar a definir a especificidade quinase contra um substrato de proteína 28-31. Estudos de fosforilação não estão limitados a cinases recombinantes, e a actividade de cinase de extractos celulares ou de tecido pode ser analisada 6,32,28. Uma evolução interessante é a utilização de RMN de-célula para estudar em modificações in situ 33,34. Por outro lado, RMN é também bem adaptado para abordar a especificidade da fosfatase, como foi demonstrado pelo estudo da desfosforilação de tau fosforilada pela fosfatase PP2A 35. espectroscopia de RMN pode ser aplicado para a caracterização de inibidores de cinase, comparando o perfil de fosforilação do substrato proteico num espectro de 2D, em presença do composto inibidor with o espectro emitido a partir de uma experiência de controlo 6.
O interesse da utilização de espectroscopia de RMN, em comparação com as técnicas mais sensíveis MS, reside na grande variedade de aplicações que exploram o protocolo descrito aqui, em vez de na sua capacidade analítica sozinho. Revelou-se crucial para identificar locais de fosforilação de ser capaz de ligar fosfolarização específicas com modificações estruturais ou funcionais que foram principalmente estudadas por RMN. Espectroscopia de RMN de amostras Tau fosforilada permite explorar o impacto estrutural da fosforilação em ambas as estruturas secundárias locais transitórias e no rearranjo global do conjunto dinâmico de modificado Tau 36,37. Aspectos funcionais incluem a regulação de ambos interação de Tau com parceiros de proteína 7,38,39 e agregação por Tau fosforilação 8. A amostra fosforilada da tau caracterizado por RMN pode ainda ser usado para decifrar as interacções dependentes de fosfo, paraexemplo, com proteínas 14-3-3 40, e da interacção proteína-proteína engenharia inibidores 41,42. RMN permite a definição do sítio (s) de interacção no nível do resíduo, e da dependência desta interacção na fosforilação. Além disso, espectroscopia de RMN de Tau fosforilada é uma metodologia chave para caracterizar o cis prolina: isomerase trans Pin1, uma enzima dependente de fosfo importante envolvido na regulação Tau 43-45. Além disso, a análise por RMN de fosforilação pode ser aplicado não só para, mas também deslocados para proteínas globulares 46. Por fim, outros tipos de tau PTMs tais como acetilações 22,40,41 podem ser estudadas por RMN. Os protocolos descritos aqui provaram crucial para entender melhor a regulação funcional e estrutural de Tau em condições fisiológicas e patológicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20 °C |
| BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80 °C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100x | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4 °C |
| 1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20 °C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4 °C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80 °C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
References
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