Introduction
21. yüzyılda sağlık temel güçlüklerden biri gibi Alzheimer hastalığı (AH) gibi nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Tau mikrotübül (MT) oluşumunu teşvik eden bir mikrotübüle bağlı proteindir. Tau eşit çeşitli nörodejeneratif hastalıkların iyi bilinen AD olduğu sözde tauopatıler, yer almaktadır. Bu hastalıklarda, Tau çiftlenmiş helezon şeklinde lifler (PHF'ler) kendine gruplar ve fosforilasyon 1 ile posttranslasyonel modifikasyonlar (PTMS) birçok kalıntıları modifiye bulunur. Tau proteininin fosforilasyonu MT stabilizasyonu AD nöronları karakterize fonksiyon patolojik kaybı fizyolojik fonksiyonun iki düzenlenmesinde implike edilmektedir.
Hastalıklı nöronların PHF'lerin entegre Dahası, Tau proteini, kaçınılmaz 2 hiperfosforilatlandırılmaya edilir. 2-3 fosfat gruplarını içeren normal Tau aksine, PHF'lerin içinde hiperfosforilize Tau 5-9 Phosphat içeriyorE grupları, 3. Tau hiperfosforizasyon'un bazı bölgelerde ve fosforilasyon patolojik sitesi olarak adlandırılan ek yerleriyle fosforilasyonuna stokiyometri artışa hem de karşılık gelir. Ancak, üst üste seviye 4 nicel farklılıklara rağmen, AD ve fosforilasyon normal erişkin modelleri arasında var. Nasıl özel fosforilasyon olayları etkisi fonksiyonu ve Tau disfonksiyon büyük ölçüde bilinmemektedir. Biz, moleküler düzeyde PTMS tarafından Tau düzenleme deşifre hedefliyoruz.
Tau moleküler yönlerini anlayışı derinleştirmek için, teknik zorlukların üstesinden gelmek için var. İlk olarak, Tau çözelti içinde yalıtılmış bir içsel düzensiz protein (IDP) 'dir. Bu tür proteinler, fizyolojik koşullar altında, iyi tanımlanmış üç boyutlu bir yapıya sahip olmaması ve fonksiyon (lar) ve yapısal özelliklerini incelemek için, özellikle biyo-fiziksel yöntemler gerektirir. Tau yerinden edilmiş kişilerin artan sınıf için bir paradigma olduğunu sık sık ilişkili bulunduBöyle nörodejeneratif hastalıklar gibi patolojiler, bu nedenle görevlerini altında yatan moleküler parametreleri anlamak için ilgi artmaktadır. İkincisi, Tau fosforilasyonu karakterizasyonu uzun 441 amino asit Tau izoformunun dizisi boyunca 80 potansiyel fosforilasyon siteleri ile, bir meydan okumadır. Antikorların bir dizi Tau fosforile epitoplarına karşı geliştirilmiş ve nöronlar ve beyin dokusunda patolojik tau saptanması için kullanılır. Fosforilasyon olayları Proline zengin bölgede yakın çoğu prolin-yönelimli kinazlar tarafından hedef en az 20 sitelerinde yer alabilir. Nitel (hangi sitelerin?) Ve (Ne stoikiometri?) Kantitatif karakterizasyonu bile en son MS teknikleri 5 tarafından zordur.
NMR spektroskopisi çok konformerlerin topluluklar oluşturduğu dinamik sistemlerdir düzensiz proteinleri araştırmak için kullanılabilir. Yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi başvurunun oldued Tau proteini hem yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için. 8 - Buna ek olarak, Tau fosforilasyon profilinin karmaşıklığı fosforilasyon 6 tanımlanması için NMR kullanılarak moleküler araçlar ve yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. bir analitik yöntemin NMR fosfat dahil ölçüde küresel bir şekilde Tau fosforilasyon tanımlanması, tek bir deneyde, tüm tek-mevkili modifikasyonlarının görselleştirme ve miktar tayini için izin verir. Tau üzerinde fosforilasyon Literatürde bol birlikte, çoğu fosforilasyonu profilinin tamamı üzerinde bir belirsizlik geniş çapta ve böylece tek tek fosforilasyon olaylarının gerçek etkisini bırakarak antikorlar ile gerçekleştirilmiştir için bu husus çok önemlidir. PKA, Glikojen-sentaz kinaz 3p (GSK3), sikline bağımlı kinaz 2 / siklin A (CDK2 / CycA), sikline bağlı kinaz 5 (CDK5) / p25 eylemi içeren rekombinant kinazlarTau doğru fosforlaştırma etkinliği görülür ivator proteini, hücre dışı sinyal ile düzenlenen kinaz 2 (ERK2) ve mikrotübül-afinite düzenleyici kinaz (Mark), bir aktif formda hazırlanabilir. Buna ek olarak, iyi karakterize edilmiş fosforilasyon desen belirli bir Tau proteini izoformlarının üretilmesi için izin Tau mutantları tau'nun fosforilasyonu kodunu çözmek için kullanılır. 8 - NMR spektroskopisi, sonra enzimatik olarak modifiye edilmiş Tau örnekleri 6 karakterize etmek için kullanılır. Tau in vitro fosforilasyonu glutamik asit (Glu) kalıntıları seçilen Ser / Thr mutasyon ile olduğu gibi sözde fosforilasyon daha zor olmasına rağmen, bu yaklaşım da yararları vardır. Gerçekten de, fosforilasyon, ne yapısal etkisi de etkileşim parametreler her zaman glutamik asit ile taklit edilebilir. Bir örnek Glu mutasyonları 9 ile yeniden değildir fosfoserin 202 (pSer202) etrafında gözlenen dönüş motifi / fosfotreonin 205 (pThr205) 'dir.
in vitro fosforilasyonuna Tau ayrıntılı bir protokol verilmektedir. 12 - ERK2 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz / ERK kinaz (MEK) 10 ile fosforilasyonu ile aktif hale gelir. değiştirilirse izotopik olarak etiketlenmiş tau proteininin hazırlanmasına ek olarak, PTMS tespit etmek için kullanılan NMR stratejisi açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
15 N 1. üretimi, 13C-tau (Şekil 1)
- BL21 pET15b-Tau rekombinant T7 ifade plazmid 13,14 Transform (DE3) Yetkili Escherichia coli bakteri hücreleri 15.
Not: en uzun (441 amino asit kalıntıları) Tau izoform cDNA kodlama pET15b plasmidde Ncol ve Xhol sınırlama siteleri arasında klonlanmıştır.- Yetkili BL21 1.5 ml'lik plastik bir tüp içinde plasmid DNA, 100 ng plazmid DNA ug başına 1-5 x 10 7 koloni oluşturan (DE3) hücreleri nazikçe 50 ul karıştırın.
Not: ökaryotik cDNA ifade için kodon-optimize kullanımı bakteri türleri insan Tau üretmek için gerekli değildir. - 42 ° C'de 10 saniye boyunca, daha sonra 30 dakika karıştırıldı ve ısı şoku buz üzerinde hücre karışımı yerleştirin. Lütfen, buz üzerinde 5 dakika için tüp ve oda sıcaklığında LB (Luria-Bertani) orta 1 ml. yumuşak altında 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bakteriyel bir süspansiyon inkübeçalkalama.
- Yetkili BL21 1.5 ml'lik plastik bir tüp içinde plasmid DNA, 100 ng plazmid DNA ug başına 1-5 x 10 7 koloni oluşturan (DE3) hücreleri nazikçe 50 ul karıştırın.
- ampisilin antibiyotik, 100 ug / ml içeren LB ortamında bir agar plakası üzerine bir aşılama köprüsü eşit hücre süspansiyonu 100 ul kullanılarak yayıldı.
- 37 ° C'de 15 saat için seçim plaka inkübe edin.
- Yaklaşık 2 haftalık bir süre için, kültür adımına geçmeden kadar 4 ° C 'de bir seçim plaka tutun.
Not: bakteri kültürü (% 50 gliserol) bir gliserol stoku, -80 ° C'de saklandı, daha sonraki bir aşamada başlangıç kültürü olarak hazırlanabilir. - Otoklavlanmış M9 tuzlarının 1 L (6 g 2 Na HPO 4, 3 gr KH 2 PO 4 mi, 100 mM CaCl2, 10 mi 100x MEM vitamin kompleman 1 ml 1 M MgSO 4, 1, 1 mi, 100 mg / ml ampisilin ekleme , 0.5 g NaCI).
NOT: beyaz bir çökelti hızlı bir şekilde dağılır M9 tuzları CaCI2 çözeltisi ilave edilmesi üzerine oluşturacaktır. - 15 N, 300 mg 13 C-tam orta, 15 1 g çözünürNH4CI ile 13 ° C M9 ortam 6 -glükoz 10 ml 2 g. -Filtre sterilize doğrudan M9 ortama, bir 0.2 mikron filtre kullanarak izotop çözümü.
- ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş LB ortamı 20 ml seçeneklerini plaka bakteri dönüştürülmüş pET15b-Tau bir aşılama köprüsü bir koloni ile askıya alınması.
- 6 saat boyunca 37 ° C'de aşılandı orta inkübe edin.
- Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteriyel kültür on kat seyreltme 1 ml, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk ölçülür.
Not: 3,0-4,0 600 OD tekabül eden bakteriyel kültür bulanıklığı doygunluk büyüme fazı ulaşılır belirtir. - 2 L'lik bir Erlenmeyer plastik bölmeli bir kültür şişesi içinde, ampisilin (100 ug / ml nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş M9 büyüme ortamı, 1 L doymuş LB kültür 20 ml ekleyin.
- 10 ° ayarlanmış programlanabilir inkübatör kültür şişesi yerleştirinC ve 50 rpm. Ertesi gün sabah erkenden 200 rpm ve 37 ° C geçmek için inkübatör Program.
- Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteri kültürü, 1 ml'lik Ölçü OD 600. 1 M IPTG 400 ul (izopropil P-D-1-tiogalaktopiranosid) OD 600 biraraya getiren tau proteininin ekspresyonunu indüklemek için yaklaşık 1.0 arasında bir değere ulaştığında (-20 ° C'de saklanan) stok çözeltisi ekleyin.
- ilave 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyon devam edin. 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile bakteri hücreleri toplamak.
- -20 ° C'de bakteriyel pelet dondurun. Gerekirse bir süre için, saflaştırma adımı kadar donmuş tutun.
15 N 2. saflaştırılması, 13C-tau (Şekil 2)
- 121 ° C'de otoklav katyon değişimli (CEX), saflaştırma, tamponlar, 20 dakika boyunca 15 psi altında. 4 ° C'de saklayın tamponlar.
- bakteriyel hücre pelet çözülme ve 45 ml iyice tekrar süspansiyon haline getirinekstraksiyon cex bir tampon maddesi (50 mM NaPi tamponu pH 6.5, 1 mM EDTA), taze proteaz inhibitör kokteyli 1x (1 tablet) ve DNasel (2.000 ünite) ile takviye edilmiştir.
- 20.000 psi'de bir yüksek basınç homojenizatörü kullanılarak bakteriyel hücrelerin bozulması. 3-4 geçiş gereklidir. 40 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin çözünmeyen malzemenin ayrılması için.
- bir su banyosu kullanılarak 75 ° C 'de 15 dakika süre ile bakteriyel hücre özü ısıtın.
NOT: beyaz bir çökelti, birkaç dakika sonra gözlemlenmiştir. - 20 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin ve ısıya karşı kararlı Tau protein içeren süpernatant, tutun.
- Aşağıdaki saflaştırma adımı kadar -20 ° C'de saklayın, gerekirse.
- Bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi (Şekil 3 A) ile 5 ml yatak kolonu gibi paketlenmiş güçlü CEX reçine üzerinde bir katyon-değişim kromatografisi gerçekleştirin.
- 2.5 ml / dak sabit akış hızı.
- Bir tampon cex sütunu dengelenmesi
- 60-70 ml heated- yükleyinTau Örnek pompası kullanılarak içeren özü, ya da seçenek olarak sistemine bağlı olarak, bir pompa. akış yoluyla analiz Tau proteini verimli (2.8) reçine bağlayıcı olduğunu doğrulamak için toplayın.
- Lütfen başlangıç değerine için 280 nm'de absorbans kadar Cex ile bir tampon reçine yıkanır.
- CEX B tamponu kademeli bir artış ile elde edilen üç aşamalı bir NaCI gradyanı kullanılarak kolondan Elute Tau (CEX 1 M NaCI ile tampon A). Program FPLC aşağıdaki gibidir: 500 mM NaCI ulaşmak için 5 CV 250 mM NaCl,% 50 CEX tampon B'ye ikinci adımı ulaşmak için 10 kolon hacim (CV) içinde% 25 CEX tampon B'ye gradyan ilk aşaması ve üçüncü adımı 2 CV% 100 CEX B tamponu 1 M NaCl ulaşmak için. elüsyon adımları sırasında 1.5 mL fraksiyon toplanır.
- SDS-PAGE (% 12 SDS-akrilamid jeli) ve Coomassie boyama (Şekil 3 A), 16 tarafından elusyon basamağı sırasında toplanan fraksiyonlar 10 ul analiz edin. analy tarafından da kolon üzerinde yükleme adımı kontrolflow-through 10 ul zing.
- Tau içeren kesirler seçin ve bir sonraki adım için bu kesirler havuz.
- Tau-içeren toplanmış fraksiyonların (Şekil 3 B) bir tampon değişimi gerçekleştirin.
- Bir FPLC sistemi kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat (uçucu tamponu) 53 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (26 x 10 cm) bir tuz alıcı sütun dengelenmesi.
- 5 ml / dk için sabit akış hızı. 5 ml'lik bir enjeksiyon döngüsü ile sütun üzerinde Tau örnek enjekte edilir. 280 nm 'de absorpsiyon tepe noktasına karşılık gelen fraksiyonlar toplanır.
- İlk CEX havuzun hacmine bağlı olarak, enjeksiyonu 3-4 kez tekrarlayın.
- 280 nm'de (Tau 1 mg 140 Mau * ml tekabül eder) de kromatogramının pik alanı kullanılarak, saflaştırılmış tau proteininin miktarını hesaplayın.
Not: 280 nm tau proteininin sönüm katsayısı 7550 M-1 cm-1 olan. Tau bir Trp kalıntısı içermez. - Havuz tüm Tau fraksiyonları.
- AliquoTau 1-5 mg eşdeğeri içeren tüplere örnek t. çözeltisinin hacmi borusu (50 ml tüp içinde çözelti, örneğin 5 mi) hacmi ile karşılaştırıldığında küçük olup, böylece, bu tüpler seçin.
- Bir iğne kullanılarak tüp kapaklar delikler. -80 ° C'de Tau örnekleri dondurun.
- Liyofilize edilir Tau örnekler. Liyofilize Tau proteini uzun bir süre boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
15 N-Tau 3. İn Vitro Fosforilasyon
- 500 ul fosforilasyon tamponu (50 mM Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCI), liyofilize Tau 5 mg eritin.
- 0.5 M stoktan 2,5 mM ATP (100 mM'lik bir stok çözeltiden 25 ul, -20 ° C'de tutulur), 1 mM DTT (1 M stok çözeltisinin 1 ul -20 ° C 'de tutulur), 1 mM EGTA ekleyin (2 ul çözelti), 1 x proteaz inhibitör kokteyli (1 mi fosforilasyon tamponu içinde 1 tablet çözülmesiyle elde edilen bir 40x stoklar 25 | il) ve 181; M His-ERK2 aktif (koruma tampon maddesi içinde 250 ul 10 -80 ° C'de saklandı mM HEPES, pH 7.3, 1 mM DTT, 5 mM MgCI2, 100 mM NaCI ve% 10 gliserol), toplam numune hacminin 1 mi.
NOT: Aktif His-ERK2 MEK kinaz ile fosforilasyonu ile in-house 5,8 hazırlanabilir. - 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
- ERK kinaz inaktive etmek için 15 dakika süreyle 75 ° C de bir örnek ısıtılır.
- 15 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin. Toplamak ve süpernatant tutun.
- 1 ml'lik bir örnek için uygundur 3.45 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (1.3 x 2.6 cm), bir kolon kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat içine protein örnek desalt.
- Bütünlüğünü ve verimli fosforilasyon (Şekil 4) kontrol etmek için protein örnek 2.5 ul% 12 SDS-PAGE 16 çalıştırın.
- fosforile tau örnek liyofilize. -20 ° C'de bir toz saklayın.
NMR Spectra 4. Acquisition (Fişekil 5)
- Liyofilize 15 N 4 mg, 400 ul NMR tamponu içinde 13 C ERK-fosforile-tau (50 mM NaPi veya tris- D11 .Cl dötere 50 mM, pH 6.5, 30 mM NaCI, 2.5 mM EDTA, 1 mM DTT) çözünürleştirilir.
- İç NMR sinyali referans olarak NMR spektrometresi alan kilitleme ve 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3-d4 asit sodyum tuzu))% 5 D 2 O ekleyin. tam proteaz inhibitör kokteyli 40x stok çözeltisi 10 ul ekle.
- uzun bir iğne ya da Pasteur pipeti ile bir elektronik şırınga kullanılarak 5 mm'lik NMR tüpü içinde örnek aktarın. pistonu kullanarak NMR tüpü kapatın. piston hareketleri ile piston ve sıvı arasında sıkışmış hava kabarcığı çıkarın.
- bir döndürücüye NMR tüpü yerleştirin. örnek çözeltisi çoğu NMR bobin içinde olacak şekilde, kullanılan NMR prob kafası için uygun göstergesi ile spinner kendi dikey konumunu ayarlar.
- Hava akışını başlatmak: asansör i tıklayınn mıknatıs kontrol sistemi penceresi. Dikkatle mıknatıs deliğin üstündeki hava akımı tüp ile spinner yerleştirin. Hava akışını durdurmak (lift tıklayın) ve tüp mıknatıs prob kafasının içinde yerine iner edelim.
- 25 ° C (298 K) 'ye ayarlama sıcaklığı.
- güç iletimini optimize etmek için yarı-otomatik ayarlamayı ve prob kafasının eşleştirme gerçekleştirin. Komut satırında atmm yazın.
- Döteryum kanalda kayıtlı numunenin D 2 O sinyali kullanarak spektrometre frekansını kilitleyin. Mıknatıs kontrol sistemi penceresinde kilidi tıklayın.
- Numunenin pozisyonda manyetik alanın homojenliğini optimize layneri prosedürü başlatın. Şim penceresini açmak için komut satırında gui topshim yazın. Şim penceresinde başlangıç tıklayın. şimleri (en az 2 Hz iyidir) optimum olduğunu doğrulamak için kalan B0 standart varyasyon değerini kontrol edin.
- bir protonun p1 parametresini (uzunluk kalibreProton spin 90 ° rotasyon elde etmek için gerekli olan mikro-saniye radyofrekans darbe). Su proton 1D spektrumunu (Şekil 6) kullanılarak 360 ° darbe hedefleyin.
- (Şekil 6) 1D spektrumunda proton su frekansa (Hz) o1 parametresini ayarlayarak ofset frekansı ayarlayın.
- Örnek (Şekil 7) gelen sinyalleri kontrol etmek için (örneğin zggpw5, su sinyal bastırılması watergate sırası ile atım dizisi) 1B proton spektrumunun edinimi başlar. göreceli bir protein konsantrasyonuna taramalarının sayısını uyarlayın. Edinimi başlatmak için komut satırında zg yazın.
- 2B alımı için ek parametrelerini ayarlamak [1 H, 15 N] HSQC spektrumu (darbe dizisi hsqcetfpf3gpsi, 8-9 Şekiller).
- Bir 15 N için 13 C 15 N dolaylı evrimi sırasında 13 C decouple, örnek etiketli.
NOT: noktasının başına Hz benzer sayıda tutmak için spektrometre alanına edinme veri noktalarının sayısını uyarlayın ve saatleri ayırımı sınırlamak için: 1 H boyutta, 900 MHz ve 600 MHz hızında 2048 noktada 3072 puan kullanın. - , Darbe dizilerinin ek parametrelerini optimize gecikmeler, darbe uzunlukları karşılık, frekansları, güç seviyeleri ofset. Komut satırında ased tip deney için ilgili tüm parametreleri görüntülemek için.
Fosforilasyon Siteleri 5. Tanımlama
- toplama ve işleme NMR yazılımını kullanarak proses spektrumları.
- Veri (Şekil 7) bir Fourier dönüşümünü gerçekleştirir. 1D spektrumu için Tip ft, bir 2D spektrumu için Xfb veya komut satırında, 3D spektrum için ft3d.
- Faz ve referans tüm spektrumları (Şekil 7C) interaktif pencereleri kullanarak.
- 2D HSQC potansiyel fosforile Ser ve Thr artıklarının (Şekil 9, kırmızı kutu) karşılık gelen ilgi rezonans tanımlayın.
- Özü uçakları (yani 2D 1H 13 C spektrumları)2B ilgi rezonans 15 N kimyasal kaymalar kullanarak 3D 1 H 15 N 13 C spektrumu. Görüntülenmiştir edilecek düzlem (w1-w3) karşılık gelen 15 N frekansı (Şekil 10B) seçmek için boyut 2 (w2) imleci kullanın.
- Her biri için 'CA' rezonans frekanslarını ve 'i' ve 'CB' 13 C çekirdekleri ve 'i-1' tortuları, (i kalıntısının kıyasla sinyallerin zayıf kümesi) seçin [1 H, 15 N] rezonans işaretçi modu menüsünde, rezonans tıklayarak HNCACB 3D spektrumunda bir ilgi zirve listesi dosyasında kimyasal kayma değer katmak, zirve eklemek / bulabilirsiniz.
- Bilinen CA değerleri ve pSer ve PTHr 17 CB kimyasal değişikliklere zirve listesinde kimyasal kaymalar karşılaştırarak, ben kalıntı tipi, pSer veya PTHr tanımlayın.
- karakteristik Ek 2 ppm kayması o I + 1 konumunda bir Pro kalıntısını varlığının belirlenmesiCA kimyasal kayma değeri 18 f.
- I-1 pozisyonunda tortu doğasını belirlemek için Tau amino asit kalıntıları 19 için öngörülen kimyasal kaymalar bir tablo I-1 kalıntıya karşılık gelen, CA ve CB rezonansların kimyasal kayma değerleri, karşılaştır.
- HNCANNH spektrumda ilgi her [1 H 15 N] rezonans rezonans 'i' 15 N çekirdeklerinin frekansları ve "i-1 'artıkları seçin.
- 23 - Tau proteini 20 kimyasal kayma atama 15 N kimyasal kayma değerleri karşılaştırın.
- diziye özgü atama tanımlamak için Tau dizisi ile özdeşleşmiş dipeptidler karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3A, elüsyon gradyanı gözlenen 280 nm'de büyük bir emilim pik gösterir. kromatogram üzerinde akrilamid jeli üzerinde görüldüğü gibi, bu seviye, saflaştırılmış tau proteininin karşılık gelir. Şekil 3B proteininin tuzsuzlaştırma verimli olmasını sağlamak, 280 nm ve iletkenliği zirvesinde bir iyi ayrılmış emilim pik gösterir. Şekil 4, bir protein, SDS-PAGE analizi ile çok sayıda protein fosforilasyonu 16 karakteristik gözlenen jel shift (kuşak 2 ve 3). Gösterir Şekil 6, (mikro-saniye cinsinden) darbe uzunlukları artan Proton (1H) 1D spektrumları bir dizi gösterilmektedir. Sinyal en aza indirerek kalibre etmek daha kolay olduğu gibi ayarlamak için bir pals 360 ° dönüşüne karşılık gelen, 90 °, 1 saat santrifüj mıknatıslanma döner darbenin uzunluğu, uygulamada kullanılmaktadır. 360 ° darbe uzunluğu yeterli tanımlandığı zaman su proton sinyali null. Bir 360 gelen değer76; Dönüş daha sonra bu deneyde 4. p1 bölünür 10.5 mikro-saniye olan. Büyütülmüş bölge: artık sinyal frekansı (1 H, frekans kayması) o1p parametresini tanımlamak için kullanılır. Şekil 7, A bir NMR sinyali tespit emin olmak için görsel bir serbest indüksiyon çürüme (FID), gösterir. Şekil 7B. asimetrik tepe görünen rezonansları ile görüldüğü gibi, yanlış bir faz ile 1D 1H spektrumunu göstermektedir. Şekil 7C temel satın alma parametreleri doğru ayarlanmış ve protein örnek bir sinyal tespit edilebilir olduğunu belirten gürültü oranı iyi bir sinyal ile 1D 1H spektrumunu göstermektedir. Şekil 8 2B 1 H, 900 MHz'de rekombinant 15 N-Tau 15 N HSQC spektrumlarını göstermektedir; Iyi hassasiyet ve çözünürlük ve Şekil 8B Şekil 8A. örnek proteoliz algılama ilave PE görünüşü görülenspektrumu (mavi kutu) içinde aks. Şekil 9 iyi hassasiyet ama 8A Şekil kıyasla daha az çözünürlüğe sahip 2B 1 H, 600 MHz'de rekombinant 15 N-Tau Şekil 9A 15 N HSQC spektrumları gösterir. 600 MHz'de Şekil 9B, fosforile artıkları (kırmızı kutu) karşılık gelen spektrumda ek zirveleri görünümünü gösterir. 900 MHz'de Şekil 9C, fosforile artıkları (kırmızı kutu) karşılık gelen spektrumda doruklarına gösterir. Ebatları Şekil 9B'de daha iyidir. Şekil 10 A, başarılı bir deney değerlendirmek için kullanılan 3D-NMR spektrumunda projeksiyonlar göstermektedir. Şekil 10B iyi sinyal yoğunluğu hem i ve i-1 kalıntılarından 13 C sinyalleri algılamak için izin ile 1 H 15 N 13 C 3D spektrumunun çıkarılan bir 1 H-13 C uçağı gösterir.
Şekil 1: rekombinant protein üretimi ve izotopik etiketleme ana adımların Programı. Protokolün 1. paragrafta açıklandığı gibi rekombinant protein üretimine bakteri dönüşümü adımlar özetlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Biraraya getiren tau protein saflaştırma ana adımları şema. bakteriyel hücrelerden adımları protokol paragraf 2'de tarif edildiği gibi özetlenmiştir rekombinant protein saflaştırma lizis. Büyük halini görmek için buraya tıklayınızbu figür.
Şekil 3: protokol Sıvı kromatografi aşamaları. Isıtılmış bakteri özüyle (A) Katyon değişim kromatografisi fraksiyonasyon. 280 nm, 260 nm ve iletkenlik absorbans katı ve kesik çizgiler siyah ve noktalı kırmızı çizgi sırasıyla gelmektedir. Toplanan fraksiyonların% 12 SDS-PAGE analizi, kromatogram üzerinde gösterilir. Liyofilizasyon için uygun olan bir tampon içine tau proteininin (B) tuz giderme. pik alanı (2.260 Mau * mi) tahmin edilen saflaştırılmış tau proteininin miktarıdır Tau 16 mg'dır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Tau% 12 SDS-PAGE analizi. Şerit 1, molekül ağırlığı işaretleyici; şerit 2, Tau 10 ug; şerit 3, ERK-fosforile tau 10 ug. Tau proteini, diğer yerinden edilmiş olduğu gibi, yaklaşık 60 kDa kadar bir görünür molekül ağırlığı yerine beklenen 46 kDa, SDS-PAGE üzerinde anormal bir şekilde çalışır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: NMR numune hazırlama, NMR spektroskopisi veri toplama ve veri işleme için ana adımların Programı. Protokolün 4. paragrafta açıklandığı gibi veri toplama ve işleme NMR numune hazırlama birkaç adım mesafede özetlenmiştir. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n.
Şekil 6: NMR veri toplama için P1 parametresinin kunnak. Bu parametre örnekleri arasında farklılık gösterir ve tuz konsantrasyonuna bağlı olduğuna bağımlı olmaktadır. D 2 O% 80 H 2 O için standart bir 1H nütasyon eğrisi gösterilmiştir. 30 sn geri dönüşüm gecikme ile tek tarama spektrumları toplandı ve yatay çizildi. puls (P1), 1 mikro-saniye adımda 1 mikro-sn mikro-saniye ile 55 arasında değişiyordu. Teorik olarak, sinyal 90 ° darbe için maksimum ve 180 ° darbe için sıfıra eşit olmalıdır. Bununla birlikte, uygulamada, radyasyon sönümleme zor doğrudan 90 ° veya 180 ° darbeleri tespit etmek hale Asimetri ve faz distorsiyonu sorunlara neden olmaktadır. İkinci sıfır noktası 360 ° darbe uzunluğuna eşittir. büyütülmüş bölge 360 ° bir artık sinyal görülmektedir o1p frekans parametresini tanımlamak için kullanılır darbe. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: NMR verileri işlem. (A) saat etki Ücretsiz indüksiyon sinyal çürüme. (PHC0 -206 °) frekans alanı içine Panel A FID Fourier dönüşümü ancak yanlış fazı ile sonuçlanan 1D proton spektrumları (B). (C) aşamalı (PHC0 -113 °) ve başvurulan (0 ppm'de TMSP sinyali). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"/>
Şekil 8: 2B 1 H, 900 MHz'de rekombinant 15 N-Tau 15 N HSQC spektrumları. 3,072, 416 alıcı veri noktaları, sırasıyla, spektral 14 genişlikleri ve 1 H (F2) ve 15 N (F1) boyutlarında 25 ppm kullanılarak kaydedildi. 16 tarar 4 saat 30 dakika içinde deney bir süre yol F1 artış başına kaydedilmiştir. Spektrumu (yüksek alan 1H, düşük alan 15 N) belirli bir bölgede ek rezonans görünümü ortaya koyduğu gibi (A) Kaliteli Tau örneği (B) Tau örnek bozulmasını gösteren, burada mavi kutulu. Bu son numune, proteaz inhibitörleri olmadan hazırlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9: 2D 1H, yeniden birleştirici 15 N-Tau 15N HSQC spektrumları. (A), fosforlanmamış Tau 600 MHz frekans aralığı (B) Tau 600 MHz frekans aralığı ve (C) Tau 900 MHz frekans fosforile fosforile. spektrum belirli bir bölgede ek rezonanslar, burada, kırmızı kutulu, fosforile tau spektrumları görülmektedir. Proton amid (1 H 15 N) pSer ve PTHr kalıntılarının korelasyon tekabül eden bu rezonans, kolayca toplu dışında, etrafında 8,5 1 H 9.5 ppm ve 15 N için 117-125 ppm bölgede görselleştirildiği 1H, fosforlanmamış Tau spektrumunun 15 N korelasyon. (A ve B) 600 MHz, 14 ve 25 ppm spektral genişliklerinde 2.048 ve 256 veri noktası sırasıyla 1 H (F2) ve 15 N (F1) boyutlarında kaydedildi edindiği spektrumlan karşılık gelmektedir.32 taramalar kullanıldı ve satın alma toplam süresi 2 saat 44 dakika ve 14 spektral genişlikleri de 3072 ve 416 veri noktaları ve 25 ppm 1H (F2) kaydedildi, 900 MHz ve 15 N (C) (oldu sırasıyla F1) boyutları. 48 taramalar kullanıldı ve satın alma toplam süresi 6 saat 37 dakika idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 10: 3D 1H, 15, N, 13 ° C NMR spektrumu, projeksiyonlar ve ekstre 2B düzlemler. 2.048, 72, ve 256 veri noktası sırasıyla boyutları 1 H (F3), 15 N (F2) kayıtlı, 13 ° C (F1) bulundu. Spektral genişlikleri, 4.7, 119 merkezli, 14, 25 ve 61 ppm, 1 H, 41 ppmSırasıyla 15 N ve 13 C boyutları. 16 taramaları kullanarak satın alma süresi 4 gün ve 6 saattir. Fourier tekabül (A) Küp gösterimi ERK-fosforile Tau bir HNCACB spektrumunun 3D veri seti 600 MHz'de elde dönüştürdü. 2D 1H, 15, N ve 1H, 13C uçaklar, sırasıyla 3 boyutlu 13C boyunca veri ve 15 N boyutun projeksiyonu ile elde edilir. Veri işleme ve temsil NMR edinimi ve işleme yazılımı kullanılarak yapılmıştır. (B) 2D 1H, 3D 1 H çıkarılan 13 C uçağı, 15 N, 121.8 ppm 15 N kimyasal vardiyasında 13C NMR veri seti. (Sağda) bir yakınlaştırma hem kalıntı i (pThr153) ve i-1 (Ala152) 13, CA ve 13 CB rezonansları göstermektedir 9.38 ppm 1H kimyasal kayma merkezli. 13 CB rezonans s genişliğine bağlı olarak, diğer ad olarakspektral pencere. Grafik temsili ve tepe toplama NMR analizi yazılımı kullanılarak yapıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz enzimatik modifiye Tau örnekleri karakterize etmek NMR spektroskopisi kullandık. Rekombinant sentezleme ve tam boyunda insan tau proteinini burada tarif edilen saflaştırma Benzer mutant tau ya da tau etki üretmek için kullanılabilir. Izotopik olarak zenginleştirilmiş protein, yeniden birleştirici ifade gerektiren NMR spektroskopi için gereklidir. Fosforilasyon alanların belirlenmesi rezonans atama ve 15 N, 13 C çift etiketli protein gerektirir. izotopların maliyeti göz önüne alındığında, iyi bir verim rekombinant ekspresyon aşamasında gerekmektedir. Glukoz, bu nedenle 13 C 6 -glükoz miktarı verimi artırmak için büyüme ortamı litre başına 4 g arttırılabilir M9 ortam içinde bakteri büyümesi için sınırlayıcı bir faktördür. tam orta ve MEM vitamin ilavesi zorunlu değildir, ancak verim büyümesini teşvik ve geliştirmek için yardımcı olur. Tam etiketli orta yüksek maliyeti göz önüne alındığında, bu ürünün, sadece büyüme ortamı supplemen olarak kullanılant. Bakteriyel büyüme M9 ortamında yavaş. Genel olarak, M9 ortam kullanılarak bakteri kültürleri inkübe yaklaşık 4 saat sonra indüksiyon% 3 tam ortam erişim süresi ile takviye edilmiştir. OD 1.6-1.8 600, genellikle kültürü sonunda elde edilir. Rekombinant tau proteininin beklenen verimi bakteri kültürü litresi başına yaklaşık 15 mg'dır. programlanabilir inkübatör kullanılması uygun çalışma gündüz saatlerinde protein üretimini, bakteriyel pelet ve protein üretiminin analitik kontrol koleksiyonu zamanlama sağlar.
Örnek konsantrasyonu kaliteli bir spektrum elde etmek için önemlidir. 2B spektrumu için yeterli Tipik Tau Örnek 200 ul (yani 100 uM) tau protein 1 mg ihtiva edecektir. 3B spektrum için, 300 ul, en az 200 | iM, gerekli bir kriyojenik prob kafası kullanılmasını sağlanır. Bu daha iyi bir sinyal-gürültü sağlayacak bu çalışmada kullanılan 900 MHz aleti bir yüksek alan spektrometreye Erişimve örnek konsantrasyonu üzerindeki kısıtlamalar (Şekil 8) azaltır. Tau büyük düzensiz protein olduğu göz önüne alındığında, bunun NMR spektrumları önemli sinyal üst üste ile karakterizedir ve yüksek alan NMR spektrometre de çözünürlük açısından (Şekil 8) en iyi seçim olacaktır. Bununla birlikte, fosforilasyon karşılık gelen rezonans spektrumu belirgin bir bölgede ve bir 600 MHz spektrometre ile daha tespit etmek kolaydır (Şekil 9 B ve 9C karşılaştır). Buna ek olarak, onun düzensiz olması nedeniyle, Tau proteini proteoliz (Şekil 8B) karşı duyarlıdır.
tamponların Sterilizasyon Tau bozulması sınırlamak için tavsiye edilir. NMR örnek proteaz inhibitörlerinin eklenmesi, saatlerden günlere kadar son puls sekansına bağlı olarak veri elde etme dönemleri sırasında bozunmaya karşı Tau korumaya yardımcı olur. Düşük pH (7.0 altında yani pH) av için gereklidiroid genişletilmesini sinyal yol açar protein proton ve su protonlar arasındaki çok hızlı değişim. Numune, pH, aynı zamanda iyi bir spektrumları tekrarlanabilirliği sağlamak için kontrol edilmelidir. pSer ve PTHr pKa değerleri, NMR spektroskopisi için en uygun pH yakın olduklarından Nitekim, fosforile edilmiş artıkların kimyasal değişimleri pH değişimlerine çok hassastır. NMR numunenin pH ayarlanması, küçük hacimlere uyum pH mikro elektrod ile pH-metre kullanılarak doğrudan yapılabilir. Tau çözünebilir proteindir ve standart koşullarda toplamaz. heparin sülfat ve 37 ° C 'de inkübasyon olarak polianyonlar, eklenmesi Tau örneklerinde toplama başlatabilir. Bu durumda, agrega bir katı doğası göz önüne alındığında, karşılık gelen NMR spektrumunda rezonansların en tespiti dışında genişletmektedir. Hatta fosforile Tau örnekleri NMR veri toplama için burada tarif edilen koşullar agrega yok.
antikor analizi için karşılaştırıldığında, NMR, bir o sağlarPTMS verall görünümü. Kütle spektrometrisi, aynı zamanda, bir protein örneğinin fosforilasyon modelini belirlemek için kullanılabilir. İzotopik markalama Bu teknik için gerekli değildir ve gerekli örnek miktarları çok daha küçüktür. Bununla birlikte, bu gibi birden fazla Tau fosforilasyon, bir proteinin karakterizasyonu, zor olmaya devam etmektedir. Bitişik fosforilasyonların kimlik aşağıdan yukarıya stratejilerinde izobarik peptidler üretecek. Tam tanımlaması örnek proteoliz ile elde edilen peptitlerin MS / MS sıralaması gerektirir. NMR bir avantajı tekniğinin iç nicel unsur oluşur. bir NMR sinyalin yoğunluğu, belirli bir yerde bir kimyasal grup miktarına bağlı olabilir. Böylece her bir sahada kimyasal modifikasyon oranı tanımlayabilir. MS uygulamalarında en son ilerleme ancak Tau çok fosforilasyon MS analizi, daha uygun bir normalleştirme 25 sonra niceliksel bir şekilde, uygun 24 olduğunu göstermiştir.
Burada, aktif ERK2 göre Tau fosforilasyonunu sunulmaktadır ama yöntemin diğer kinazlar da 6,7,26 ile fosforilasyonu için kullanılabilir - 28. 31 - Kinetik deneyler bir protein substrata 28 doğru kinaz özgüllük tanımlamak için yardımcı olabilir, yapılabilir. Fosforilasyon çalışmalar, rekombinant kinazlar ile sınırlı değildir ve hücre ya da doku ekstrelerinin kinaz aktivitesi, 6,32,28 analiz edilebilir. Ilginç bir gelişme in situ değişiklikler 33,34 okumak için hücre içi NMR kullanılmasıdır. PP2A fosfataz 35 tarafından fosforile Tau defosforilasyonunu inceleyerek gösterildiği gibi Tersine, NMR da, fosfataz özgüllüğünü ele iyi adapte edilir. NMR spektroskopisi inhibitör bileşiği wit mevcudiyetinde bir 2D spektrum protein alt-tabaka fosforilasyon profilini karşılaştırarak kinaz inhibitörlerinin tanımlaması uygulanabilirh kontrol deneyi 6 tarafından verilen spektrum.
daha duyarlı MS teknikleri ile karşılaştırıldığında NMR spektroskopisi kullanarak faiz, oldukça yalnız analitik kapasiteye göre, burada açıklanan protokol istismar uygulamaların geniş bulunur. Özellikle NMR kullanılarak incelenmiştir yapısal ya da işlevsel değişikliklerle belirli fosforilasyonlar bağlantı muktedir fosforilasyon siteleri belirlemek için çok önemli olduğunu kanıtlamıştır. Fosforile Tau örneklerinin NMR spektroskopisi, hem geçici yerel ikincil yapıların ve modifiye Tau 36,37 dinamik topluluk küresel yeniden düzenlenmesi üzerinde fosforilasyon yapısal etkisini araştırmak için izin verir. Fonksiyonel açıdan Tau fosforilasyonu 8 protein ortakları 7,38,39 ve agregasyonu ile Tau iki etkileşimin düzenlenmesini içermektedir. NMR ile tanımlandı fosforile tau örnek ayrıca için, fosfo bağımlı etkileşimleri deşifre etmek için kullanılabilir14-3-3 protein 40 ve işlenmiş protein-protein etkileşimi ile, örneğin 41,42 inhibitörleri. NMR Tortu seviyesinde etkileşim bölgesi (ler) in tanımı sağlar ve fosforilasyon bu etkileşimin bağımlılığı. Buna ek olarak, fosforile tau ve NMR spektroskopisi prolin cis karakterize etmek için önemli bir metodolojidir: trans izomeraz Pin1 Tau düzenlemesi 43 yer alan önemli bir fosfo-bağlı enzim - 45. Buna ek olarak, NMR ile fosforilasyon analizi yerinden edilmiş değil, aynı zamanda küresel proteinler 46 sadece uygulanabilir. Son olarak, asetilasyon 22,40,41 Tau PTMS başka tür NMR ile incelenebilir. Burada anlatılan protokollerin daha fizyolojik ve patolojik koşullarda Tau yapısal ve fonksiyonel düzenleme anlamak için önemli olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20 °C |
| BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80 °C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100x | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4 °C |
| 1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20 °C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4 °C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80 °C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
References
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
- Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
- Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
- Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
- Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
- Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
- Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
- Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
- Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
- Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
- Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
- Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
- Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
- Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
- Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
- Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
- Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
- Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
- Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
- Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
- Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
- Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
- Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
- Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
- Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
- Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
- Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
- Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
- Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
- Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
- Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
- Milroy, L. -G., Bartel, M., et al.
- Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
- Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
- Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
- Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
- Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
- Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).
