Summary
هنا، فإننا نقدم pluripotent البشرية بروتوكولات الثقافة الخلايا الجذعية (هبسك)، يستخدم للتفريق بين هبسكس إلى CD34+ فروعه المكونة للدم. يستخدم هذا الأسلوب الخاصة بمرحلة التلاعب الكنسي WNT الإشارات لتحديد الخلايا حصرا لأي برنامج نهائي أو البدائية المكونة للدم.
Abstract
أحد الأهداف الرئيسية للطب التجديدي هو الجيل والحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). حتى وقت قريب، الجهود الرامية إلى التمييز بين هبسكس إلى هسكس الغالب ولدت فروعه المكونة للدم التي تفتقر إلى إمكانات HSC، وبدلاً من ذلك تشبه كيس ألمح هيماتوبويسيس. قد تكون محدودة فروعه المكونة للدم الناتجة عن هذه الأداة المساعدة لفي المختبر النمذجة المرض من مختلف الاضطرابات المكونة للدم الكبار، لا سيما تلك المتعلقة الأنساب اللمفاوية. بيد أننا مؤخرا وصف أساليب توليد اريثرو-ميلو-اللمفاوية فروعه المكونة للدم نهائي مولتيلينيجي من هبسكس استخدام بروتوكول تمايز موجهة الخاصة بالمرحلة، التي تبين لنا هنا. من خلال الانفصال الانزيمية من هبسكس على الغشاء بلاستيكواري المغلفة بالمصفوفة، تتشكل الهيئات امبريويد (EBs). ميزت الحديدية إلى ميسوديرم من BMP4 المؤتلف، التي تم تحديدها في وقت لاحق إلى نهائي البرنامج المكونة للدم مثبط GSK3β، CHIR99021. بدلاً من ذلك، يتم تحديد هيماتوبويسيس البدائية من مثبط بوركن، IWP2. هيماتوبويسيس إضافية مدفوعة عن طريق إضافة المؤتلف VEGF وداعمة السيتوكينات المكونة للدم. موروث المكونة للدم الناتجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب لديها القدرة على استخدامها للمرض والنمذجة التنموية، و في المختبر.
Introduction
الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) وتعرف بأنها تشمل كلا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، ولديها القدرة على فريدة من نوعها ليس فقط تمر الذاتي تجديد تحت ظروف النمو المناسبة، ولكن أيضا، القدرة على التفريق في جميع أنواع الخلايا المستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث: الأنسجة، mesoderm، والأديم الظاهر1. بسبب هذه قدرات فريدة من نوعها، هبسكس تبشر كبيرة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والعلاج يستند إلى الخلية2. بينما تم بنجاح التمييز بين أنواع متعددة من الخلايا من هبسكس، هو أحد التحديات الهامة في المختبر المواصفات حصرا الكبار مثل المستمدة من هبسك المكونة للدم الخلايا الجذعية (HSCs) وفروعه المكونة للدم نهائي.
أحد الحواجز المحتملة لتنمية البشرية هسكس من هبسكس هو وجود العديد من البرامج المكونة للدم في الجنين البشري3. البرنامج الأول الذي يخرج، يطلق عليه "هيماتوبويسيس البدائية،" ينشأ داخل الأنسجة اكسترامبريونيك صفار الكيس وأفضل تتميز بإنتاجها عابر اريثروبلاست موروث (أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية)، والضامة وميجاكاريوسيتيس. جدير بالذكر أن هذا البرنامج لا تثير هسكس ولا يعطي الارتفاع إلى فروعه اللمفاوية تي وب. ومع ذلك، كيس ألمح عابر تؤدي إلى فروعه المكونة للدم نهائية مقيدة، مثل السلف اريثرو النقوي (EMP4،5،6،،من78) وتفتقر إلى محمر اللمفاوية معبي multipotent السلف (لمب9). ومع ذلك، EMPs لا لمبس multipotent تماما، أو قادرة على انجرافتمينت مثل HSC في المستفيدين الكبار. على النقيض من ذلك، لاحقاً في التنمية، ويتم تحديد البرنامج المكونة للدم "نهائي" محددة بطريقة كلاسيكية في منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنين السليم، مما أدى إلى جميع الأنساب المكونة للدم الكبار، بما في ذلك HSC. مواصفات هذه الخلايا المكونة للدم نهائي داخل الجنينية يحدث بطريقة تعتمد على درجة، عبر مرحلة انتقالية غشائي--إلى--المكونة للدم من هيموجينيك البطانة (أنه)3،10،11 ،،من1213،14. وبصرف النظر عن القدرة على إعادة تشكيل، يمكن استخدام مولتيلينيجي المحتملة، ودرجة الاعتماد على هذه الخلايا لتمييز هذه فروعه المكونة للدم نهائياً من النبض الكهرومغناطيسي ولمب (إعادة النظر في الإشارات3،13 ).
فهم الآليات الناظمة البدائية ونهائي مواصفات المكونة للدم من هبسكس المرجح الحرجة لإنتاج استنساخه من فروعه المكونة للدم نهائي عبر مجموعة متنوعة من خطوط هبسك. حتى وقت قريب، هبسك التمايز البروتوكولات التي يمكن أن تفصل multipotent فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي لا يوجد17،15،،من1618، 19،20،21،،من2223،،من2425. العديد من نهج استخدام مصل الدم البقري الجنين (FBS) و/أو الثقافة المشتركة stromal أولاً أوجز إمكانات المكونة للدم هبسك التمايز، مع خليط من البدائية والنهائية المكونة للدم المحتملين15،16، 17،،من1922،،من2325. علاوة على ذلك، وقد وصف العديد من البروتوكولات المكونة للدم خالية من المصل متطلبات إشارة لمواصفات mesoderm من هبسكس التي تؤوي المكونة للدم المحتملة18،،من2021، 24-ومع ذلك، كما لا تزال هذه الأساليب قد أثارت مخاليط غير متجانسة من كلا البرنامجين، قد يكون استخدامها في التطبيقات السريرية، وفهم آليات إنمائية محدودة.
أننا بنينا مؤخرا في هذه الدراسات، وقد حددت احتياجات الإشارات الخاصة بمرحلة أضافت/نضال وإشارات WNT في مواصفات المكونة للدم البدائية ونهائي من mesoderm المستمدة من هبسك18،26 . هذا الأخير كان خاصة فريدة من نوعها، كما استخدامها لمعالجة الإشارات WNT الخاصة بالمرحلة يسمح لمواصفات أما حصرا بدائية أو حصرا فروعه المكونة للدم نهائي26. خلال مواصفات mesoderm، يؤدي إلى تثبيط الإشارات WNT المتعارف عليه مع مثبط بوركن IWP2 مواصفات CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية وفروعه النقوي، مع احتمال اللمفاوية لا يمكن كشفها. في تناقض حاد، أدى حفز الكنسي WNT الإشارات مع مثبط GSK3β، CHIR99021، خلال المرحلة ذاتها من التمايز الغياب الكامل للاكتشاف CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية، بينما تؤدي في الوقت نفسه إلى مواصفات CD34+CD43− أنه. تمتلك هذه الفئة من السكان النقوي، HBG-الإعراب عن محمر، وإمكانات T اللمفاوية. التحاليل اللاحقة حددت هذا كان أنها تفتقر إلى التعبير عن CD7327،28 و CD18428، وإمكاناتها المكونة للدم تعتمد على درجة28. أظهرت التحليلات الاستنساخ علاوة على ذلك، خلية واحدة أن هذه السلالات المكونة للدم نهائي يمكن أن تستمد من خلايا مفردة multipotent28. أخذت معا، تشير هذه الدراسات إلى أن تحديد WNT مرحلة محددة مما يشير إلى التلاعب نقية فروعه المكونة للدم البدائية، أو تعتمد على درجة multipotent نهائي فروعه المكونة للدم.
هنا، فإننا مخطط استراتيجيتنا التمايز غلة فروعه المكونة للدم حصرا بدائية أو نهائية، عن طريق التلاعب بالمتعارف عليه WNT الإشارات خلال الزخرفة ميسوديرمال، وهذه النسب المكونة للدم المصب فحوصات. هذا البروتوكول قيمة كبيرة للمحققين الذين يرغبون في إنتاج بدائية أو نهائي أما فروعه المكونة للدم من هبسكس لتطبيقات الطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الكواشف
،- الحصول على خلية خطوط؛ هيسكس أو هيبسكس 1، الماوس الليفية الجنينية (MEFs) 29، OP9-DL4 ستروما 30 31-
- إعداد كاشف
- تعد حلاً 0.1% w/v الجيلاتين في برنامج تلفزيوني. تعقيم بالتعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية بعد اليقوتينج.
- تحضير بلاستيكواري المغلفة بالجيلاتين. معطف الأطباق 6-جيدا مع 1.5 مل من محلول الجيلاتين 0.1%. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فورا قبل الاستخدام، نضح المتبقية الجيلاتين الحل.
- تحضير الوسائط MEF بجعل إيمدم مع 15% v/v FBS والمضادات الحيوية 1 x. تكملة مع 2 مم L-الجلوتامين و 400 ميكرون مونوثيوجليسيرول (قهوة) قبل استخدامها وتخزينها في 4 ° C.
- إعداد وسائط الثقافة هبسك كحل من DMEM/F12 مع 20% v/v خروج المغلوب المصل الاستبدال (قصر)، 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا) والمضادات الحيوية x 1، 55 ميكرومتر β-mercaptoethanol، مم 2 لتر-الجلوتامين و 10 نانوغرام/مل بفجف. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزينها في الظلام في 4 ° C.
- تحضير المصل خالية يغسل وسائط الإعلام كحل من DMEM/F12 مع 5% v/v قصر و 4 ملم HCl. تصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر، الكوة، وتخزينها في الظلام في 4 ° C. جعل
- 1 ملغ/مل الدناز أنا الحل بتذويب الدناز أنا ح 3-4 في المياه المثلج، العقيمة على الجليد. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
- إعداد الحل وقف مع وسائل الإعلام يغسل: إضافة 10% FBS و 10 ميكروغرام/مل الدناز أنا. وينبغي إعداد الحل إيقاف فورا قبل الاستخدام.
- إعداد مصفوفة الغشاء (مثلاً، ماتريجيل، المشار إليها كحصيرة الممتلكات) حل الخليط.
ملاحظة: ينبغي أن يكون تنفيذ كافة الخطوات إعداد واستخدام خليط حصيرة على الجليد أو في 4 ° جيم ذوبان الجليد مجمدة حصيرة في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تمييع حصيرة 1:1 بإضافة 10 مل المثلج إيمدم والبرد في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تمييع خليط حصيرة مع 20 مل إضافية المثلج إيمدم والبرد في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قاسمة في أنابيب مبردة مسبقاً ومخزن في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. عندما تكون جاهزاً للاستخدام، ذوبان الجليد الخليط الشروط المتفق عليها تبادلياً بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لوحات ثقافة الخلية- معطف حصيرة.
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات لطلاء ألواح حصيرة على الجليد. قبل chill لوحات 6-جيدا وكذلك 24 في-20 درجة مئوية على الأقل 1 ح. عندما تكون جاهزاً للوحات معطف، وضعها على الجليد. معطف كل بئر مع حصيرة 4 x المخفف، إزالة وإعادة استخدام أي حل الزائدة. ترك على الجليد لمدة 30-60 دقيقة، ونضح حصيرة الزائدة. الجاف للألواح المغلفة حصيرة في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة للحد ني حاء 3 الاستخدام داخل ح 72 لطلاء.
- معطف حصيرة.
- إعداد حل 10% ألبومين المصل البقري (BSA) بتذويب 10% w/v جيش صرب البوسنة في الماء المثلج، المقطر، منزوع في 4 درجات مئوية عن 3-4 ﻫ. تصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر في زجاجة حجب الضوء ومخزن في 4 ° C.
- إعداد الحل حمض الأسكوربيك. يحل حلاً 5 ملغ/مل من حمض الأسكوربيك L في الماء المثلج، المقطر، منزوع على الجليد حاء 3-4 دوامة أحياناً حتى يذوب ببطء. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
- تحضير الوسائط التمايز خالية من المصل (الصندوق) بجعل حل أقاليمهم IMDM:Ham ' s F-12، ثم قم بإضافة 0.5% جيش صرب البوسنة، 1 x B27، و 0.5 x N2 ملاحق. مخزن في 4 ° إضافة جيم 1 x لام الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك، 400 ميكرون قهوة، و 150 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين السابقة مباشرة لاستخدام-
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل الخلايا الجذعية (مثلاً، ستيمبرو، يشار SP34 الممتلكات) كل الشركة المصنعة ' تعليمات s. مخزن في 4 ° إضافة جيم 1 x لام الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك، 400 ميكرون قهوة، و 150 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين السابقة مباشرة لاستخدام-
- إعداد الحل "الثاني كولاجيناز" 0.2% بحل "ثانيا كولاجيناز" بتركيز 0.2% w/v في 1:4 FBS:PBS الحل نهائي. تذوب في حمام الماء 37 درجة مئوية على الأقل 15 دقيقة عامل التصفية لتعقيم الحل مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) كحل 5% FBS في إيمدم السابقة مباشرة لاستخدام-
- OP9 إعداد الوسائط كحل α-الفنزويلية، 20% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين، والمضادات الحيوية 1 x. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزينها في 4 ° C.
- الحصول على وسائل الإعلام على أساس ميثيلسيلولوسي (مثلاً، ميثوكولت، يشار إليه كوزارة التعليم والعلوم بالممتلكات) كميات ما قبل اليكووتيد 3 مل أو كزجاجة 100 مل. في حالة استخدام 100 مل وزارة التعليم والعلوم، ولدى وصوله، تقسم إلى مختبرين 2.5 مل في أنابيب مخروطية الشكل 14 مل.
ملاحظة: يجب تخزين كافة مختبرين في-20 درجة مئوية. وزارة التعليم المتوسط ينبغي إذابة مختبرين فورا قبل أن استخدام.
- تعد حلاً 0.1% w/v الجيلاتين في برنامج تلفزيوني. تعقيم بالتعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية بعد اليقوتينج.
2. التفريق بين mesoderm هبسكس
- تنمو هبسك خطوط الخلايا في ميفس إلى كونفلوينسي 70-80%، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
ملاحظة: يجب أن يكون هبسكس حدود حادة وغير متمايزة. - بلاستيكواري المغلفة "إعداد حصيرة" 24 ساعة قبل باساجينج هبسكس-
ملاحظة: يختلف العدد الإجمالي للاطباق 6-جيدا المغلفة حصيرة عبر خطوط هبسك. عادة، تكفي ثلاثة آبار 6 أطباق كل طبق 6-جيدا من هبسكس متكدسة في ميفس.- إجراء محاكمة علبة التغذية بالورق-استنفاد مع نسب مختلفة من آبار hPSCs:MAT المتلاقية (1:4، 1:3، 1:2، إلخ) قبل المفاضلة الأولى لتحديد الأطباق 6-جيدا المغلفة حصيرة كم ينبغي أن تستخدم للاختلاف اللاحقة-
ملاحظة: يجب أن يكون 24 ساعة بعد الطلاء على حصيرة، هبسكس روافد 80-90 في المائة، مع كتل خلية حوالي 10-20 في الخلايا في الحجم.
- إجراء محاكمة علبة التغذية بالورق-استنفاد مع نسب مختلفة من آبار hPSCs:MAT المتلاقية (1:4، 1:3، 1:2، إلخ) قبل المفاضلة الأولى لتحديد الأطباق 6-جيدا المغلفة حصيرة كم ينبغي أن تستخدم للاختلاف اللاحقة-
- اعقلوها هبسك وسائل الإعلام وإضافة 1 مل 37 درجة مئوية 0.25% التربسين-أدتا إلى كل خير بالنسبة للحد الأدنى 1 أسبيراتي وإضافة 1 مل توقف وسائل الإعلام لكل بئر. باستخدام مكشطة خلية، كشط الخلايا خارج اللوحة. أضف 1 مل أغسل المخزن المؤقت لكل بئر.
- مع بيبيت مصلية 2 مل، تريتوراتي 3-5 مرات كسر كتل كبيرة من الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الطرد المركزي هبسكس في 330 x ز للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند الخلايا في إجمالي حجم الوسائط هبسك يعادل 2 مل كل بئر بلاستيكواري المغلفة حصيرة لاستخدامها. إضافة 2 مل/جيدا من هبسكس إلى بلاستيكواري واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
- 24 ساعة في وقت لاحق، نضح وسائط الإعلام، واستبدال مع 37 درجة مئوية 0.05% نضح التربسين-يدتا يدتا التربسين للحد الأدنى 1 وإضافة 1 مل توقف وسائل الإعلام. كشط الخلايا بقوة مع كاشطة لخلية. أضف 1 مل أغسل وسائط لكل بئر. مع بيبيت مصلية 2 مل، تريتوراتي الخلايا 1-2 مرات ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الطرد المركزي خلايا في 220 ز x للحد الأدنى 5
ملاحظة: طول الوقت شو العلاج يدتا التربسينيحدد المحقق لكل خط هبسك دينار. وينبغي تطبيق معاملة التربسين لأطول فترة ممكنة دون أن تسبب تفكك خلية واحدة. هذه الخطوة يجب فصل جميع هبسكس من لوحات المغلفة بالشروط المتفق عليها تبادلياً، ولكن لا تؤدي إلى الانفصال من خلية واحدة. الحديدية الناتجة يجب أن تكون الخلايا 6-10، وفي المتوسط-
نضح - وسائل الإعلام. استخدام بيبيت مصلية 5 مل، ريسوسبيند برفق الخلايا في 20 مل أغسل وسائط الإعلام. أجهزة الطرد المركزي في 220 س ز للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند برفق الحديدية في وسائل الإعلام اليوم 0 (الجدول 1). الاستغناء عن 2 مل التمايز الوسائط التي تحتوي على الحديدية إلى كل من طبق الثقافة خلية منخفض 6-جيدا-تمسكا باستخدام بيبيت مصلية 10 مل جيدا. مكان في 37 درجة مئوية 5% CO 2% 5 س 2 (الغاز متعددة) حاضنة.
ملاحظة: اليوم 0 وسائط الإعلام: وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع 10 نانوغرام/مل BMP4 (الجدول 1). لكل لوحات اثنين من هبسكس، استخدام الخلية منخفض 6-جيدا-تمسكا الثقافة صحن واحد. - 24 ساعة في وقت لاحق، إضافة 2 مل 1 اليوم وسائل الإعلام (الجدول 1). احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة غاز متعددة.
ملاحظة: يوم 1 وسائل الإعلام: وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع 10 نانوغرام/مل BMP4 و 10 نانوغرام/مل بفجف لكل بئر (الجدول 1). - ح 18 في وقت لاحق، حصاد الحديدية مع 5 مل بيبيت المصلية وتدور في 100 غ س لأدنى 5 يغسل برفق والجمع بين ثقافة كاملة مع 10 مل إيمدم. تدور في 100 غ س لأدنى 5 Aspirate وسائط الإعلام-
ملاحظة: سوف يوجد الحطام في الثقافات. هذه الخطوة الطرد المركزي بسرعة منخفضة (100 x ز) سيتم إزالة الأنقاض. - ريسوسبيند الحديدية لطف في وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع وسائل الإعلام يوم 2 (الجدول 1) ومن ثم الاستغناء عن 2 مل كل بئر في لوحات ثقافة الخلية منخفض 6-جيدا-تمسكا. احتضان في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة ل 30 h.
ملاحظة: يوم 2 وسائط الإعلام: 10 نانوغرام/مل BMP4، و 5 نانوغرام/مل بفجف، ومناسبة WNT مؤثر أو خصم (الجدول 1).- إضافة 3 ميكرومتر CHIR99021 لتحديد نهائي فروعه المكونة للدم. وبدلاً من ذلك، أضف 3 ميكرومتر IWP2 و 1 نانوغرام/مليلتر أضافت A لتحديد المتكفل المكونة للدم البدائية.
- الاستمرار في القسم 3 لمواصفات السلف المكونة للدم.
3-مواصفات CD34 + "فروعه المكونة للدم"
- بعد ح 30، عزل الحديدية مع بيبيت مصلية 2 مل في اليوم 3 من التفريق. نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 330 x ز 5 دقيقة ريسوسبيند بلطف ويغسل مع 10 مل إيمدم. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 330 x ز للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند الحديدية في وسائل الإعلام اليوم 3 (الجدول 2)، والاستغناء عن 2 مل في كل من لوحات ملتصقة منخفضة 6-جيدا جيدا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة ل 72 h.
ملاحظة: يوم 3 وسائط: SP34، وتستكمل مع 15 نانوغرام/ملليلتر VEGF وبفجف 5 نانوغرام/مليلتر (الجدول 2). إضافة المزيد من الوسائط للبئر الواحد إذا كان الرقم الهيدروجيني لوسائل الإعلام تحصد في يوم 3 من التمايز تغيرا كبيرا (أي وسائل الإعلام الأصفر-البرتقالي). بدلاً من ذلك استخدام الحديدية أقل للبئر الواحد في اليوم 0- - ح بعد 72 من الحضانة، إضافة 2 مل 6 اليوم وسائل الإعلام (الجدول 2) لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة h. 48 إضافية
ملاحظة: يوم 6 وسائط الإعلام: الإعلام SP34 تستكمل مع 15 نانوغرام/مل فيجف 5 نانوغرام/مل بفجف، 200 نانوغرام/مليلتر SCF، 4 وحدة دولية البراءات، 20 نانوغرام/مليلتر إيل-6، 10 نانوغرام/مل 11 إيل و 50 نانوغرام/مل IGF-1 (الجدول 2). إذا تمت إضافة المزيد من الوسائط في الخطوة 3.1، ثم إضافة المبلغ المعادل لوسائل الإعلام في الخطوة 3، 2 حتى تظل التركيزات سيتوكين النهائي نفسه.
عزل - الحديدية تعامل CHIR99021 في يوم 8 من التفريق. انتقل إلى القسم 4-
- IWP2--يتم حصادها الحديدية المعالجة في يوم 8 من التمايز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 ريسوسبيند برفق في وسائل الإعلام اليوم 8 (الجدول 2). احتضانها ح 24 في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة في الأطباق ملتصقة منخفضة. انتقل إلى القسم 4-
ملاحظة: يوم 8 وسائل الإعلام: الإعلام SP34 تستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر SCF، 2 وحدة دولية البراءات، 10 نانوغرام/مل إيل-6، 5 نانوغرام/مليلتر إيل-11، 25 نانوغرام/مل منتدى إدارة الإنترنت-1، 30 نانوغرام/مليلتر TPO، 10 نانوغرام/مل Flt3-L، و 30 نانوغرام/مليلتر إيل-3 (الجدول 2).
4. الانزيمية تفارق الحديدية والمكونة للدم السلف العزلة
أنبوب- عزل الحديدية مع بيبيت مصلية إلى 50 مل مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية. إضافة
- 2 مل من 0.25% التربسين-يدتا الحديدية. دوامة إينكوباتي س. 5 في حمام مائي 37 درجة مئوية للحد الأدنى 8 إضافة 5 مل من محلول الإيقاف. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية.
- ريسوسبيند الحديدية في 5 مل كولاجيناز الثاني. دوامة ل 5 ق واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 60 دقيقة، دوامة ل 5 ق وإضافة 5 مل من محلول الإيقاف. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية.
- في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، ريسوسبيند الخلايا. تمر الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. يؤدي هذا إلى إزالة أي كتل الخلايا أونديسوسياتيد-
- عد الخلايا. الكوة 1 × 10 6 خلايا في أنبوب مخروطي 14 مل. تدور الخلايا في 330 x ز لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 10 6 خلايا/مل في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. قاسمة وتجمع 10% من الخلايا في كل شرط لتدفق عناصر تحكم بالألوان سيتوميتريك. احتضان الخلايا في أجسام مضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد، وفي الظلام-
ملاحظة: انظر اقترح تركيبات فلوروفوري في الجدول للمواد.- IWP2 لتعامل الخلايا، استخدام الأجسام المضادة-CD34 ومكافحة CD43.
- CHIR99021 لتعامل الخلايا، استخدام الأجسام المضادة-CD34، CD43 المضادة ومكافحة--CD73 ومكافحة--CD184-
- شطف الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا بتركيز نهائي 5 × 10 6 خلايا/مل.
- تحليل أو عزل الخلايا بالتدفق الخلوي. لفروعه المكونة للدم البدائية، تحليل التعبير CD34 و CD43 ( الشكل 2A). لفروعه المكونة للدم نهائي، عزل أنه (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) بنظام مراقبة الأصول الميدانية ( الشكل 2). جمع الخلايا في أنابيب تحتوي على المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية المثلجة.
- لتقييم إمكانات المكونة للدم نهائياً من عزلة أنه، الاستمرار في القسم 5 للانتقال غشائي--إلى--المكونة للدم، أو القسم 7 للمقايسة T اللمفاوية. لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية المكونة للدم البدائية، الاستمرار في القسم 6-
5. الانتقال غشائي--إلى--المكونة للدم
- تدور CD34 المعزولة + CD43 − CD73 − CD184 − ريسوسبيند الخلايا في 330 x ز للحد الأدنى 5 خلايا في أنه وسائل الإعلام في 200,000 خلايا/مل ( الجدول 2). توزيع الخلايا في 50 ميليلتر مختبرين في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا منخفض-ملتصقة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 5% 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون 5% O 2 2 حاضنة غاز متعددة.
ملاحظة: أنه وسائل الإعلام: SP34 وسائل الإعلام وتستكمل مع 5 نانوغرام/مل VEGF، 5 نانوغرام/مل بفجف، 100 نانوغرام/مليلتر SCF، 2 وحدة دولية البراءات، 10 نانوغرام/مل إيل-6، 5 نانوغرام/مليلتر إيل-11, 25 نانوغرام/مل منتدى إدارة الإنترنت-1، 30 نانوغرام/مليلتر TPO، 10 نانوغرام/مل FLT3-L، 30 نانوغرام/مليلتر إيل-3، 10 نانوغرام/مل BMP4، 20 نانوغرام/مليلتر SHH، 10 ميكروغرام/مل "الثاني انجيوتنسين"، وبوتاسيوم اللوسارتان 100 ميكرومتر في 2 × 10 5 خلايا/مل (الجدول 2). - إعداد 24-جيدا المغلفة حصيرة لوحات (راجع الخطوة 1.2.7.1)، وحسب الحاجة.
- الخلايا سوف تتجمع في كتل من 6-10 خلايا بين عشية وضحاها. لكل 50 ميليلتر حجم الخلايا ريجريجاتيد، بلطف نقل الخلايا داخل المركز من صفيحة المغلفة حصيرة 24-جيدا في صباح اليوم التالي. بلطف ضع لوحة في 37 درجة مئوية الغاز متعددة حاضنة ح 4-6، حتى يتم إرفاق الخلايا.
- إضافة 1 مل من وسائل الإعلام أنه الطازجة لكل بئر، بعد أن يتم إرفاق الخلايا. احتضان الخلايا في 5% 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون 5% O 2 2 حاضنة غاز متعددة حتى تظهر الخلايا المكونة للدم (عادة 5-7 أيام؛ الشكل 2D). تصور تحت 100 X التكبير باستخدام مجهر ضوء.
- الحصاد موروث المكونة للدم نهائي بلطف إزالة وسائل الإعلام أنه من الخلايا. تمرير هذه الوسائط من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع. للخلايا ملتصقة في البئر، قم بإضافة 0.5 مل 0.25% التربسين-أدتا إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إضافة 0.5 مل وقف الحل لكل بئر. تمرير من خلال الخلايا من خلال نفس مصفاة خلية 40 ميكرومتر تجمع جميع ملتصقة والخلايا غير ملتصقة معا. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
- لتقييم إمكانات هذه الثقافة معظم مركبات الكربون الكلورية فلورية، تابع إلى القسم 6.
- تغسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 5 × 10 6 خلايا/مل. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على أجسام المضادة CD45 ومكافحة-CD34 لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام (اقترح fluorophores في الجدول للمواد)- أغسل
- الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5 عزل
- CD34 + CD45 + الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية ( الشكل 2E). فرز الخلايا في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية المثلجة.
- تقييم CD34 نهائي + CD45 + فروعه المكونة للدم كاللازمة (مقايسة مركبات الكربون الكلورية فلورية في القسم 6 أو إمكانات اللمفاوية في الفرع 7 المقايسة آخر بدأ المحقق).
6. مركبات الكربون الكلورية فلورية بالانزيم
- ذوبان الجليد مختبرين لوزارة التعليم والعلوم لكل عينة المستخدمة لتحليل مركبات الكربون الكلورية فلورية- إضافة
- الخلايا لتكون جزيئي (خطوات 4.5 أو 4.7 أو 5.5 أو 5.9) في وزارة التعليم والعلوم. دوامة جيدا وترك الثقافات MeC الوقوف لمدة 5-10 دقائق حتى تتبدد فقاعات الهواء، وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. استخدام 16 ½ قياس الإبرة على حقنه 3 مل، بعناية إزالة 2 مل من وزارة التعليم والعلوم-
ملاحظة: نموذجية والطلاء كثافات تتراوح من 1,000 20,000 خلايا/مل، تبعاً لتواتر السلف المتوقعة. - الاستغناء بعناية، 1 مل MeC خلية الخليط في كل واحد من اثنين من الأطباق زراعة الأنسجة 35 ملم. توزيع وزارة التعليم والعلوم في الأطباق 35 ملم بالتنصت بلطف وتدوير الطبق بالتساوي. ضع كل من الأطباق المذكورة أعلاه إلى طبق استنبات الأنسجة 15 سم مملوءة بالمياه. احتضان في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة.
- تصور ثقافات MeC استخدام مجهر ضوء باستخدام 40 X التكبير. تحديد كمية مركبات الكربون الكلورية فلورية المختلفة التي تم الحصول عليها. تحليل فحوصات "البدائية مركبات الكربون الكلورية فلورية" 8-10 أيام بعد الطلاء ( الشكل 2). تحليل فحوصات "نهائية مركبات الكربون الكلورية فلورية" 14 يوما بعد الطلاء. يمكن رؤية الممثل مركبات الكربون الكلورية فلورية المقايسة مستعمرة مورفولوجيس في الشكل 2 واو-
7. والرزن خلية T إلى "وضع نهائي المكونة للدم المحتملة"
- النمو OP9-DL4 الخلايا حتى روافد في طبق استنبات الأنسجة 100 ملم 30 ، 31 ، 32-
- OP9-DL4 ذوبان الجليد خلايا ح 72-96 قبل التصفيحات فحوصات الخلايا T. ريسوسبيند OP9-DL4 الخلايا في 10 مل OP9 وسائل الإعلام والاستغناء عن إلى صفيحة 10 سم. تنمو في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة حتى روافد 70-90 ٪. قم بإزالة الوسائط
- لحصاد الخلايا OP9-DL4 من طبق 100 مم، وإضافة 5 مل 0.25% يدتا التربسين للحد الأدنى 5 وقف النشاط التربسين مع 5 مل OP9 وسائل الإعلام. عد الخلايا وتدور الخلايا في 330 x ز لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل الإعلام OP9-
ملاحظة: لوح 10 سم واحد من الخلايا OP9-DL4 المتلاقية سوف تسفر عن حوالي 10 × 10 6 خلايا OP9-DL4- - ح 48 قبل فحص خلية T، لوحة 2 × 10 6 خلايا في 12 مل OP9 وسائل الإعلام في صحن 24-جيدا (0.5 مل/جيد). تنمو في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة.
- إضافة خلايا 2,000-10,000 تكون جزيئي (كما حصل في خطوات 4.5 أو 4.7 أو 5.5 أو 5.9) 1 جيدا من الخلايا OP9-DL4 في وسائل الإعلام OP9 وتستكمل مع: 30 نانوغرام/مليلتر (أول 6 أيام فقط) من صندوق إنقاذ الطفولة و 5 نانوغرام/مليلتر إيل-7 5 نانوغرام/مليلتر "احتضان" لام FLT3 في 37 درجة مئوية 5% CO 2 لجنة التفاوض الحكومية الدولية أوباتور. تحدث أية تغييرات في وسائل الإعلام في هذه الخطوة.
- كل 4-5 أيام، ممر المتكفل خلية T على الطازجة OP9-DL4 الخلايا اللحمية في طبق 6-جيدا. تريتوراتي الخلايا مع بيبيت 1 مل وتمر من خلال عامل تصفية 40 ميكرون لإزالة كتل. تدور في 330 x ز لأدنى 5 Aspirate قبالة وسائط الإعلام. ريسوسبيند الخلايا في 2 مل الإعلام OP9 جديدة تستكمل مع 5 نانوغرام/مل 7 إيل و 5 نانوغرام/مل Flt3-L، ومكان على الطازجة OP9-DL4 الخلايا.
ملاحظة: 48 ساعة قبل باساجينج، لوحة 2 × 10 6 خلايا OP9-DL4 الطازجة في 12 مل OP9 وسائل الإعلام، وتوزيع 2 مل/بئر إلى الأطباق 6-جيدا- - بعد 21 يوما على الأقل من الثقافة المشتركة، تريتوراتي الخلايا بقوة، وتمر من خلال عامل تصفية 40 ميكرون لإزالة الحطام خلية. تدور في 330 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية. أغسل
- الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية الباردة. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 5 × 10 6 خلايا/مل. خلايا وصمة عار مع الأجسام المضادة CD45 مكافحة و CD56 المضادة ومكافحة CD4 والمضادة-CD8 لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام (fluorophore المقترحة تركيبات في الجدول للمواد). تطبيق وصمة خلية يعيش الميت (DAPI، إلخ) لإزالة الحطام من التحليل- أغسل
- الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
- تحليل الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق لتقييم وجود اللمفاويات التائية موروث ( الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح تخطيطي يصور تنصيب فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي من هبسكس في الشكل 1. Mesoderm الزخرفة قبل الكنسي WNT مما يشير إلى حدوث خلال أيام 2-3 للتمايز، تليها مواصفات السلف المكونة للدم.
تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك ومستعمرة تشكيل فحوصات methylcellulose الثقافات المستمدة من هبسك التمايز المكونة للدم مبينة في الشكل 2. سوف تسفر عن الثقافات التمايز تعامل IWP2 CD34 متميزة+CD43− و CD34منخفضة/−CD43+ السكان، بينما سيكون تعامل تشير تمايز الثقافات < 1% CD43+ الخلايا في يوم 8 من 26من التمايز (الشكل 2 أ، ب). المتكفل المكونة للدم بدائية تستمد تحت ظروف IWP2 معزولة في يوم 9 سوف تؤدي إلى محمر البدائية غالباً (أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية) وفروعه النقوي في فحوصات methylcellulose، بينما تشير تعامل الثقافات ستكون إلى حد كبير خالية من مركبات الكربون الكلورية فلورية يمكن في هذه المرحلة (الشكل 2، F). بدلاً من ذلك، CD34+CD43 السكان– المستمدة من علاج CHIR99021 عدد سكان غير متجانسة، التي تتضمن المتكفل بطانية، فضلا عن CD34+CD43–CD73–CD184– (أنه الشكل 2)، التي عندما تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية، وسيشكل البداية أحادي الطبقة غشائي مثل الخلايا (الشكل 2D، ترك الفريق)، الذي يخضع ثم مرحلة انتقالية غشائي--إلى--المكونة للدم، أسفر عن الجولة، غير ريفراكتيلي-ملتصقة الخلايا المكونة للدم (الشكل 2D، اللوحة اليمنى). ويمكن تقييم هذه الخلايا المكونة للدم بالتدفق الخلوي للتعبير عن CD34 و CD45 (الشكل 2E). المكونة للدم فروعه المعزولة من فحوصات ات يمكن استخدامها في فحوصات methylcellulose، وأن تؤدي إلى وحدات تشكيل مستعمرة كبيرة مثل الاندفاع محمر (أولما-E) والوحدات المكونة للمستعمرة محمر صغيرة (زيمبابوي-E) وفروعه النقوي (زيمبابوي-م؛ الشكل 2 واو).
3 الشكل يصور تدفق الممثل سيتوميتريك تحليلات لفحوصات اللمفاويات التائية المحتملة من CD34 المستمدة من CHIR99021+CD43−CD73−CD184− المكونة للدم موروث (الشكل 3A) والمستمدة من IWP2 (الشكل 3B) CD34+CD43− فروعه المكونة للدم، بعد 21 يوما ثقافة المشارك OP9 DL4. وجود CD45+CD56−CD4+CD8+ السكان في فروعه المستمدة من شير ما يدل على إمكانات المكونة للدم نهائي داخل CD34 الإدخال+ السكان. CD34+ و CD43+ فروعه المعزولة من الاختلاف المستمدة من IWP2 لا تثير الخلايا اللمفية تي في هذا التحليل، تحت هذه الظروف التمايز18،26.
رقم 1: رسم تخطيطي للبروتوكول لمواصفات فروعه المكونة للدم نهائي والبدائية. تصوير الخطوات التجريبية الرئيسية والجداول الزمنية للتفريق بين من الحديدية إلى فروعه المكونة للدم نهائي وبدائية. يتم إنشاؤها الحديدية اليوم 0 من هبسكس على بلاستيكواري المغلفة بالشروط المتفق عليها تبادلياً. وتزرع الحديدية في الصندوق الوسائط التي تحتوي على BMP4 في حاضنة غاز متعددة. في يوم 1 من التمايز، ويتم تغذية الثقافات مع وسائل الإعلام وتستكمل مع BMP4 وبفجف. في اليوم 2، حدوث تغيير وسائط مع WNT التلاعب من خلال الإضافة من CHIR99021 (شير) لنهائي فروعه المكونة للدم و IWP2 لفروعه المكونة للدم البدائية. في يوم 3، يتم تغيير وسائل الإعلام إلى SP34، وتستكمل مع فيجف وبفجف. في يوم 6، ويتم تغذية الثقافات مع وسائل الإعلام وتستكمل مع السيتوكينات المكونة للدم. في يوم 8 من مواصفات المكونة للدم البدائية، يتم تغيير وسائط الإعلام ويتم نقل الخلايا إلى 5% CO2 حاضنة ح 24، متبوعاً بمقايسة الخلية (HPC) السلف المكونة للدم. في يوم 8 من مواصفات المكونة للدم نهائي، CD34+CD43–CD73–CD184– خلايا تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية وجزيئي لإمكانات نهائياً هيموجينيك بطانية، أو إمكانات T اللمفاوية (لا يصور). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل تمايز الثقافات وجيل من فروعه المكونة للدم البدائية. (أ) تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك من فروعه المكونة للدم البدائية من تعامل IWP2 الحديدية في يوم 8. (ب) تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك من معاملة CHIR99021 الحديدية في يوم 8. البطانة هيموجينيك (أنه) يمكن تحديد وعزل CD34+CD43–CD73–CD184– السكان. (ج) إمكانية تشكيل مستعمرة من فروعه المكونة للدم يوم 9 من IWP2--و CHIR99021-(شير) تعامل تمايز الثقافات. n = 3، أشرطة الخطأ تمثل التنمية المستدامة للوسط، والعلامات النجمية تدل دلالة إحصائية، استخدام الاختبار t للطالب * * * ف < 0.0001. (د) صور الممثل معزولة أنه الخلايا بعد 4 أيام (يسار) أو 7 + أيام (يمين) من النمو في بلاستيكواري المغلفة بالشروط المتفق عليها تبادلياً. التكبير الأصلي، 100 X. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. (ﻫ) تدفق الممثل الخلوي التعبير CD34 و CD45 من فروعه المكونة للدم نهائي بعد 9 أيام ثقافة. (و) صورة الممثل عرض مورفولوجيا أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية (يسار)، وزيمبابوي-M (وسط)، أولما ه وزيمبابوي-E (يمين). التكبير الأصلي، 40 س. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. أسهم تشير إلى اسم المستعمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل لإمكانات المكونة للدم نهائي- تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك من إمكانات اللمفاويات T CD34 المستمدة من شير+CD43−CD73−CD184− المكونة للدم موروث (A) أو CD34 (ب) المستمدة من IWP2+CD43 − فروعه المكونة للدم، 28 يوما بعد ثقافة المشارك مع الخلايا OP9-DL4. وتعتبر إمكانات اللمفاويات التائية من عينة إيجابية إذا كان هناك أكثر من 100 CD45+ الكشف عن الأحداث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: الوسائط المستندة إلى الصندوق الاجتماعي للتنمية لأيام 0 - 2-
| SP34 وسائل الإعلام | 3 يوم | 6 يوم | يوم 8 | هو |
| فيجف | 15 نانوغرام/مليلتر | 15 نانوغرام/مليلتر | - | 5 نانوغرام/مليلتر |
| بفجف | 5 نانوغرام/مليلتر | 5 نانوغرام/مليلتر | - | 5 نانوغرام/مليلتر |
| صندوق إنقاذ الطفولة | - | 200 نانوغرام/مليلتر | 100 نانوغرام/مليلتر | 100 نانوغرام/مليلتر |
| مكتب البراءات الأوروبي | - | 4 وحدة دولية | 2 وحدة دولية | 2 وحدة دولية |
| إيل-6 | - | 20 نانوغرام/مليلتر | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل |
| إيل-11 | - | 10 نانوغرام/مل | 5 نانوغرام/مليلتر | 5 نانوغرام/مليلتر |
| منتدى إدارة الإنترنت-1 | - | 50 نانوغرام/مليلتر | 25 نانوغرام/مليلتر | 25 نانوغرام/مليلتر |
| TPO | - | - | 30 نانوغرام/مليلتر | 30 نانوغرام/مليلتر |
| أنطوني-3 لتر | - | - | 10 نانوغرام/مل | 10 نانوغرام/مل |
| إيل-3 | - | - | 30 نانوغرام/مليلتر | 30 نانوغرام/مليلتر |
| BMP4 | - | - | - | 10 نانوغرام/مل |
| SHH | - | - | - | 20 نانوغرام/مليلتر |
| انجيوتنسين الثاني | - | - | - | 10 ميكروغرام/مل |
| بوتاسيوم اللوسارتان | - | - | - | 100 ميكرومتر |
الجدول 2: وسائل الإعلام على أساس SP34 ل 3 أيام - 8 وقال-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب السريع، خالية من المصل، خالية من سدى للتفريق بين فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائية. يمكن تحقيق مواصفات ميسوديرمال من فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائي موثوق استخدام لدينا البروتوكول، الذي يستغل فريد مثبطات جزيء صغير من إشارات WNT المتعارف عليه. الخاصة بالمرحلة WNT التنشيط بواسطة مثبط GSK3β CHIR9902133 تثير mesoderm المكونة للدم نهائياً، بينما تعين تثبيط WNT بمثبطات بوركن IWP234 ميسوديرم المكونة للدم البدائية26. من المذكرة، هذا الأسلوب لا قوة تثير سكان مثل HSC انجرافتابل (غير معروضة). ومع ذلك، فروعه المكونة للدم نهائي ولدت مع هذا النهج قابلة ل engraftment المستحثة بالتحوير المحتملة35، تسليط الضوء على تطبيقاتها المحتملة في المستقبل متعدية.
عاملاً حاسما للتمايز هبسك الناجح هو الحجم الأولى للحديدية التي تتشكل من هبسكس. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون الحديدية حول 6-10 خلايا في الحجم. يمكن تحديد ثقافات التمايز أبيرانتلي خليط من كلا البرنامجين إذا الحديدية كبيرة جداً، ربما بسبب التنشيط إشارة غير لائق داخل المجلس التنفيذي. ينبغي تفتيشها الثقافات التفريق بصريا للحجم الأمثل EB خلال 24 ساعة الأولى من التفريق. بدلاً من ذلك، إذا كان يتم فصلها هبسكس تماما إلى الخلايا المفردة، بدلاً من ذلك هبسكس الخضوع anoikis خلية وفاة36، نتج عنه ضعف التمايز المكونة للدم.
تفريق ناجحة سوف تثير حصرا البدائية فروعه المكونة للدم عند استخدام IWP2 خلال مواصفات ميسوديرمال في أيام 2 و 3 من هذا البروتوكول التمايز. في يوم 8 من التمايز، ينبغي أن تتألف الثقافة المستمدة من IWP2 من CD34 مميزة+CD43−، CD34منتصف المنخفضCD43+، و CD34−CD43+ السكان (الشكل 2A). CD34منتصف المنخفضCD43+ السكان يثير محمر البدائية وفروعه النقوي؛ في حين CD34−CD43+ السكان يؤدي أساسا إلى المتكفل محمر مع محدودية إمكانية النقوي18. الإمكانات البدائية المكونة للدم يمكن أن تؤكده الإنزيم ميثيلسيلولوسي لوجود أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية (المادة 6)، التي يغلب إرادة express جلوبين الجنينية HBE مقارنة بالجنين HBG26، . ،من 2837 وبالمثل فإن وجود CD43+ فروعه المكونة للدم في هذه المرحلة يمكن استخدامها موثوق بها تشير إلى وجود موروث المكونة للدم البدائية18،،من2326. تجدر الإشارة إلى أن التعبير CD43 ليس مقصورا على موروث من23،،من18البرنامج المكونة للدم البدائية26، ولا يمكن استخدامه كمقياس وحيد لتقييم البدائية المكونة للدم المحتملة، إيمونوفينوتيبي، والاعتماد على الشق من الإنسان EMP ما زال أونتشاراكتيريزيد (استعرض في3).
عندما يتم استخدام CHIR99021 خلال الزخرفة ميسوديرمال خلال أيام 2 و 3 للتمايز، وسوف تحدد عدد سكانها حصرا نهائي فروعه المكونة للدم. في يوم 8 من البروتوكول التمايز، ينبغي أن تضم ثقافات المستمدة من CHIR99021 CD34 مميزة+CD43− السكان، مع قليل من لا تعبير CD4326. CD34+CD43− السكان هو عدد سكان غير متجانسة من الخلايا البطانية مع المكونة للدم الوريدي والشرياني المحتملة التي يمكن تحديدها استناداً إلى تعبير CD73 و CD184، مع أنه الخلايا التي تفتقر إلى التعبير عن كلا 27،28. عند انتقال نهائي ومعزول بعد أن خضع الدرجة الأولى تعتمد على غشائي--إلى--المكونة للدم (القسم 5)28 سوف تسفر عن CD34+CD45+ فروعه المكونة للدم التي سوف تؤدي إلى أولما الإلكترونية والخلايا النقوي في ميثيلسيلولوسي، ولكن لا أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية26،28 (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل المستعمرات أولما ه والمقررة لتحليل جلوبين، يغلب الإرادة التي أعرب جلوبين الجنين HBG بالمقارنة مع26، HBE (غير معروضة) الجنينية28، 37. وفي المقابل، يمكن تقييم إمكانات اللمفاوية مباشرة من عزلة، كما يحدث الانتقال تعتمد على الشق غشائي--إلى--المكونة للدم في OP9-DL4 ستروما18،،من2628. النهائي هو المحدد مع هذا الأسلوب يحتوي على موروث اريثرو-ميلو-اللمفاوية في الاستنساخ مستوى28، التي يميزها وظيفيا عن فهمنا الحالي للشراكة الأورو-متوسطية أو لمب المتكفل3. عليه، فإن وجود تي-الليمفاوي و HBG-معربا عن محمر المحتملة، مع غياب إمكانات أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية، يمكن استخدامها بصورة موثوقة تشير إلى المواصفات المكونة للدم نهائياً من هبسكس. من المذكرة، حسب تقييم لفروعه التي يمكن أن تؤدي إلى HBG-الإعراب عن اريثروبلاستس قد لا بدقة تحديد إمكانات نهائي، مشابهة الموضحة أعلاه والنبض الكهرومغناطيسي البشرية ومتطلباتها من الإشارات، ولم يكن وتتميز حتى تاريخه (استعرض في المرجع3).
هذه الاستراتيجية تمايز بسيط قوية جداً كما أنه يسمح لجيل من بدائية حصرا أو حصرا نهائي فروعه المكونة للدم، تمكن المرض النمذجة دراسات مقارنة للبرنامجين من إيبسكس المستمدة من المريض أو هبسكس المعدلة وراثيا. وبالمثل، يمكن استجوابه العمليات التنموية البشرية، مثل اكتشاف ما pathway(s) إشارة إضافية مطلوبة لمنح القدرات الذاتي تجديد، وإمكانات HSC الشبيهة بالتالي، من فروعه المكونة للدم نهائياً.
وباختصار، تعين التلاعب WNT خلال الزخرفة ميسوديرمال في هبسكس CD43 البدائية+ أو CD34 نهائي+CD45+ فروعه المكونة للدم، التي يمكن عزلها والمستخدمة لدراسة هيماتوبويسيس المستمدة من هبسك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
كلية الطب جامعة واشنطن قسم الطب الباطني، "شعبة أمراض الدم"، دعمت هذا العمل. وأيد مؤتمر نزع السلاح T32HL007088 من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد. وأيد "المجتمع الأمريكي لأمراض الدم الباحث جائزة" CMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
