Summary
ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT のステージ固有操作を使用します。
Abstract
再生医療の主な目的の 1 つは、生成、造血幹細胞 (造血) ひと多能性幹細胞 (hPSCs) 由来のメンテナンスです。最近まで、造血に hPSCs を区別するための努力は主に HSC 可能性を欠いて、代わりに卵黄嚢造血のような造血前駆細胞を生成しています。これらの結果の造血前駆細胞は、様々 な成人造血器疾患、リンパ系統の特にそれらの in vitro疾患モデル作製のためのユーティリティ限られている可能性があります。しかし、最近ここの概要ステージ固有分化プロトコルを使用して hPSCs からエリスロ骨髄リンパ多能決定的な造血前駆細胞を生成する方法を説明しました。基底膜マトリックス コーティング容器に hPSCs の酵素分解による胚様体 (EBs) が形成されています。EBs は、中胚葉に GSK3β 阻害剤の CHIR99021 でその後決定的な造血プログラムに指定されている組換え BMP4 によって区別されます。また、原始造血は PORCN 阻害剤の IWP2 によって指定されます。造血はさらに VEGF 組換え添加および支持造血サイトカインを介して駆動されます。このメソッドを使用して生成された結果の造血前駆細胞疾患と発達モデル、体外に使用される可能性があります。
Introduction
ひと多能性幹細胞 (hPSCs) ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を包含として定義され、適切な成長条件下で自己更新を受けていない唯一のユニークな能力を持っています。また、あらゆる細胞に分化する能力が 3 つの胚葉から派生: 外胚葉、中胚葉、内胚葉の1。これらのユニークな能力のためは、hPSCs は、再生医療、疾患モデル作製、細胞ベースの治療2に偉大な約束を保持します。種類の細胞は、hPSCs から正常に分化されている、1 つの重要な課題は大人っぽい hPSC 由来造血幹細胞 (造血)、決定的な造血前駆細胞の in vitro仕様。
HPSCs から人間の HSCs の発展に 1 つの可能性があります障壁ヒト胚3で複数の造血プログラムの存在であります。現れる、「原始的な造血、」と呼ばれる最初のプログラムは胚の卵黄嚢の組織内で起きると巨核球、マクロファージ、赤芽球前駆細胞 (EryP フロン) の一時的な生産が最大の特徴です。特に、このプログラムは、造血に上昇を与えないもそれは T および B リンパ球前駆細胞に上昇を与えるが。ただし、卵黄嚢では、エリスロ骨髄前駆 (EMP4,5,6,7,8) など、制限された決定的な造血前駆細胞に上昇を与えるは一過性赤血球欠乏リンパ プライミング多能性前駆 (LMPP9)。ただし、EMPs でも LMPPs でもない、完全に多能性または成人レシピエントにおける HSC のような生着が可能です。対照的に、開発で後で古典的な定義の「決定的な」造血プログラムは、HSC を含むすべての成人造血系統に上昇を与える、適切な胚大動脈性腺発生地域で指定されます。これら胎児内決定的な造血細胞の仕様は、hemogenic (彼) 内皮3,10,11 から内皮-造血移行を介しての Notch 依存的ファッション ,12,13,14。溶解能力は別として潜在的な multilineage とこれらの細胞の依存性のノッチを EMP と (文献参照3,13 LMPP からこれらの決定的な造血前駆細胞を区別するために使用できます。).
HPSCs からプリミティブと決定的な造血仕様を支配する機構を理解することは可能性が高いさまざまな hPSC ラインの決定的な造血前駆細胞の再現性のある生産に不可欠。最近まで、プリミティブと決定的なの多能性造血前駆細胞を分離できれば hPSC 微分のプロトコルには、15,16,17,18がありませんでした。 19,20,21,22,23,24,25。最初に牛胎児血清 (FBS) および/または間質共培養を使用多くのアプローチ説明プリミティブと決定的な造血潜在的な15,16、混合 hPSC 分化の造血の可能性 17,19,22,23,25。さらに、造血無血清の多くのプロトコルは、港湾の造血潜在的な18,20,21, hPSCs から中胚葉の仕様は信号の要件を説明しています。24します。 ただし、これらのメソッドはまだ両方のプログラムの異種混合物に上昇を与えた、と臨床応用と理解の発達メカニズムの使用は限定される場合があります。
我々 は最近概説アクチビン/節点と hPSC から派生した中胚葉18,26 からプリミティブと決定的な造血仕様における WNT シグナルのステージ固有の信号要件を持つこれらの研究で構築して.ステージ固有 WNT 信号操作の使用は、専らプリミティブまたは決定的な造血前駆細胞26排他的のいずれかの仕様に、後者は特にユニークです。中胚葉仕様、中に PORCN 阻害剤 IWP2 とカノニカル WNT シグナル伝達の阻害の結果 CD43 の仕様で+ EryP フロン ・骨髄前駆細胞、リンパ球検出可能性のないです。対照的に、カノニカル WNT シグナル GSK3β 阻害剤、CHIR99021 と分化の段階で同じ刺激検出 CD43 の完全な不在で起因した+ EryP フロン、同時にリードしながらに、CD34 の仕様+CD43−彼。この人口が骨髄性、所有していたHBG-赤芽球と T リンパ球の可能性を表現します。以降の解析には、CD7327,28 ・ CD18428、その造血可能性の表現としてはノッチ依存28だったこれが識別されます。さらに、単一細胞のクローン性解析は、これらの決定的な造血系統の多能性の単一細胞28が由来することを示した。一緒に取られて、これらの研究は、純粋な原始造血前駆細胞や多能性 NOTCH 依存的決定的な造血前駆細胞、ステージ固有 WNT 操作ができますを示します。
ここでは、我々 は WNT シグナリング中胚葉のパターン形成とその下流の造血系統の試金の操作を介して排他的プリミティブまたは決定的な造血系細胞を生成する我々 の差別化戦略を概説します。このプロトコルは、再生医療用 hPSCs からプリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の生産に興味を持っている研究者に大きな価値です。
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Protocol
1 試薬
- 取得細胞ライン; hESCs または hiPSCs 1、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 29, OP9 DL4 実質 30 ,。 31.
- 試薬調製
- PBS でゼラチンの 0.1% の w/v ソリューションを準備します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい、早かった後 4 ° C で保管を。
- ゼラチン コーティングの容器を準備します。0.1% ゼラチン液 1.5 mL でコート 6 よく料理します。室温で 15 分間インキュベートします。使用の直前に残りのゼラチン液を吸い出しなさい 。
- 15 %v/v FBS と 1 x 抗生物質 IMDM、MEF メディアを準備します。使用する前に 2 mM L グルタミン 400 μ M monothioglycerol (MTG) と補完し、4 で保存 ° C
- は、20 %v/v ノックアウト血清交換 (KOSR) を含む DMEM/F12 のソリューションとして hPSC 培地、1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)、1 x 抗生物質、55 μ M β-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン 10 ng/mL bFGF を準備します。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、暗闇の中で保管して 4 ° C
- 5 %v/v KOSR DMEM/f12 キーと 4 mM 塩酸フィルター分注、2 μ m のフィルターで滅菌し、暗闇の中で保管して 4 のソリューションとして血清無料準備洗浄メディア ° C
- を作る 1 mg/mL DNase 私 DNase を溶解することによりソリューション私は氷のように冷たい、滅菌脱イオン水に 3-4 時間。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、-20 で因数を格納する ° C
- 洗浄メディアでストップ ソリューションの準備: 追加 10 %fbs と 10 μ G/ml DNase 私。ストップ ソリューションを用意する必要があります使用の直前にします 。
- の準備 (例えば マトリゲル、ここに至ってマットと呼ばれる) の基底膜マトリックス混合溶液
。 注: 4、氷の上に準備とマットの混合物を使用してすべてのステップが実行必要があります ° C. 雪解けの 4 ° C で氷でマットは夜間に凍結します。10 mL を追加することでマットを 1:1 希釈冷たい IMDM と一晩 4 ° C で氷の寒さ。追加 20 mL とマットの混合物を希釈冷たい IMDM と一晩 4 ° C で氷の寒さ。中古冷蔵チューブに使用するまで-20 ° C でストア因数。使用する準備ができたら、解凍 4 ° C で一晩マットの混合物- コート マット細胞培養皿
。 注: コーティング マット板のすべてのステップは、氷の上行わなければなりません。事前に少なくとも 1 時間-20 ° C で 6、24 ウェル プレートを冷やします。コート プレートに準備ができたら、それらを氷の場所します。4 x 希釈マット、削除し、余分なソリューションを再使用の各ウェルをコートします。30-60 分間氷の上を残し、余分なマットを吸引します。ドライ コーティングの 72 h 以内 3 h 使用の最低 37 ° C 5% CO 2 インキュベーターでマット コーティング プレート.
- コート マット細胞培養皿
- 10% の溶液を準備 3 4 4 遮光ボトルや店舗に 2 μ m のフィルターで滅菌フィルターのための 4 ° C で氷冷、蒸留水、脱イオン水で 10 %w/v BSA を溶解することにより牛血清アルブミン (BSA) ° C
- は、アスコルビン酸溶液を準備します。3 4 時々 溶解するまで旋回のため氷の上の冷たい、蒸留水、脱イオン水で L-アスコルビン酸の 5 mg/mL の溶液をゆっくりと溶解します。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、-20 で因数を格納する ° C
- は、IMDM:Ham の 75: 25 のソリューションを無血清分化 (SFD) メディアを準備 ' s F-12、0.5 %bsa、B27 と 0.5 x N2 サプリメント x 1 を追加。店で 4 ° c. の追加 1 x L グルタミン、50 μ g/mL アスコルビン酸、MTG、400 μ M 150 μ g/mL ホロ トランスフェリンのすぐ前を使用する 。
- 、メーカーごとの幹細胞の無血清培地 (例えば StemPro、ここに至って SP34 と呼ばれる) の準備 ' の指示。店で 4 ° c. の追加 1 x L グルタミン、50 μ g/mL アスコルビン酸、MTG、400 μ M 150 μ g/mL ホロ トランスフェリンのすぐ前を使用する 。
- は、最終濃度 0.2 %w/v 1:4 FBS:PBS 溶液中に溶解のコラゲナーゼ II によって 0.2% コラゲナーゼ II ソリューションを準備します。少なくとも 15 分フィルター 2 μ m フィルター ソリューションを殺菌し-20 で因数を格納 37 ° C の水浴中で溶ける ° C
- 5% の解決策として並べ替え蛍光活性化セル (FACS) バッファーを準備使用するすぐに事前 IMDM の FBS 。
- 準備 OP9 メディア α MEM, 20 %fbs, L-グルタミン, 2 mM のソリューションとして、1 x 抗生物質。フィルター 2 μ m のフィルターで滅菌し、4 で保存する ° C
- は、3 mL の前検体量、または 100 mL ボトルとしてセルロース ベースのメディア (例えば MethoCult、ここに至ってメックと呼ばれる) を取得します。到着時に 100 mL メックを使用している場合は分割 14 mL の円錐管に 2.5 mL 因数
。 注: すべての因数は-20 ° C MeC 培地因数は直前に解凍する必要がありますに格納される必要がありますを使用します 。
- PBS でゼラチンの 0.1% の w/v ソリューションを準備します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい、早かった後 4 ° C で保管を。
2。HPSCs の中胚葉分化
MEFs に- 、hPSC の成長細胞株の 5% CO 2 と 37 ° C の定温器で、70-80% の confluency
。 注: hPSCs はシャープ、未分化の境界線を持つ必要があります 。
- 準備マット コーティング容器、hPSCs を通過する前に 24 h.
注: マット コーティング 6 よく料理の総数は hPSC ラインで異なります。通常、6 も 3品で MEFs に合流 hPSCs の 6 ウェル皿あたり十分です。 後続の区別に使用するどのように多くのマット コーティング 6 よく料理を決定する最初の分化前に、合流 hPSCs:MAT 井戸 (1:4、1:3、1:2 など) の縦横比の異なる- 実行試みフィーダー枯渇します
。 注: hPSCs、マットの上にメッキ後 24 h はセルのサイズで約 10-20 細胞の塊で、80-90% の合流をする必要があります 。
- 実行試みフィーダー枯渇します
- HPSC メディアを吸引し、37 ° C 0.25% トリプシン-EDTA 各 1分間吸引も、各ウェルに 1 mL 停止メディアを追加 1 mL を追加。細胞スクレーパーを使用して、プレートから細胞をこすり取る。各ウェルに 1 mL 洗浄バッファーを追加します。
- 2 mL の血清ピペットを使い、カップ刻んだ 3 - 5 回細胞の大きな塊を分割し、50 mL の円錐管にセルを転送します。遠心分離機の 330 x g で 5 分間で hPSCs
- HPSC メディア 2 mL と同等の容量のセルも使用するマット コーティング容器のあたりに再懸濁します。容器に hPSCs の 2 mL/井戸を追加し、5% CO 2 と 37 ° C のインキュベーターで一晩インキュベートします 。
- 24 h 後、メディアを吸引し、37 ° C 0.05% で置き換えます 1 分トリプシン-EDTA トリプシン-EDTA の吸引し、1 mL 停止メディアを追加します。細胞スクレーパーと積極的に細胞をこすり取る。各ウェルに 1 mL 洗浄メディアを追加します。2 mL の血清ピペットを使い、カップ刻んだセル 1-2 回と 50 mL の円錐管に転送します。220 x g で 5 分間で細胞を遠心
注: トリプシン-EDTA 処理翔の時間の長さld は、hPSC 行ごとに治験責任医師によって決定されます。トリプシン処理は、可能な限りの単一細胞解離を引き起こすことがなく適用されるべき。この手順はマット コーティング プレートからのすべての hPSCs をデタッチする必要がありますが単一細胞解離にはなりません。結果 EBs 平均 6-10 セルである必要があります 。
- は、メディアを吸い出しなさい。5 mL の血清ピペットを使用して、軽く 20 mL 洗浄メディアで細胞を再懸濁します。220 x g で 5 分間遠心
- には、0 日目メディア (表 1) での EBs 優しく再懸濁します。2 mL の 10 mL の血清ピペットを使用して 6 ウェル低付着性細胞培養皿の各ウェルに EBs を含む分化培を調剤します。37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (複数ガス) インキュベーターにします
。 注: 0 日メディア: SFD 培地 10 ng/mL BMP4 (表 1)。HPSCs のすべての 2 つのプレート、1 つ 6 ウェル低付着性細胞培養皿を使用します 。
- 24 h 後に、2 mL 1 日 1 メディア (表 1) を追加します。複数のガスのインキュベーターで一晩細胞をインキュベートします
。 注: 1 日目メディア: SFD 培地 10 ng/mL BMP4 と (表 1) 各ウェルに 10 ng/mL bFGF 。
- 18 時間後、慎重に 5 mL の血清ピペット 100 x g で 5 分間洗浄でのスピンと EBs の収穫、全体の文化を組み合わせて 10 mL IMDM。100 x g で 5 分間吸引メディアでスピンします
。 注: 文化の残骸が残ります。低速 (100 x g) でこの遠心分離のステップが残骸が削除されます 。
- 日 2 メディア (表 1) を添加した SFD メディアで EBs を優しく再懸濁し、6 も低付着性細胞培養プレートによくあたり 2 mL を調剤します。30 のための 37 ° C マルチガス インキュベーターで孵化させなさい
注: 2 日目メディア: 10 ng/mL BMP4 と 5 ng/mL bFGF 適切な WNT アゴニストやアンタゴニスト (表 1)。- 追加 3 μ M 決定的な造血前駆細胞を指定する CHIR99021。また、3 μ M を追加 IWP2、1 ng/mL アクチビン A 原始造血前駆細胞を指定します 。
- 造血前駆仕様のセクション 3 に続行します
3. CD34 の仕様 + 造血前駆細胞
- 30 時間後の分化の日 3 血清学的 2 mL ピペットを使い、EBs を分離します。50 mL の円錐管に移し、遠心分離機の 330 x g で 5 分は軽く再懸濁します、IMDM の 10 mL で洗浄します。330 x g で 5 分間で再び細胞を遠心
- 日 3 メディア (表 2) で EBs を再懸濁します、低付着性 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL を分注します。72 h の 37 ° C マルチガス インキュベーター内のセルを孵化させなさい
注: 3 日目メディア: SP34、15 の VEGF の ng/mL と 5 ng/mL bFGF (表 2) を添加しました。分化の 3 日目で収穫されるメディアの pH は (すなわち 黄色-オレンジ色のメディア) 変わって大幅場合は、ウェルあたりより多くのメディアを追加します。また、0 日目にウェルあたり少ない EBs を使用します 。
- 後 72 時間培養の日 6 メディア (表 2) の 2 mL を各ウェルに追加します。追加 48 h の 37 ° C のマルチガス インキュベーターで孵化させなさい
注: 6 日目メディア: SP34 培地 15 ng/mL VEGF、5 ng/mL bFGF、200 ng/mL SCF、4 IU EPO、20 ng/mL IL 6、10 ng/mL、IL 11、50 ng/mL IGF-1 (表 2)。場合はより多くのメディアは、ステップ 3.1 で追加された、その追加メディアの相当額 3.2 で、最終的なサイトカイン濃度は変わりません 。
- は、分化の 8 日目で CHIR99021 扱われる EBs を分離します。セクション 4 に進みます 。
- IWP2-50 mL の円錐管への分化は 8 日扱われる EBs を収穫しています。330 x g で 5 分間遠心は優しく日 8 メディア (表 2) に再懸濁します。低付着性料理 37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで 24 時間インキュベートします。セクション 4 に進みます
。 注: 8 日目メディア: SP34 培地 100 ng/mL SCF、2 IU EPO、10 ng/mL IL 6、5 ng/mL IL 11、25 ng/mL IGF-1、30 ng/mL TPO、10 ng/mL、Flt3 L、30 ng/mL IL 3 (表 2).
4。EBs の解離・造血前駆細胞分離酵素
- 50 mL の円錐形に血清ピペットを使い、EBs の分離管。330 x g で 5 分吸引、上澄みを離れて間遠心します 。
- は、EBs に 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加します。停止液を 8 分追加 5 ml 37 ° C の水浴中 5 s. 加温の渦。330 x g で 5 分吸引、上澄みを離れて間遠心します 。
- は、コラゲナーゼ II の 5 mL の EBs を再懸濁します。渦 5 s と 37 ° C の水浴で孵化させなさい。60 分、5 の渦後 s、停止液を 5 mL を追加。上清を 5 分吸引 330 x g でスピンします 。 FACS バッファーの
- で 1 mL では、細胞を再懸濁します。40 μ m の細胞ストレーナーをセルを通過します。これはいずれかの微量細胞塊を削除します 。
- のセルをカウントします。14 mL の円錐管に分注 1 x 10 の 6 セル。FACS バッファーに 5 × 10 6 セル/ml の濃度で細胞再懸濁します 5 分 330 x g でセルをスピンします。流れフローサイトメトリーによるカラー コントロールの各条件のセルの因数とプールの 10%。暗闇の中、氷の上で 30 分間抗体で細胞をインキュベートします
。 : 注 テーブルの材料 に蛍光体の組み合わせを提案しました。- の IWP2 処理細胞、抗 CD34 とアンチ CD43 抗体を使用します 。
- の CHIR99021 処理細胞、反 CD184 反-CD73、アンチ CD43 抗 CD34 抗体を使用します 。
- FACS バッファーを使用して 2 回細胞をすすいでください。330 x g でスピンの 5 分は、最終 5 x 10 6 セル/mL の濃度で細胞を再懸濁します 。 フローサイトメトリーによる細胞は
- 分析または分離。プリミティブの造血前駆細胞 CD34 と CD43 式 ( 図 2 a) を分析します。決定的なの造血前駆細胞の分離、彼 (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) によって FACS ( 図 2 b)。チルドの FACS バッファーを含む管内細胞を収集します 。 決定的な造血の可能性を評価するために
- 彼の分離、内皮-造血遷移のセクション 5 または T リンパ球の試金のためのセクション 7。プリミティブの造血 CFC アッセイのセクション 6 に進みます 。
5。内皮-造血遷移
- スピン分離 CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − 330 x g で 5 分間で細胞再懸濁します彼の細胞で 200,000 セル/mL (メディア表 2)。96 ウェル低付着性細胞培養プレートで 50 μ L の因数でセルを配布します。37 ° C 5% CO 2 5% O 2 マルチガス インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします
。 注: 彼はメディア: 10 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-11、25 ng/mL 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L、30 ng/mL IL 3 IGF-1、2 IU EPO 100 ng/mL SCF 5 ng/mL bFGF 5 ng/mL VEGF 添加 SP34 メディア、10 ng/mL BMP4、20 ng/mL SHH、10 μ g/mL アンジオテンシン II および 2 x 10 5 セル/mL (表 2) で 100 μ M ロサルタン カリウム。 - (ステップ 1.2.7.1 参照) 24 ウェルでマット コーティングのプレートを必要に応じて準備します 。
- セル一晩 6-10 セルの塊に集計されます。細胞細胞のそれぞれの 50 μ L のボリューム、そっと次の朝、24 ウェル マット コーティング プレートの中心にセルを転送します。セルがアタッチされるまで優しく 4-6 時間、37 ° C マルチガス インキュベーターでプレートを配置します 。 セルを接続した後、
- は各ウェルに新鮮なメディアの 1 つの mL を追加します。造血細胞が表示されるまで、37 ° C 5% CO 2 5% O 2 マルチガス インキュベーターでセルを孵化させなさい (通常 5-7 日; 図 2 D)。光学顕微鏡下で 100 倍の倍率を視覚化します 。
- 優しく細胞から彼のメディアを削除することによって決定的な造血前駆細胞を収穫します。このメディアを 40 μ m の細胞のストレーナを通過し、収集します。よく付着性のセル、追加 0.5 mL 0.25% トリプシン-EDTA のセルに 5 分追加 0.5 mL ストップ ソリューションを各ウェルの 37 ° C で孵化させなさいと。すべての付着をプールに同じ 40 μ m セル ストレーナーを介して細胞と非付着性のセルを一緒に通過します。330 x g で 5 分間で回転
- この大量培養の CFC の可能性を評価するためのセクション 6 に進みます 。
- FACS バッファーで 2 回洗浄を行う。330 x g で 5 分間で回転
- では、5 x 10 6 セル/mL で FACS バッファー内細胞を再懸濁します。暗闇の中で氷の上で 30 分間抗 CD45、抗 CD34 抗体で細胞を染色 (fluorophores が付いている テーブルの材料 を提案).
- は、FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
- 分離 CD34 + CD45 ( 図 2 e) FACS による細胞の +。チルドの FACS バッファーにセルを並べ替えします 。
- 決定的な CD34 を評価 + CD45 + 造血前駆細胞として必要な (セクション 6、7 節のリンパの可能性または別の自主測定で CFC アッセイ).
6。CFC アッセイ
- CFC アッセイ用各サンプルのメックの因数を解凍 。
- は、4.5、4.7、5.5、または 5.9 を測定した (ステップするには) をメックにセルを追加します。渦徹底的にさせ製造業者に従って、空気の泡を散らすまでの 5-10 分略、メック文化 ' の指示。16 を使用 ½ 3 mL の注射器の針のゲージ、MeC の 2 mL を慎重に削除します
。 注: 一般的なめっきの密度の範囲 1,000-20,000 セル/ml 予想される前駆頻度に応じてします 。
- は、慎重に 1 mL 各 2 35 mm ティッシュの培養皿のメック細胞の混合物を分配します。軽くタップ、皿を回転させて 35 mm 料理メックを均等に配る。15 cm 培養皿に上記料理の各場所は、水で満たされました。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで孵化させなさい 。
- は、40 倍の倍率を使用して光学顕微鏡を使用するカルチャのメックを視覚化します。得られる様々 なフロンを定量化します。原始的な CFC アッセイ ( 図 2) をめっき後 8-10 日を分析します。めっき後 14 日決定的な CFC アッセイを分析します。 図 2 階 に見られる代表的な CFC アッセイ コロニー形態 。
7。確立決定的な造血潜在的に T 細胞アッセイ
- , を 100 mm 培養皿 30 合流まで細胞の成長 OP9 DL4 の 31 , 32.
- 雪解け OP9 DL4 細胞 T 細胞試金をめっき前に 72 96 h。10 mL OP9 メディアで DL4 OP9 細胞を再懸濁し、10 cm のプレートに分注します。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで 70-90% 合流まで成長します 。 100 mm ディッシュから DL4 OP9 細胞を収穫する
- メディアを取り出し、0.25 %5 mL を追加 5 分トリプシン-EDTA 停止 5 mL OP9 メディアとトリプシン活性。スピン再懸濁します 5 分 330 x g でセル 1 mL OP9 メディア内のセルとセルをカウントします
。 注: 合流する OP9 DL4 セルの 1 つの 10 cm プレートになります約 10 x 10 6 細胞 OP9 DL4 。
- プレート 2 x 10 6 12 mL OP9 細胞 T 細胞アッセイする前に 48 h 24 ウェル皿 (0.5 mL/ウェル) にメディア。37 ° C 5% CO 2 インキュベーターで成長です 。
- OP9 DL4 細胞 OP9 培地の 1 に (、4.5、4.7、5.5、または 5.9 の手順で得られた) を試金するため 2,000-10,000 のセルを追加: 30 ng/mL SCF (最初 6 日のみ)、5 ng/mL IL-7、5 ng/mL FLT3 L. インキュベート 37 ° C 5% CO 2 社ubator。このステップでメディアの変更は発生しません 。
- すべての 4 - 5 日間、通過 6 よく料理に新鮮な OP9 DL4 の間質細胞に T 細胞の前駆細胞。1 mL ピペットで細胞をカップ刻んだし、塊を削除する 40 μ m のフィルターを通過します。330 の x g で 5 分間吸引メディア オフで回転します。新鮮な OP9 培地 5 IL-7 の ng/mL と 5 ng/mL Flt3-L は、新鮮な DL4 OP9 細胞上の場所の 2 mL の細胞を再懸濁します
。 注: 通過、前に 48 h 12 mL OP9 メディアに 2 × 10 6 新鮮な OP9 DL4 細胞をプレートし、6 よく料理に 2 mL/ウェルを配布します 。
- 精力的に共培養の少なくとも 21 日後カップ刻んだ細胞と細胞の残骸を削除する 40 μ m のフィルターを通過します。5 分間 330 x g でスピンし、上清を吸引します 。
- 冷たい FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
- では、5 x 10 6 セル/mL で FACS バッファー内細胞を再懸濁します。(推奨される蛍光体の組み合わせは、テーブルの材料) 暗闇の中で氷の上で 30 分間抗 CD8 抗 cd4 抗体、抗 CD56 抗 CD45 抗体で染色細胞。分析からの残骸を削除するライブ/死細胞染色 (DAPI、等) を適用します 。
- は、FACS バッファーで 2 回洗浄します。330 x g で 5 分間で回転
- T リンパ球前駆細胞 ( 図 3) の存在を評価する流れの cytometer を使用して細胞を分析します 。
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Representative Results
HPSCs からプリミティブと決定的な造血前駆細胞の誘導を描いた回路図は図 1に示します。中胚葉分化、造血前駆仕様に続いての 2 ~ 3 日中に発生するカノニカル WNT によるパターニングします。
代表フローサイトメトリーによる解析とコロニー形成 hPSC 由来造血分化文化のセルロースの試金は図 2のとおりです。IWP2 扱われる分化培養を行えば、異なる CD34+CD43−と CD34低/−CD43+人口、CHIR 扱われる分化文化が < 1 %cd43 の 8 日目で細胞の+分化 (図 2 a、B)26。日 9 に分離された IWP2 の条件の下で派生した原始造血前駆細胞に上昇を与える主に原始赤血球 (EryP フロン)、セルロースの試金の骨髄前駆細胞 CHIR 治療文化はフロンを欠いている主なる一方(図 2f) この段階で可能性があります。代わりに、CD34+CD43 に由来する CHIR99021 治療-人口は CD34 と同様に血管内皮前駆細胞を含む異種集団+CD43-CD73-CD184-彼 (図 2 b) ときに FACS により分離、当初、ラウンド、屈折非付着の結果、内皮-造血の移行を受ける (図 2 D、左のパネル) のような血管内皮細胞単層を形成します。造血細胞 (図 2 D、右側のパネル)。これらの造血細胞 CD34 と CD45 表現のためのフローサイトメトリーによって評価される (図 2 e)。EHT の試金から分離した造血前駆細胞はセルロースの試金で使用することができ、大規模なバーストのような赤芽球コロニー形成単位 (BFU E)、小赤芽球コロニー形成単位 (CFU-E)、および骨髄前駆細胞 (CFU M; を生じ図 2 f)。
図 3は、CHIR99021 由来の CD34 から潜在的な T リンパ球の試金の代表的なフロー フローサイトメトリーによる解析を示しています+CD43−CD73−CD184−造血前駆細胞 (図 3 a)IWP2 派生と (図 3 b) CD34+CD43 OP9 DL4 共培養の 21 日に続く−造血前駆細胞。CD45 の存在+CD56−CD4+CD8+ CHIR 由来の前駆細胞の人口は決定的な入力の cd34 陽性造血可能性を示す+の人口。CD34+と CD43+ IWP2 由来の分化から分離された前駆細胞に与えていない上昇 T リンパ球この分析では、これらの分化条件18,26。
図 1: 決定的な原始的な造血前駆細胞の仕様のためのプロトコルの概略図。主な実験手順と EBs から決定的な原始的な造血前駆細胞への分化のタイムラインの描写。EBs はマット コーティングの容器に hPSCs から 0 日目に生成されます。EBs は、BMP4 マルチガスのインキュベーターで SFD 培地で栽培しています。分化の日 1、文化は、BMP4 と bFGF 補完メディアで供給されます。2 日目は、メディア変更は原始造血前駆細胞の決定的な造血前駆細胞と IWP2 の CHIR99021 (CHIR) の添加による wnt シグナル操作で発生します。3 日目は、メディアは VEGF と bFGF 添加 SP34 に変更されます。6 日目で文化が造血サイトカインを添加したメディアにうんざり。プリミティブの造血仕様の 8 日、メディアが変更され細胞が造血前駆細胞 (HPC) 試験に続いて、24 時間 5% CO2インキュベーターに移動されます。決定的な造血仕様、CD34 の 8 日目で+CD43-CD73-CD184-細胞の FACS により分離の決定的な hemogenic 内皮可能性または T リンパの可能性 (描かれていない)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 原始造血前駆細胞の発生と分化の文化の分析。(A) 代表的なフロー フローサイトメトリー解析 IWP2 扱われる EBs は 8 日から原始造血前駆細胞の。(B) 代表的なフロー フローサイトメトリー解析 CHIR99021 扱われる EBs は 8 日から。Hemogenic 血管内皮細胞 (彼) を識別して、CD34 として分離された+CD43-CD73-CD184-の人口。(C) IWP2 - と CHIR99021 - から 9 日造血前駆細胞のコロニー形成の可能性 (CHIR) 扱われる分化文化。n = 3、誤差範囲を表す平均の SD、アスタリスクを示す統計的有意は、スチューデントの t 検定を使用して * * * p < 0.0001。彼は (左) 4 日または 7 + マット コーティング容器上の成長 (右) 日後細胞分離の (D) の代表的な写真。画像の倍率は 100 倍。スケール バー = 100 μ m. (E) 代表フローサイトメトリー文化の 9 日後決定的な造血前駆細胞から CD34 と CD45 表現。(F) 代表的な写真 (左) EryP フロン、CFU M (中央)、BFU E CFU-E (右) の形態を示します。画像の倍率は 40 倍。スケール バー = 100 μ m。 矢印は植民地の名前を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 決定的な造血電位の解析。CHIR 由来 cd34 陽性 T リンパ球を潜在的な代表的なフロー フローサイトメトリー解析+CD43−CD73−CD184−造血前駆細胞 (A) または (B) CD34 の IWP2 から派生した+CD43−造血前駆細胞、DL4 OP9 細胞との共培養後 28 日目。サンプルから T リンパ球の可能性は以上 100 CD45 がある場合は、正と見なされます+検出されたイベント。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 日間 0 SFD ベースのメディア-2.
| SP34 メディア | 日 3 | 日 6 | 日 8 | 彼 |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | - | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | - | 5 ng/mL |
| SCF | - | 200 ng/mL | 100 ng/mL | 100 ng/mL |
| EPO | - | 4 IU | 2 IU | 2 IU |
| IL-6 | - | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL 11 | - | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | - | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | - | - | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| フェルマーの最終定理-3 L | - | - | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL 3 | - | - | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | - | - | - | 10 ng/mL |
| しゃべる | - | - | - | 20 ng/mL |
| アンジオテンシン II | - | - | - | 10 μ G/ml |
| ロサルタン カリウム | - | - | - | 100 Μ M |
表 2: 日 3 SP34 ベースのメディア-8 と。
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Discussion
このプロトコルでは、プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の分化の急速、血清無料、実質無料のメソッドについて説明します。プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の中胚葉性仕様は、一意にカノニカル WNT シグナルの小分子阻害剤を悪用当社のプロトコルを使用して確実に実現できます。CHIR9902133 GSK3β 阻害剤によるステージ固有 wnt シグナルの活性化を生じさせる決定的な造血中胚葉、一方 IWP234 PORCN 阻害剤による WNT 阻害は原始造血中胚葉26を指定します。注記のうち、このメソッドは確実与えない上昇 (図示せず) engraftable HSC のような人口に。ただし、この方法で生成された決定的な造血前駆細胞は、潜在的な将来の医療アプリケーションを強調表示生着の遺伝子による潜在的な35に適しています。
成功 hPSC 分化に重要な決定要因は、hPSCs から形成されている EBs の初期サイズです。理想的には、EBs の周りする必要がありますサイズの 6-10 セル。分化文化 EBs が大きすぎて、理事会内での不適切な信号活性化による可能性がある場合、両方のプログラムの混合物異常を指定できます。分化文化は、分化の最初の 24 時間以内に最適な EB サイズの視覚的に検査する必要があります。また場合は、hPSCs は、単一のセルに完全に分離、hPSCs は代わりにアノイーキス細胞死36、貧しい造血分化の結果を受けます。
IWP2 を使用して 2 日間、この分化プロトコルの 3 胚葉仕様の際に、正常な分化は専らプリミティブの造血前駆細胞に上昇を与えます。分化は 8 日、IWP2 から派生した文化は異なる CD34 ので構成する必要があります+CD43−CD34低/低半ばCD43+、および CD34−CD43+集団 (図 2 a)。CD34低/低半ばCD43+人口原始的な赤芽球、骨髄前駆細胞に上昇を与える一方、CD34−CD43+の人口は主に限られた骨髄性電位18赤芽球系前駆細胞に上昇を与えます。EryP フロン (セクション 6) は主に胎児HBG26と比較して胚グロビンHBEを表現の存在をメチル セルロース法による原始造血可能性を確認できます。 28,37.CD43 の存在同様に、+原始造血前駆細胞18,23,26の存在は示すこの段階で造血前駆細胞を確実に使用できます。CD43 式が原始造血プログラム18,23,26の前駆細胞に排他的ではない、原始造血を評価する唯一の基準として使用ことはできません、それは注意してください。潜在的なイムノフェノ タイプと人間の依存性のノッチとして EMP ままメタボライト (文献3)。
CHIR99021 を使用して、2 と分化の 3 日の間に中胚葉形成の際に、専用の決定的な造血前駆細胞の人口が指定されます。差別化プロトコルの 8 日、CHIR99021 から派生した文化独特の cd34 陽性で構成する必要があります+ほとんどない CD43 式26の CD43−人口。CD34+CD43−人口は両方のの表現に欠けている彼のセルに CD73 と CD184 の式に基づく画定できる造血同期、静脈、動脈の可能性と内皮細胞の異種集団27,28。CD34 になるときに彼は孤立してノッチ依存性血管内皮-造血を経て決定的な移行 (セクション 5)28 +CD45+ BFU E と顆粒球系細胞に上昇を与える造血前駆細胞メチル セルロース、しかしない EryP フロン26,28 (図 2)。さらに、BFU E 植民地を分離およびは主にエクスプレス胚HBE (図示せず)26,28,と比較して胎児のグロビンHBGグロビン分析評価できる37. 対照的に、リンパの可能性を直接評価するから分離された彼は、OP9 DL4 実質18,26,28でノッチに依存した内皮-造血変化が発生するとします。彼はこのメソッドで指定された決定的なにはクローン レベル28、機能的 EMP や LMPP の前駆細胞3の私達の現在の理解からそれを区別する、エリスロ骨髄リンパ球前駆細胞が含まれます。このような T リンパ球とHBGの存在として-EryP フロン可能性の欠如と相まって、潜在的な赤芽球を表現するを使用すると hPSCs から決定的な造血仕様を確実に指定できます。注、 HBGに上昇を与えることができる前駆細胞の評価のみの-赤芽球の表現として、上で説明した、人間の EMP とその信号の要件と同様、決定的なポテンシャルを正確に判断することがない、されていません日付への (参照3の見直し) が特徴。
この単純な差別化戦略が非常に強力なそれの排他的プリミティブの生成または排他的決定的な造血前駆細胞、病患者由来の Ips から 2 つのプログラムの比較研究のモデルを有効にすることができまたは、遺伝子組み換え hPSCs。同様に、人間の発達過程は、自己複製能力と決定的な造血前駆細胞からのそれ故に HSC のような可能性を与える必要がありますどのような追加の信号 pathway(s) を発見など尋問されることができます。
要約すると、hPSCs の中胚葉のパターン形成中の WNT 操作指定プリミティブ CD43+または決定的な CD34+CD45+造血前駆細胞、分離と hPSC 由来造血を研究するために使用することができます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、血液部門内科学、ワシントン州大学医科大学院によってサポートされています。CD は、国民の中心、肺および血の協会からの T32HL007088 によって支えられました。CMS は、血液学者賞のアメリカの社会によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
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