Summary
כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.
Abstract
אחת ממטרותיה העיקריות עבור רפואה רגנרטיבית היא הדור ואת התחזוקה של תאי גזע hematopoietic (HSCs) נגזר מתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). עד לאחרונה, יש מאמצים כדי להתמיין hPSCs HSCs שנוצר בעיקר אבות hematopoietic כי חוסר HSC פוטנציאל, ומזכירים במקום שק החלמון hematopoiesis. אלה אבות hematopoietic המתקבלת תהיה מוגבלת השירות עבור במבחנה מידול המחלה של מבוגרים hematopoietic הפרעות שונות, בעיקר אלו של שושלות הלימפה. עם זאת, לאחרונה תארנו שיטות לייצר erythro-myelo-הלימפה multilineage אבות hematopoietic סופית hPSCs באמצעות פרוטוקול התמיינות מכוונת בשלב הספציפי, בו אנחנו כאן. דרך הדיסוציאציה אנזימטי של hPSCs על קרום המרתף מצופים מטריצה plasticware, embryoid הגופות (EBs) נוצרות. EBs מובדלים כדי והמזודרם באמצעות recombinant BMP4, אשר לאחר מכן שצוין לתוכנית hematopoietic סופית על ידי מעכב GSK3β, CHIR99021. לחלופין, hematopoiesis פרימיטיבית צוין על ידי מעכב PORCN, IWP2. Hematopoiesis הוא מונע נוסף באמצעות תוספת של רקומביננטי VEGF וציטוקינים hematopoietic תומכת. המוצא לאגס hematopoietic וכתוצאה מכך שנוצר בשיטה זו יש פוטנציאל לשמש המחלה ומודלים התפתחותית, חוץ גופית בתוך.
Introduction
תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) מוגדרים המקיף תאי גזע עובריים (hESCs) והן אנושית המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), יש את היכולת הייחודית של לא רק בתהליך התחדשות עצמית תחת תנאי הגידול המתאימים, אבל גם היכולת להתמיין לכל סוגי תאים שמקורם שלושת הרבדים נבט: האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם1. בשל יכולות ייחודיות אלה, hPSCs החזק הבטחה גדולה עבור רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה, טיפולים מבוססי תא2. בעוד סוגי תאים מרובים יש כבר בהצלחה תריז hPSCs, אתגר משמעותי אחד הוא המפרט במבחנה של אך ורק למבוגרים כמו נגזר hPSC hematopoietic תאי גזע (HSCs), אבות hematopoietic סופית.
אחד סביר מכשול להתפתחות של האדם HSCs מן hPSCs היא הנוכחות של תוכניות hematopoietic מרובות בתוך העובר3. בתוכנית הראשונה שעלתה, כינה "hematopoiesis פרימיטיבית," מקורו בתוך רקמת extraembryonic שק חלמון, מאופיין בצורה הטובה ביותר שלה ארעי ייצור אבות erythroblast (EryP-CFC), מקרופאגים, megakaryocytes. ראוי לציין, תוכנית זו אינה מעניקה עלייתו HSCs, וגם זה נותן עלייה אבות הלימפה T ו- B. עם זאת, שק החלמון transiently להצמיח אבות hematopoietic סופית מוגבלת, כגון erythro-מיאלואידית המייצר (EMP4,5,6,7,8) erythroid לקויה הלימפה בשלה multipotent המייצר (LMPP9). אולם, פעימה וגם LMPPs הם multipotent באופן מלא, או מסוגל כמו HSC engraftment ב נמענים למבוגרים. לעומת זאת, מאוחר יותר בהתפתחות, התוכנית בסגנון קלאסי מוגדר hematopoietic "סופית" צוין באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros של העובר תקין, והוליד כל שושלות hematopoietic למבוגרים, כולל את מועדון הכדורגל מונפלייה. המפרט של תאים אינטרה-עובריים אלה hematopoietic סופית מתרחשת באופן תלוי-חריץ, דרך המעבר אנדותל-אל-hematopoietic hemogenic אנדותל (הוא)3,10,11 ,12,13,14. מלבד יכולת שיחזור, multilineage פוטנציאליים חריץ-התלות של תאים אלה ניתן להשתמש כדי להבחין בין אלה אבות hematopoietic מוחלטת מן השדה האלקטרומגנטי של LMPP (נבדקה הפניות3,13 ).
הבנת את mechanism(s) המסדירים פרימיטיביים ומוחלטת מפרט hematopoietic מ- hPSCs סביר קריטי לייצור לשחזור של אבות hematopoietic סופית על פני מגוון רחב של קווי hPSC. עד לאחרונה, פרוטוקולים של בידול hPSC יכול להפריד אבות hematopoietic multipotent פרימיטיבית ומוחלטת לא היה קיים15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. גישות רבות שימוש בסרום שור עוברית (FBS) ו/או תרבות משותפת סטרומה תחילה בקווים כלליים את הפוטנציאל hematopoietic של בידול hPSC, עם תערובות של פרימיטיביים ומוחלטת hematopoietic פוטנציאליים15,16, 17,19,22,23,25. זה עוד רחוק, פרוטוקולים ללא סרום hematopoietic רבים תיארו את האות דרישות המפרט של והמזודרם של hPSCs זה בנמלים hematopoietic פוטנציאליים18,20,21, 24. עם זאת, כמו שיטות אלה עדיין הולידה תערובות הטרוגניות של שתי התוכניות, השימוש בהם במסגרת מנגנוני התפתחות ההבנה ויישומים קליניים עלולה להיות מוגבלת.
לאחרונה בנינו על מחקרים אלה, נתקל בקווים כלליים את דרישות ספציפיות שלב אות עבור ACTIVIN/NODAL והאיתות ונ ט במפרט hematopoietic פרימיטיבית ומוחלטת מ נגזר hPSC והמזודרם18,26 . האחרון היה ייחודי במיוחד, בזכות השימוש הספציפי הבמה ונ ט אות מניפולציה מאפשר עבור המפרט באופן בלעדי פרימיטיבי או באופן בלעדי סופית אבות hematopoietic26. במהלך והמזודרם מפרט, עיכוב של חגיגת הקנוני איתות עם החומר המדכא PORCN IWP2 תוצאות במפרט של CD43+ EryP-CFC ואת אבות מיאלואידית, עם פוטנציאל הלימפה לזיהוי. בניגוד חריף, גירוי של קנוניקל ונ ט איתות עם החומר המדכא GSK3β, CHIR99021, בשלב זהה של בידול, גרמו העדר מוחלט של CD43 לזיהוי+ EryP-CFC, בזמן בו זמנית שהוביל אל מפרט של CD34+CD43− הוא. אוכלוסייה זו דיבוק מיאלואידית, HBG-ביטוי erythroid, ואת הפוטנציאל T-הלימפה. ניתוחים לאחר מכן זיהה זה הוא כמו חסר ההבעה של27,CD7328 , CD18428, הפוטנציאל hematopoietic היה תלוי חריץ-28. ניתוחים נוספים, תא בודד המשובטים הוכיח כי אלה שושלות hematopoietic סופי יכול להיגזר תאים בודדים multipotent28. יחדיו, מחקרים אלה מציינים כי שלב ספציפי ונ ט איתות מניפולציה ניתן לציין טהור פרימיטיביים אבות hematopoietic, או multipotent תלויי-דרגה סופית hematopoietic אבות.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות אסטרטגיית הבידול שלנו המניבה אבות hematopoietic באופן בלעדי פרימיטיבי או סופי, באמצעות מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות במהלך המתבנת mesodermal, השושלת hematopoietic במורד הזרם שלהם מבחני. פרוטוקול זה הוא בעל ערך רב לחוקרים המעוניינים בייצור של אבות hematopoietic פרימיטיבי או מוחלטת של hPSCs עבור רפואה רגנרטיבית יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ריאגנטים
משתית OP9-DL4- קבל תא קווים; hESCs או hiPSCs 1, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) 29, 30 , 31.
- הכנה ריאגנט
- להכין פתרון w/v 0.1% של ג'לטין ב- PBS. לחטא מאת autoclaving ולאחסן ב 4 ° C לאחר aliquoting.
- להכין plasticware מצופים ג'לטין. המעיל. ובכן 6 מנות עם 1.5 מ של 0.1% ג'לטין פתרון. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. מיד לפני השימוש, תשאף פתרון ג'לטין הנותרים.
- להכין את המדיה MEF על-ידי הפיכת IMDM עם 15% v/v FBS ואנטיביוטיקה 1 x. להשלים עם 2 מ מגלוטמין ו מיקרומטר 400 monothioglycerol (mtg ב) לפני השימוש ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
- להכין את התקשורת התרבות hPSC כפתרון של DMEM/F12 עם 20% v/v נוקאאוט סרום החלפת (KOSR), חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1 (NEAA), אנטיביוטיקה x 1, 55 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ מגלוטמין ו 10 ננוגרם למ"ל bFGF. מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר ולאחסן בחושך ב-4 מעלות צלזיוס
- הכן הנסיוב ללא שטיפת המדיה כפתרון של DMEM/F12 עם 5% v/v KOSR, 4 מ מ HCl. מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר, aliquot, ולאחסן בחושך 4 ° C.
- להפוך של 1 מ"ג/מ"ל DNase אני הפתרון על ידי המסת DNase אני במשך 3-4 h אל תוך קר כקרח, סטרילי מים יונים על קרח. מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר ולאחסן aliquots ב-20 מעלות צלזיוס
- להכין את הפתרון להפסיק עם שטיפת המדיה: להוסיף 10% FBS ו 10 µg/mL DNase אני. הפתרון להפסיק להכין מיד לפני השימוש.
- להכין את המטריקס קרום המרתף (למשל, matrigel, המכונה מחצלת לכאן בזמן שנסעתי) תערובת פתרון.
הערה: כל השלבים בהכנת ושימוש התערובת MAT יש לבצעו על קרח או ב-4 ° ג הפשרה קפוא מחצלת קרח ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדלל את המחצלת 1:1 על-ידי הוספת 10 מ"ל IMDM קר כקרח, צ'יל קרח ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדלל תערובת MAT עם אוטם 20 נוספים IMDM קר כקרח, צ'יל קרח ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Aliquot לתוך צינורות טרום מקורר, חנות ב-20 ° C עד השימוש. כאשר מוכן לשימוש, להפשיר MAT תערובת בין לילה ב 4 º C.- מעיל המזרן תא תרבות צלחות.
הערה: כל השלבים של ציפוי לוחות MAT צריכה להתבצע על קרח. מראש מקררים 6-. ובכן, ובכן 24 צלחות ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה. כאשר מוכן ללוחות המעיל, למקם אותם על קרח. מעיל בכל טוב עם 4 x מדולל המזרן, הסרת ושימוש מחדש כל פתרון עודף. להשאיר על קרח למשך 30-60 דקות, תשאף מחצלת עודף. יבש את הצלחות מצופה MAT ב חממה 2 CO 37 ° C 5% למשך תקופה מינימלית של ה 3 לשימוש בתוך 72 h של ציפוי.
- מעיל המזרן תא תרבות צלחות.
- להכין את הפתרון של 10% שור אלבומין (BSA) על ידי המסת 10% w/v BSA במים קפואים, מזוקק, יונים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ח' מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר לתוך הבקבוק לחסימת אור חנות ב-4 מעלות צלזיוס
- להכין את הפתרון חומצה אסקורבית. לאט לאט להתמוסס פתרון 5 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורבית L במים קפואים, מזוקק, יונים על קרח במשך 3-4 ח' מערבולת מדי פעם עד התפרקה. מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר ולאחסן aliquots ב-20 מעלות צלזיוס
- הכן התקשורת ללא סרום בידול (סימול SFD) על ידי פתרון של 75:25 של IMDM:Ham ' s. F-12, לאחר מכן להוסיף 0.5% BSA, 1 x B27, ותוספי x N2 0.5. חנות 4 ° ג הוסף 1 x-גלוטמין, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 400 מיקרומטר mtg ב 150-µg/mL ההולוגרפי-transferrin מוקדמת מיד להשתמש.
- להכין סרום ללא תאי גזע תרבות מדיה (למשל, StemPro, המכונה SP34 לכאן בזמן שנסעתי) לכל היצרן ' s הוראות. חנות 4 ° ג הוסף 1 x-גלוטמין, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 400 מיקרומטר mtg ב 150-µg/mL ההולוגרפי-transferrin מוקדמת מיד להשתמש.
- להכין את הפתרון השני Collagenase 0.2% על ידי המסת Collagenase השנייה, ריכוז 0.2% w/v ב- 1:4 FBS:PBS הפתרון הסופי. להמיס באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות מסנן כדי לעקר את הפתרון עם מסנן 2 מיקרומטר ולאחסן aliquots ב-20 מעלות צלזיוס
- להכין מאגר פלורסצנטיות מופעל התא מיון (FACS) כפתרון של 5% FBS, IMDM מוקדמת מיד להשתמש.
- מדיה OP9 להכין כפתרון של α-מ, 20% FBS, 2 מ מגלוטמין, 1 x אנטיביוטיקה. מסנן לחטא עם מסנן 2 מיקרומטר ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
- לקבל methylcellulose מבוסס מדיה (למשל, MethoCult, המכונה MeC לכאן בזמן שנסעתי) כמויות pre-aliquoted 3 מ ל או כמו בקבוק 100 מ. אם משתמש 100 מל MeC, עם ההגעה, לחלק aliquots 2.5 מ ל צינורות חרוט 14 מ ל.
הערה: כל aliquots צריך להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס MeC בינוני aliquots צריך להיות הקרת מיד לפני כדי להשתמש.
- להכין פתרון w/v 0.1% של ג'לטין ב- PBS. לחטא מאת autoclaving ולאחסן ב 4 ° C לאחר aliquoting.
2. הבידול והמזודרם של hPSCs
- לגדול hPSC שורות תאים ב- MEFs כדי confluency 70-80%, בחממה 37 ° C עם 5% CO 2.
הערה: hPSCs צריך גבולות חדים, מובחן. - Plasticware מצופה שטיח להכין 24 שעות לפני passaging את hPSCs.
הערה: המספר הכולל של מנות 6-ובכן מצופה שטיח משתנה ממדינה hPSC. בדרך כלל, שלוש מנות 6-ובכן מספיקים לכל 6-ובכן צלחת של hPSCs confluent על MEFs. דלדול מזין- בצע ניסוי עם יחס שונה של בארות confluent hPSCs:MAT (1:4, 1:3, 1:2, וכו) לפני הבידול הראשונה כדי לקבוע כמה מנות 6-ובכן מצופה שטיח אמור לשמש עוקבות differentiations.
הערה: 24 שעות לאחר ציפוי על גבי המזרן, hPSCs צריך להיות 80-90% confluent, עם תא גושים של 10-20 תאים בגודל של.
- בצע ניסוי עם יחס שונה של בארות confluent hPSCs:MAT (1:4, 1:3, 1:2, וכו) לפני הבידול הראשונה כדי לקבוע כמה מנות 6-ובכן מצופה שטיח אמור לשמש עוקבות differentiations.
- האחות hPSC המדיה ולהוסיף 1 מ"ל 37 ° C 0.25% טריפסין-EDTA לכל. ובכן 1 מינימלית לשאוב ולהוסיף 1 מ"ל עצירה מדיה מכל קידוח. באמצעות המגרד של התא, לגרד את התאים רלוונטי. להוסיף 1 מ"ל שטיפת מאגר כל טוב.
- עם pipet סרולוגית 2 מ"ל, triturate 3 - 5 פעמים לפרק גושים גדולים של תאים ולהעביר את התאים ל צינור חרוטי 50 מ ל. Centrifuge את hPSCs-g x 330 עבור 5 דק
- Resuspend התאים הנפח הכולל של מדיה hPSC שווה ערך ל 2 מ"ל לכל טוב של plasticware מצופה שטיח כדי לשמש. להוסיף 2 מ"ל/טוב של hPSCs plasticware, דגירה בין לילה בחממה 37 ° C עם 5% CO 2.
- 24 שעות מאוחר יותר, תשאף התקשורת ולהחליף עם 37 ° C 0.05% טריפסין-EDTA עבור מינימלית 1 תשאף טריפסין-EDTA והוסף מדיה עצירה 1 מ ל. לגרד את התאים נמרצות עם המגרד התא. להוסיף 1 מ"ל שטיפת המדיה מכל קידוח. עם pipet סרולוגית 2 מ"ל, triturate את התאים 1 - 2 פעמים, להעביר צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה תאים ב- g x 220 עבור 5 דק
הערה: משך הזמן של טריפסין-EDTA טיפול-שואו-ld להיקבע על ידי החוקר עבור כל קו hPSC. הטיפול טריפסין צריך להיות מיושם עבור זמן רב ככל האפשר מבלי לגרום דיסוציאציה תא בודד. שלב זה אמור לנתק את כל hPSCs מן הלוחות מצופים מחצלת, אך לא לגרום לכך דיסוציאציה תא בודד. EBs תוצאות צריך להיות 6-10 תאים, בממוצע. - וארוקן את המדיה. באמצעות pipet סרולוגית של 5 מ"ל, resuspend בעדינות את התאים בתקשורת שטיפת 20 מ. צנטריפוגה ב 220 x g עבור 5 דק
- Resuspend בעדינות את EBs בתקשורת ביום 0 (טבלה 1). לוותר על 2 מ של בידול המדיה המכילה EBs לתוך כל טוב של צלחת תרבות 6-ובכן נמוך-חסיד התא באמצעות pipet סרולוגית 10 מ. והפיכתו 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (גז רב) חממה.
הערה: יום 0 התקשורת: התקשורת התכנה בתוספת 10 ננוגרם למ"ל BMP4 (טבלה 1). לשימוש בכל שתי צלחות של hPSCs, מנה אחת של תרבות 6-ובכן נמוך-חסיד תא. - 24 שעות מאוחר יותר, להוסיף 2 מ"ל מדיה יום 1 (טבלה 1). דגירה התאים לילה בחממה גז רב.
הערה: יום 1 מדיה: מדיה התכנה בתוספת 10 ננוגרם למ"ל BMP4 ו 10 ננוגרם למ"ל bFGF כדי מכל קידוח (טבלה 1).
בעדינות, - 18 h מאוחר יותר, לקצור את EBs עם 5 מ"ל pipet סרולוגית, ספין-g x 100 עבור 5 דק שטיפת ומשלבים את תרבות שלמה עם 10 מ"ל IMDM. ספין-g x 100 עבור 5 דק וביופסיה התקשורת.
הערה: פסולת יהיה קיים בתרבויות. שלב זה צנטריפוגה במהירות נמוכה (100 x g) יהיה להסיר את הלכלוך. - Resuspend בעדינות את EBs בתקשורת התכנה בתוספת מדיה יום 2 (טבלה 1), אז לוותר על 2 מ לכל טוב תא 6-ובכן נמוך-חסיד התרבות לוחות. דגירה ב חממה דלק רב 37 מעלות צלזיוס במשך ה 30
הערה: יום 2 מדיה: 10 ננוגרם למ"ל BMP4, ו bFGF 5 ננוגרם למ"ל, לבין אגוניסט ונ ט המתאים או אנטגוניסט (טבלה 1).- להוסיף 3 מיקרומטר CHIR99021 לציון סופי אבות hematopoietic. לחלופין, הוסף מיקרומטר 3 IWP2, A Activin 1 ng/mL כדי לציין פרימיטיביים אבות hematopoietic.
- המשך כדי בסעיף 3 עבור מפרט קדמון hematopoietic.
3. מפרט של CD34 + אבות Hematopoietic
- לאחר 30h, לבודד את EBs עם pipet סרולוגית 2 mL-3 ביום של בידול. להעביר צינור חרוטי 50 מ ל, צנטריפוגה ב 330 x g 5 דק בעדינות resuspend, לשטוף עם 10 מ"ל של IMDM. Centrifuge התאים שוב ב g x 330 עבור 5 דק
- Resuspend את EBs בתקשורת ביום השלישי (טבלה 2), לוותר על 2 מ"ל כל טוב של דוגל נמוך. ובכן 6 צלחות. דגירה בתאים חממה דלק רב 37 ° C עבור ה 72
הערה: יום 3 מדיה: SP34, בתוספת 15 ng/mL VEGF ו- 5 ננוגרם למ"ל bFGF (טבלה 2). הוסף מדיה נוספת לכל טוב אם ה-pH של המדיה שהושארו על יום 3 של בידול השתנתה באופן משמעותי (קרי, מדיה צהוב כתום). לחלופין, השתמש EBs פחות לאדם טוב ביום 0- - לאחר 72 h של דגירה, להוסיף 2 מיליליטר ביום 6 מדיה (טבלה 2) כל טוב. דגירה ב חממה דלק רב 37 ° C עבור ה 48 נוספים
הערה: המדיה יום 6: SP34 מדיה בתוספת 15 ננוגרם למ"ל VEGF 5 ננוגרם למ"ל bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL IL-6, 10 ננוגרם למ"ל IL-11, 50 ננוגרם למ"ל IGF-1 (טבלה 2). אם מדיה נוספת נוספה בשלב 3.1, ואז להוסיף את הסכום המעודכן של מדיה בשלב 3.2 כך הריכוזים ציטוקין הסופי נשארים זהים. - לבודד את EBs שטופלו CHIR99021 על יום 8 של בידול. המשך סעיף 4-
- IWP2-EBs שטופלו נקצרים יום 8 של בידול לתוך צינור חרוטי 50 מ ל. צנטריפוגה ב 330 x g עבור 5 דק resuspend בעדינות בתקשורת ביום 8 (טבלה 2). תקופת דגירה של 24 שעות ביממה בחממה 2 CO 37 ° C 5% במנות חסיד נמוכה. המשך סעיף 4-
הערה: המדיה יום 8: SP34 מדיה בתוספת 100 ננוגרם למ"ל SCF 2-IU EPO, 10 ננוגרם למ"ל IL-6, 5 ננוגרם למ"ל IL-11, 25 ננוגרם למ"ל IGF-1, 30 ננוגרם למ"ל TPO, 10 ננוגרם למ"ל Flt3-L, 30 ננוגרם למ"ל IL-3 (טבלה 2).
4. אנזימטי דיסוציאציה של EBs ובידוד קדמון Hematopoietic
רכבת תחתית- לנתק EBs עם pipet סרולוגית לתוך חרוט 50 מ ל. צנטריפוגה ב 330 x g עבור 5 דק לשאוב את תגובת שיקוע.
- להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין-EDTA EBs. מערבולת עבור 5 ס Incubate באמבט מים 37 ° C עבור מינימלית 8 הוסף 5 מ של להפסיק פתרון. צנטריפוגה ב 330 x g עבור 5 דק לשאוב את תגובת שיקוע.
- Resuspend את EBs ב 5 מ של Collagenase השני. מערבולת עבור 5 s דגירה באמבט מים 37 º C. לאחר 60 דקות, מערבולת עבור 5 s ולהוסיף 5 מיליליטר להפסיק פתרון. ספין-g x 330 עבור 5 דק לשאוב את תגובת שיקוע.
- ב 1 mL מאגר FACS, resuspend את התאים. עוברים את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. פעולה זו מסירה את כל גושים תא undissociated.
- לספור את התאים. Aliquot עונה 1 פרק 10 6 תאים לתוך צינור חרוטי 14 גרם. לסובב התאים ב- g x 330 עבור 5 דק Resuspend התאים-ריכוז של 5 x 10 6 תאים למ"ל במאגר FACS. Aliquot ובריכה 10% מכלל התאים כל תנאי זרימה cytometric צבע פקדים. דגירה התאים נוגדנים במשך 30 דקות על קרח, בחושך.
הערה: ראה הציע fluorophore שילובים טבלה של חומרים.- שטופלו IWP2 עבור תאים, השתמש נוגדנים anti-CD34 ו- anti-CD43.
- שטופלו CHIR99021 עבור תאים, השתמש נוגדנים anti-CD34, anti-CD43, אנטי-CD73 ו- anti-CD184.
- לשטוף את התאים פעמיים באמצעות מאגר FACS. ספין ב 330 x g מפני 5 דק Resuspend התאים-ריכוז הסופי של 5 x 10 6 תאים למ"ל.
- ניתוח או בידוד תאים על-ידי cytometry זרימה. עבור אבות hematopoietic פרימיטיבית, לנתח את הביטוי CD34 ו- CD43 ( איור 2 א). עבור אבות hematopoietic סופית, לבודד את הוא (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) על ידי FACS ( איור 2B). לאסוף את התאים צינורות המכיל מאגר FACS צוננת.
- כדי להעריך את הפוטנציאל hematopoietic מוחלטת של מבודד הוא, להמשיך או סעיף 5 עבור המעבר אנדותל-אל-hematopoietic, או בסעיף 7 עבור T-הלימפה וזמינותו. עבור מבחני CFC hematopoietic פרימיטיבית, המשך סעיף 6-
5. המעבר אנדותל-אל-hematopoietic
- ספין CD34 מבודד + CD43 − CD73 − CD184 − תאים ב- g x 330 עבור 5 דק Resuspend בתאים הוא מדיה ב- 200,000 תאים למ"ל ( בטבלה 2). להפיץ התאים aliquots 50 µL בצלחת תרבות תא 96-ובכן נמוך-חסיד. דגירה בין לילה בתאים 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 רב גז חממה.
הערה: הוא התקשורת: התקשורת SP34 בתוספת 5 ננוגרם למ"ל VEGF, 5 bFGF ng/mL, 100 ננוגרם למ"ל SCF, 2-IU EPO, 10 ננוגרם למ"ל IL-6, 5 ננוגרם למ"ל IL-11, 25 ננוגרם למ"ל IGF-1, 30 ננוגרם למ"ל TPO, 10 ננוגרם למ"ל FLT3-L, 30 ננוגרם למ"ל IL-3, 10 ננוגרם למ"ל BMP4 20 ng/mL ששש, 10 µg/mL אנגיוטנסין II, 100 מיקרומטר אשלגן Losartan ב 2 x 10 5 תאים/mL (טבלה 2). - להכין 24-ובכן מצופה שטיח הצלחות (ראה שלב 1.2.7.1), לפי הצורך.
- התאים לצבור לתוך גושים של תאים 6-10 בלילה. עבור כל 50 µL אמצעי אחסון של תאים reaggregated, בעדינות להעביר את התאים למרכז צלחת מצופה שטיח 24-ובכן למחרת בבוקר. הנח בעדינות את הצלחת ב- 37 מעלות צלזיוס חממה דלק רב עבור 4-6 שעות, עד התאים מחוברים.
- להוסיף 1 מ"ל של התקשורת הוא טרי כל טוב, אחרי התאים מחוברים. דגירה התאים 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 רב גז חממה עד התאים hematopoietic גלויים (בדרך כלל 5-7 ימים; איור דו-ממדי). דמיינו תחת 100 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור-
- הקציר המוצא לאגס hematopoietic סופית על-ידי הסרת בעדינות את המדיה הוא התאים. להעביר מדיה זו דרך מסננת תא 40 µm ולאסוף. תאים חסיד הבאר, להוסיף 0.5 mL 0.25% טריפסין-EDTA לתאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הוסף 0.5 mL להפסיק פתרון כדי מכל קידוח. עוברים דרך תאים באמצעות אותו 40 µm תא מסננת אספנו את כל חסיד ותאים שאינם מחסידי ביחד. ספין-g x 330 עבור 5 דק
- כדי להעריך את הפוטנציאל CFC של תרבות זו בתפזורת, המשך סעיף 6-
- לרחוץ את התאים פעמיים במאגר FACS. ספין-g x 330 עבור 5 דק
- Resuspend התאים במאגר FACS ב 5 x 10 6 תאים/מ ל.... כתם התאים עם נוגדנים anti-CD45 ו- anti-CD34 במשך 30 דקות על קרח בחושך (הצעה fluorophores הן את הטבלה של חומרים).
- לרחוץ את התאים פעמיים במאגר FACS. ספין-g x 330 עבור 5 דק
- לבודד את CD34 + CD45 + תאים על-ידי FACS ( איור 2E). למיין את התאים לתוך מאגר FACS צוננת.
- להעריך את CD34 סופית + CD45 + hematopoietic אבות ככל הדרוש (CFC assay סעיף 6, פוטנציאל הלימפה בסעיף 7 או אחר ביוזמת החוקר assay).
6. CFC Assay
- להפשיר aliquots של MeC עבור כל דגימה המשמש וזמינותו CFC.
- להוסיף את התאים להיות לבדיקה (שלבים 4.5, 4.7, 5.5 או 5.9) ב- MeC. מערבולת ביסודיות ולתת התרבויות MeC לעמוד למשך 5-10 דקות עד בועות אוויר להתפזר, לפי היצרן ' s הוראות. באמצעות 16 ½ למדוד. את מחט מזרק 3 מ"ל, הסר בזהירות 2 מיליליטר MeC.
הערה: ציפוי טיפוסי צפיפויות בטווח שבין 1,000-20,000 תאים/mL, תלוי בתדירות קדמון הצפויה. - בקפידה, לוותר על 1 מ"ל MeC תא תערובת של שתי מנות תרביות רקמה של 35 מ מ כל אחת. פזר באופן שווה את MeC במנות 35 מ מ על-ידי הקשה וסיבוב בעדינות את המנה. מקם כל אחת מהמנות לעיל לתוך תבשיל תרביות רקמה 15 ס מ מלא במים. דגירה ב חממה 2 CO 37 ° C 5%-
- להמחיש את התרבויות MeC בסיוע מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה X 40. לכמת קובצי Cfc שונים שהושג. לנתח את מבחני CFC פרימיטיביים 8-10 ימים לאחר ציפוי ( איור 2C). לנתח את מבחני CFC סופית 14 ימים לאחר ציפוי. נציג CFC assay המושבה מורפולוגיות ניתן לראות באיור 2F.
7. תא T Assay כדי לקבוע סופית Hematopoietic פוטנציאליים
- תאים לגדול OP9-DL4 עד confluent ב תרביות רקמה צלחת של 100 מ מ 30 , 31 , 32.
- להפשיר OP9-DL4 תאים 72-96 שעות לפני ציפוי של מבחני T cell. Resuspend תאי OP9-DL4 ב- 10 מ"ל OP9 מדיה, לוותר על פלטה 10 ס מ. הגדלים בתוך חממה 2 CO 37 ° C 5% עד 70-90% confluent.
- לקצור את התאים OP9-DL4 מתוך קערה 100 מ מ, להסיר את המדיה ולהוסיף 5 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דק. להפסיק את הפעילות טריפסין 5 מ ל OP9 מדיה. לסובב התאים ב- g x 330 עבור 5 דק Resuspend תאי 1 מ"ל OP9 מדיה ולספור את התאים.
הערה: לוח 10 ס מ אחד של תאים OP9-DL4 confluent תניב כ 10 x 10 6 תאים OP9-DL4. - 48 שעות לפני וזמינותו תא T, צלחת 2 x 10 6 תאים 12 mL OP9 מדיה בקערה 24-טוב (0.5 mL/טוב). הגדלים בתוך חממה 2 CO 37 ° C 5%-
- 2,000-10,000 תאי כדי להיות לבדיקה (כפי שהתקבלו בשלבים 4.5, 4.7, 5.5 או 5.9) להוסיף 1 טוב של תאים OP9-DL4 בתקשורת OP9 בתוספת: 30 ננוגרם למ"ל SCF (הראשון 6 ימים בלבד), 5 ננוגרם למ"ל IL-7 ו- 5 ננוגרם למ"ל FLT3-ל' דגירה 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. אין שינויים מדיה להתרחש בשלב זה.
- כל 4 - 5 ימים, המעבר המוצא לאגס תא T אל OP9-DL4 טריים סטרומה תאים בצלחת 6-. טוב. Triturate התאים עם pipet 1 מ"ל, עוברים דרך מסנן מיקרומטר 40 כדי להסיר גושים. ספין-g x 330 עבור 5 דק לשאוב את התקשורת. Resuspend התאים 2 מ"ל של מדיה OP9 טרי בתוספת 5 ננוגרם למ"ל IL-7 ו- 5 ננוגרם למ"ל Flt3-L והמקום על תאים OP9-DL4 טריים.
הערה: 48 שעות לפני passaging, לוחית רישוי 2 x 10 6 תאים OP9-DL4 טריים ב 12 mL OP9 מדיה והפצה 2 מ"ל/טוב טוב 6 מנות- - לאחר לפחות 21 ימים של תרבות משותפת, triturate את התאים נמרצות, עוברים דרך מסנן 40 µm כדי להסיר שאריות תאים. ספין ב g x 330 במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
- לרחוץ את התאים פעמיים תוך קר מאגר FACS. ספין-g x 330 עבור 5 דק
- Resuspend התאים במאגר FACS ב 5 x 10 6 תאים/מ ל.... כתם תאים עם נוגדנים anti-CD45, אנטי-CD56, אנטי-CD4 ו anti-CD8 במשך 30 דקות על קרח בחושך (המוצע fluorophore צירופי טבלה של חומרים). החלת כתם תא חי/מת (דאפי, וכו ') כדי להסיר את הלכלוך מניתוח.
- לרחוץ את התאים פעמיים במאגר FACS. ספין-g x 330 עבור 5 דק
- לנתח את התאים באמצעות cytometer של זרימה כדי להעריך את הנוכחות של לימפוציטים-T אבות ( איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שרטוט המתאר את אינדוקציה של פרימיטיביים ומוחלטת אבות hematopoietic מן hPSCs מודגם באיור1. והמזודרם תכנים על ידי קנוניקל ונ ט איתות מתרחשת בימים 2-3 של בידול, ואחריו קדמון hematopoietic מפרט.
ניתוח cytometric תזרים נציג והמושבה ויוצרים מבחני methylcellulose של תרבויות, נגזר hPSC בידול hematopoietic מוצגים באיור2. בידול שטופלו IWP2 תרבויות תניב CD34 ברורים של+CD43− ו CD34נמוך /−CD43+ האוכלוסייה, ואילו תרבויות בידול שטופלו ח'יר יהיו < 1% CD43+ תאים ב- 8 יום של בידול (איור 2 אב')26. פרימיטיבי אבות hematopoietic נגזר בתנאים IWP2 מבודדת על יום 9 יהיה להצמיח בעיקר פרימיטיביים erythroid (EryP-CFC), אבות מיאלואידית ב מבחני methylcellulose, בעוד תרבויות שטופלו ח'יר יהיה במידה רבה ללא CFC פוטנציאל בשלב זה (איור 2CF). במקום זאת, CD34+CD43– האוכלוסייה נגזר הטיפול CHIR99021 היא אוכלוסיה הטרוגנית, המכיל אבות אנדותל, וכן CD34+CD43–CD73–CD184– (הוא איור 2B), אשר מבודדים על ידי FACS, בתחילה ייצרו טפט של תאי אנדותל דמוי (איור דו-ממדי, פאנל שמאלי), כי אז עובר מעבר אנדותל-אל-hematopoietic, וכתוצאה מכך סיבוב, refractile הלא-חסיד תאים hematopoietic (איור דו-ממדי, לוח נכון). אלו תאים hematopoietic יכול להיות מוערך על ידי cytometry זרימה עבור הביטוי של CD34 ו- CD45 (2E איור). אבות hematopoietic מבודד את מבחני בובה יכולה לשמש מבחני methylcellulose ו להצמיח גדולים כמו פרץ erythroid המושבה יוצרי יחידות (BFU-E), erythroid קטן המושבה יוצרי יחידות (CFU-E) ו מיאלואידית אבות (CFU-מ'; 2F איור).
איור 3 מתאר זרימה נציג ניתוחים cytometric של מבחני T-לימפוציטים פוטנציאל מ CD34 נגזר CHIR99021+CD43−−CD73 hematopoietic− CD184 אבות (איור 3 א) IWP2, נגזר CD34 (איור 3B)+CD43 אבות hematopoietic− , לאחר 21 ימים של תרבות משותפת OP9-DL4. הנוכחות של CD45+CD56−CD4+CD8+ באוכלוסיית ח'יר-derived אבות הוא מעיד על פוטנציאל hematopoietic מוחלטת בתוך CD34 קלט+ האוכלוסיה. CD34+ , CD43+ אבות מבודד נגזר IWP2 differentiations לא להצמיח לימפוציטים ב assay הזה, תחת18,תנאים אלה בידול26.
איור 1: תרשים סכמטי של פרוטוקול עבור המפרט של סופי ופרימיטיבי אבות hematopoietic. תיאור של שלבים עיקריים ניסיוני, צירי זמן של הבידול של EBs אבות hematopoietic סופית ופרימיטיבי. EBs נוצרים ביום 0 מ- hPSCs על plasticware מצופה שטיח. EBs גדלים התכנה המדיה המכילה BMP4 ב חממה דלק רב. 1 יום של בידול, תרבויות ניזונים ממדיה בתוספת BMP4 ו- bFGF. ביום 2, מתרחש שינוי מדיה עם חגיגת מניפולציה באמצעות התוספת של CHIR99021 (ח'יר) עבור סופי אבות hematopoietic ו- IWP2 עבור אבות hematopoietic פרימיטיבית. יום 3, המדיה משתנה SP34, בתוספת VEGF ו- bFGF. יום 6, תרבויות ניזונים ממדיה בתוספת ציטוקינים hematopoietic. יום 8 של מפרט hematopoietic פרימיטיבית, התקשורת השתנתה, תאים מועברים אל חממה2 CO 5% במשך 24 שעות, ואחריו וזמינותו קדמון hematopoietic תא (HPC). יום 8 של מפרט hematopoietic סופית, CD34+CD43–CD73–CD184– תאים מבודדים על ידי FACS, לבדיקה פוטנציאל אנדותל hemogenic מוחלטת, או פוטנציאל T-הלימפה (לא מתואר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של תרבויות בידול ויצירת של פרימיטיביים אבות hematopoietic. (א) זרימה נציג ניתוחים cytometric של אבות hematopoietic פרימיטיבית של EBs שטופלו IWP2 על יום 8. (B) מייצג זרימה cytometric מנתח EBs שטופלו CHIR99021 על יום 8. אנדותל Hemogenic (הוא) ניתן לזהות, מבודדים כמו CD34+CD43–CD73–CD184– האוכלוסיה. (ג) המושבה יוצרי הפוטנציאל של אבות hematopoietic יום 9 מ IWP2 - ו CHIR99021 - (ח'יר) התייחסו בידול תרבויות. n = 3, קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע, הכוכביות מציינות מובהקות סטטיסטית, באמצעות מבחן t של סטודנט * * * p < 0.0001. תמונות (D) נציג של מבודד הוא תאים לאחר 4 ימים (משמאל) או 7 + ימים (מימין) גידול על plasticware מצופה שטיח. ההגדלה המקורי, 100 X. גודל ברים = 100 מיקרומטר. (E) נציג cytometry זרימה של ביטוי CD34 ו CD45 מ אבות hematopoietic סופית לאחר 9 ימים של תרבות. (F) תצלום נציג מציג המורפולוגיה של EryP-CFC (משמאל), CFU-M (באמצע), BFU-E ו- CFU-E (מימין). ההגדלה המקורי, 40 X. גודל ברים = 100 מיקרומטר. חיצים מציינים בשם מושבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח של סופי פוטנציאל hematopoietic. זרימה נציג ניתוחים cytometric של לימפוציטים-T הפוטנציאל של CD34 ח'יר, נגזר+CD43−−CD73 hematopoietic− CD184 אבות (א) או CD34 (B) נגזר IWP2+CD43 אבות hematopoietic − , 28 ימים לאחר תרבות משותפת עם תאים OP9-DL4. הפוטנציאל T-לימפוציטים מתוך מדגם נחשב חיובי אם קיימים יותר מ 100 CD45+ אירועים שזוהו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: מדיה מבוססי התכנה לימים 0 - 2-
| SP34 מדיה | יום 3 | יום 6 | יום 8 | הוא |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| SCF | – | 200 ng/mL | 100 ננוגרם למ"ל | 100 ננוגרם למ"ל |
| EPO | – | 4 IU | 2-IU | 2-IU |
| IL-6 | – | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-11 | – | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | – | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| טיסה - 3L | – | – | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-3 | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | – | – | – | 10 ng/mL |
| . ששש | – | – | – | 20 ng/mL |
| אנגיוטנסין II | – | – | – | µg 10/mL |
| אשלגן Losartan | – | – | – | 100 מיקרומטר |
בטבלה 2: מבוסס על SP34 מדיה עבור 3 ימים - 8, והוא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה, ללא סרום, נטולת משתית הבידול של אבות hematopoietic פרימיטיבי או סופית. מפרט mesodermal של אבות hematopoietic פרימיטיבי או סופית תושג באופן אמין באמצעות פרוטוקול שלנו, המנצלת באופן ייחודי מעכבי מולקולה קטנה של איתות ונ ט הקנוני. ההפעלה ונ ט בשלב הספציפי על ידי החומר המדכא GSK3β CHIR9902133 נותן עלייה והמזודרם hematopoietic מוחלטת, ואילו חגיגת עיכוב על ידי החומר המדכא PORCN IWP234 מציין פרימיטיביים והמזודרם hematopoietic26. ראוי לציין, שיטה זו לא robustly להצמיח אוכלוסיה כמו HSC engraftable (לא מוצג). עם זאת, המוצא לאגס hematopoietic סופית שנוצר עם גישה זו נתונות engraftment transgene-induced פוטנציאליים35, הדגשת יישומים translational עתידיים אפשריים שלהם.
דטרמיננטה מכרעת כדי בידול hPSC מוצלח הוא הגודל ההתחלתי של EBs שנוצרו מן hPSCs. באופן אידיאלי, EBs צריך להיות סביב 6-10 תאים בגודל. התרבויות בידול aberrantly ניתן לציין תערובת של שתי התוכניות אם EBs גדולים מדי, כנראה עקב הפעלת אות פסולים בתוך EB. בידול התרבויות יש ויזואלית לחפש לגודל האופטימלי EB בתוך 24 השעות הראשונות של בידול. לחלופין, אם hPSCs הם חלופה מועדפת לחלוטין כדי תאים בודדים, hPSCs עוברים במקום anoikis תא מוות36, וכתוצאה מכך בידול hematopoietic המסכן.
הבחנה מוצלח יהיה להצמיח באופן בלעדי פרימיטיביים אבות hematopoietic כאשר IWP2 משמש במהלך mesodermal מפרט על 2 ימים ו- 3 של הפרוטוקול בידול. יום 8 של בידול, התרבות IWP2, נגזר צריך כמורכבת CD34 ברורים+CD43−, CD34בינוני/נמוךCD43+, ו- CD34−CD43+ אוכלוסיות (איור 2 א). CD34בינוני/נמוךCD43+ האוכלוסייה מעורר erythroid פרימיטיבית, אבות מיאלואידית; בעוד את CD34−CD43+ האוכלוסייה בעיקר מעורר erythroid אבות עם פוטנציאל מיאלואידית מוגבל18. הפוטנציאל hematopoietic פרימיטיביים יכולים להיות מאושרות על ידי וזמינותו methylcellulose לנוכחות של EryP-CFC (סעיף 6), אשר predominately רצון לבטא גלובין עובריים HBE בהשוואה HBGבעובר26, 28,37. באופן דומה, הנוכחות של CD43+ hematopoietic אבות בשלב זה יכול לשמש באופן אמין כדי להצביע על קיומו של פרימיטיביים אבות hematopoietic18,23,26. יצוין כי הביטוי CD43 אינה בלעדית אבות של23,18,26תוכנית hematopoietic פרימיטיביים, לא יכול לשמש מדד הבלעדית להעריך פרימיטיבי hematopoietic פוטנציאל, immunophenotype וחריץ-התלות של האדם EMP נשאר uncharacterized (נבדקה ב3).
כאשר CHIR99021 משמש במהלך המתבנת mesodermal בימים 2 ו 3 של בידול, יפורטו אוכלוסיה של אבות hematopoietic סופית באופן בלעדי. יום 8 של פרוטוקול בידול, תרבויות, נגזר CHIR99021 צריך כמורכבת CD34 הייחודי+CD43− אוכלוסייה, עם מעט אין ביטוי CD4326. CD34+CD43− האוכלוסייה היא אוכלוסיה הטרוגנית של תאי אנדותל עם hematopoietic, ורידים, עורקים פוטנציאל זה יכול להיות התחום מבוסס על הביטוי CD73 ו- CD184, עם תאים הוא חסר הביטוי של שני 27,28. כאשר המעבר מהווים הסופית הוא מבודד לאחר שעברו על חריץ-תלוי אנדותל-אל-hematopoietic (סעיף 5)28 זה תניב CD34+CD45+ hematopoietic אבות כי יהיה להצמיח BFU-E ואת התאים מיאלואידית methylcellulose, אך לא EryP-CFC26,28 (איור 2). בנוסף, מושבות BFU-E יכול? כן, העריך לניתוח גלובין, אשר predominately רצון לבטא גלובין עוברית HBG בהשוואה עובריים HBE (לא מוצג)26,28, 37. לעומת זאת, פוטנציאל הלימפה וצריך להעריך ישירות מן מבודד הוא, כמו המעבר אנדותל-אל-hematopoietic תלויי-דרגה מתרחשת ב26,2818,משתית OP9-DL4. מהווים את הסופית, הוא ציין בשיטה זו מכילה אבות erythro-myelo-הלימפה בבית המשובטים ברמה28, אשר פונקציונלית מבדיל בינה לבין ההבנה הנוכחית שלנו של אבות EMP או LMPP3. מעין, הנוכחות של T-הלימפה ואת HBG-לבטא erythroid פוטנציאליים, בשילוב עם היעדרות של פוטנציאל EryP-CFC, יכול לשמש כדי לציין בצורה אמינה את מפרט hematopoietic מוחלטת של hPSCs. ראוי לציין, הערכת אך ורק עבור אבות כי יכולים להצמיח HBG-לבטא erythroblasts עשוי לא לקבוע במדויק את הפוטנציאל סופית, כמו, הדומה שתוארו לעיל, השדה האלקטרומגנטי האנושי, וכך גם לדרישות האות שלו, כבר לא מאופיין עד היום (נבדקה הפניה3).
אסטרטגיה זו בידול פשוט חזק מאוד שכן היא מאפשרת עבור הדור של פרימיטיביים באופן בלעדי או באופן בלעדי סופית hematopoietic אבות, הפעלת המחלה מידול השוואתית של שתי התכניות של החולה, נגזר iPSCs או hPSCs שעבר שינוי גנטי. באופן דומה, תהליכים פיתוחיים האנושית יכולה להיחקר, כגון גילוי מה pathway(s) אות נוספים נדרשים להתייעץ יכולת התחדשות עצמית, פוטנציאל ומכאן דמוי-מועדון הכדורגל מונפלייה, מן המוצא לאגס hematopoietic סופית.
לסיכום, מציין ונ ט מניפולציה במהלך mesodermal המתבנת ב hPSCs CD43 פרימיטיבית+ או CD34 סופית+CD45+ אבות hematopoietic, אשר ניתן לבודד המשמשות ללימוד hPSC, נגזר hematopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו בתמיכתם של המחלקה לרפואה פנימית, המחלקה להמטולוגיה, באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה. תקליטור נתמכה על ידי T32HL007088 מן הלאומי ללב, ריאות, מכון דם. CMS נתמכה על ידי האגודה האמריקאית של המטולוגיה מלומד בפרס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
