Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

Lin Jiajia; Mak Shinghung; Zheng Jiacheng; Wang Jialing; Xu Dilin; Hu Shengquan; Zhang Zaijun; Wang Qinwen; Han Yifan; Cui Wei

doi:10.3791/55442

Artículo de método

Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

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DOI:

10.3791/55442

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10 de mayo de 2017

Lin Jiajia^*¹ , Mak Shinghung^*² , Zheng Jiacheng¹ , Wang Jialing¹ , Xu Dilin¹ , Hu Shengquan² , Zhang Zaijun³ , Wang Qinwen¹ , Han Yifan²^,⁴ , Cui Wei¹^,²

¹Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, ²Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, ³Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, ⁴International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo medir con precisión la viabilidad neuronal utilizando fluoresceína diacetato (FDA) y Propidium Iodide (PI) doble tinción en neuronas cultivadas de gránulos cerebelosos, un cultivo neuronal primario utilizado como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología investigación.

Resumen

Las neuronas de gránulos cerebelosos cultivadas primarias (CGN) han sido ampliamente utilizadas como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología. Sin embargo, la coexistencia de células gliales y neuronas en el cultivo CGN podría conducir a sesgos en la evaluación precisa de la viabilidad neuronal. El diacetato de fluoresceína (FDA) y la tinción doble de yoduro de propidio (PI) se han utilizado para medir la viabilidad celular mediante la evaluación simultánea de las células viables y muertas. Se utilizó FDA-PI doble tinción para mejorar la sensibilidad de los ensayos colorimétricos y para evaluar la viabilidad neuronal en CGNs. Además, se añadieron manchas azules fluorescentes de ADN ( por ejemplo, Hoechst) para mejorar la precisión. Este protocolo describe cómo mejorar la precisión de la evaluación de la viabilidad neuronal mediante el uso de estos métodos en CGN cultivo. Usando este protocolo, el número de células gliales puede ser excluido usando microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede aplicar para distinguir el gli no deseadoAl de células de neuronas en diversos cultivos celulares mixtos, tales como cultivo cortical primario y cultivo del hipocampo.

Introducción

Los ensayos de citotoxicidad colorimétrica, tales como el ensayo de bromuro de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT), se usan comúnmente para medir la viabilidad celular in vitro . Las neuronas de gránulos cerebelosos (CGN) de ratas primarias cultivadas son sensibles a diversas neurotoxinas, incluyendo el ion 1-metil-4-fenilpiridinio, el peróxido de hidrógeno y el glutamato ¹ ^, ² . Por lo tanto, los cultivos CGN pueden ser utilizados como un modelo in vitro en el campo de la neurociencia. Los cultivos CGN pueden contener una variedad de células, incluyendo neuronas ....