Summary
В этом методе мы используем фотополимеризации и нажмите химических методов для создания белка или пептида узоры на поверхности полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, обеспечивая иммобилизованных биологически активных сигналов для изучения клеточных реакций в пробирке .
Abstract
Существует множество биологических раздражители, которые могут влиять на поведение и клеточной дифференцировки клеток. Общие клетки культуры подходы полагаются на растворимых факторов в рамках среднесрочной поведение ячейки элемента управления. Однако растворимые дополнения нельзя имитировать определенные сигнализации мотивы, как факторы роста матрица привязкой, ячейке сигнализации и пространственной биохимических подсказки, которые являются общее влияние на клетки. Кроме того биофизические свойства матрицы, таких как субстрат жесткость, играют важную роль в судьбе ячейки, которая не является легко манипулировать, используя обычные ячейки, культивирование практики. В этом методе мы опишем простой протокол предоставлять узорной биоактивные белков на синтетических полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, используя фотохимии. Эта платформа позволяет для независимого управления субстрата жесткости и биохимические пространственными аллюзиями. Эти гидрогели может достичь большого диапазона значений физиологически соответствующей жесткости. Кроме того поверхности этих гидрогели может быть photopatterned с биоактивные пептиды, или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Эти методы были оптимизированы для сохранения функции белка после поверхности иммобилизации. Это универсальный протокол, который может быть применен к любому белка или пептида, представляющие интерес для создания различных моделей. Наконец клетки посеян на поверхности этих биологически активных гидрогели может контролироваться со временем, как они реагируют на пространственно определенных сигналов.
Introduction
Есть много стимулов, которые влияют на поведение клеток. Как правило типичных клеток культивирования методы полагаются на растворимых факторов для получения клеточных реакций; Однако существуют ограничения на этот подход. Эти методы не могут точно отображать все сигнализации мотивы встречаются в vivo. Такие сигнальных механизмов относятся поглощенных факторы роста, ячейке сигнализации и пространственно специфические биохимические подсказки. Кроме того подложка жесткости могут играть важную роль в поведение и клеточной дифференцировки клеток и не является легко манипулировать, используя общую ячейку культивирования практики1,2. Биоматериал подходы предлагают новую платформу для начала изучения этих сигнальных механизмов. В частности гидрогели являются отличным кандидатами для настройки субстрата жесткость3,4, иммобилизации белков и пептидов5,6и создание пространственно определенных шаблонов7, 8.
Гидрогели обычно используются как строительные леса в тканевой инженерии, благодаря их биофизических и биохимических сходства с внеклеточного матрикса (ECM)9,10. Полимеры природные являются общий выбор для леса, как они биосовместимых и находятся во многих тканях организма. Ограничение использования природных полимеров в качестве субстратов является, что они не легко манипулировать химических постановление для bioconjugation. С другой стороны синтетические гидрогели, как таковой как КОЛЫШЕК, являются отличным платформ для целевых химия11,12. Кроме того гидрогели PEG не вызывают клеточного ответа и поэтому используются в качестве инертного магистралей для создания биоактивные подмостей.
Для создания биоактивные гидрогели, фотополимеризации и тиоловых Эне нажмите химии, которые заняты реакции. Эти photoreactions требуют фотоинициатора и источник ультрафиолетового света. Когда фотоинициаторы вводятся к ультрафиолету, облигации перерыв в форме радикалов. Диссертации радикалов необходимы для инициирования реакции, но может отрицательно повлиять на белками биологическую12,13. Таким образом крайне важно оптимизировать фотоинициатора и УФ облучения раз сохранить биологическую белка.
В этом методе гидрогели синтезируются путем фотополимеризации роста цепи акрилат акрилат. ПЭГ diacrylate (PEGDA) мономеров реагируют друг с другом в форме разветвленных полимеров сети отвечает за структуры гидрогеля. Концентрация PEGDA мономеров в рамках решения гелем прекурсоров будет контролировать жесткость субстрата. Из-за небольшой размер гидрогеля пор, ECM белки, например фибронектин могут быть легко включены в пределах гидрогеля с целью вложения ячейки. Наконец эти гидрогели может быть с биоактивные пептиды узором поверхности или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Здесь непрореагировавшего бесплатно акрилатов в системе гидрогеля будет реагировать с бесплатным тиолов, расположенный на белка или пептида при воздействии УФ света. После того, как белки и пептиды лишенных подвижности на поверхности гидрогеля, гидрогеля может храниться при температуре 4 ° C в течение нескольких недель без потери биологическую. Это обеспечивает удобство, гибкого планирования экспериментальных и возможности для сотрудничества между лабораториями. В целом эта платформа позволяет биомеханических и пространственной биохимических управления, независимые друг от друга, за возможность влиять на поведение сотовых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материалов для синтеза Гидрогель
- подготовка запасов решения PEGDA, литий фенил-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (круг) и фибронектин в стерильных условиях и на основе расчеты (таблица 1А).
- Весят и распустить соединений в фосфат амортизированное saline (PBS). Как правило поддерживают PEGDA рабочей концентрации раствора между 50 и 200 мг/мл (5-20% вес/объем). Пипетка раствор PEGDA через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
Примечание: Держите PEGDA решения, покрытые пленкой, Упаковка для защиты их от света. Готовить свежий раствор PEGDA (рекомендуется) для каждого эксперимента. - Воссоздать фибронектин белка порошок на основе производителя ' s рекомендации. Поддерживать фибронектин Стоковый раствор на 1 мг/мл, аликвота его в 60-100 мкл аликвоты и хранить их при-20 ° C до использования. Размораживание аликвоты на 4 ° C на несколько часов или на ночь перед использованием. Если белок запасов уже не предоставляется в стерильных условиях, используйте фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
Примечание: Фибронектин используется для вложения клеток. Может быть заменен другими ECM белки. - Весят, круг для Стоковый раствор и растворить его в PBS; Типичная концентрация запасов 25 мг/мл. Sonicate, если есть какие-либо проблемы с растворения. Решение пройти 0,22 мкм фильтром для стерилизации. Охватывают круг с обертыванием фольги и держать его на 4 ° C до нескольких месяцев.
Примечание: Круг-фотоинициатора, используемые для фотохимии.
- Весят и распустить соединений в фосфат амортизированное saline (PBS). Как правило поддерживают PEGDA рабочей концентрации раствора между 50 и 200 мг/мл (5-20% вес/объем). Пипетка раствор PEGDA через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
- Подготовить стерильных стеклянных слайд формы для формирования гидрогеля.
Лист
- автоклав полиэстера; один необходима для каждой формы гель. Замочите два стеклянных скольжениях и три элементы дистанционные пластиковые (толщиной 0,5 мм) для каждой формы гель в 70% этанола для по крайней мере 2 h, но обычно позволяют им замочить на ночь. Замочите в этанол 70% за 10 мин до использования пяти зажимы для каждой формы гель.
- Место стекла слайды, распорки и зажимы на небольшой лист газобетона в капотом культуры клеток, чтобы дать им высохнуть на несколько часов.
- Подготовка гидрогеля плесени, поставив пластиковые прокладки вокруг края на стеклянное скольжение. Место на второй слайд стекла на вершине. Обеспечения опоры плотно рядом друг с другом с зажимы, два на каждой длинной стороне и один на вершине.
Примечание: Если это не собран правильно, решения гелем будет просачиваться. - Поверхность стерилизуйте плесень с клеточной культуры капот УФ света за 30 мин до использования. На полпути через, флип плесень подвергать обеих поверхностей.
2. Модификация белков с бесплатным тиоловых
- подготовить фондовых решений с помощью вычисления из электронной таблицы для преобразования аминов в тиоловых на белки (таблица 1А).
- Сделать буфер реакции, отрегулируйте PBS до pH 8 и добавление 5 мм ЭДТА. Буфер реакции пипеткой, в 0,22 мкм фильтром шприц для стерилизации.
Примечание: ЭДТА имеет важное значение, как он защищает тиолы от формирования дисульфидными облигаций. Тиоловых групп должны оставаться в их сокращенной форме для реакции происходят. - Весят, 2-iminothiolane (Траут ' s реагент) и растворить его в буфер реакции для Стоковый раствор концентрация 2 мг/мл (14 мм). Решение пройти через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации. Хранят раствор при температуре 4 ° C для до нескольких месяцев.
Примечание: 2-iminothiolane-это молекула, которая реагирует с растворителем облученных бесплатные аминов на белки и преобразует их в свободный тиолы. - Восстановить белка в буфере реакции в концентрации между 0,1 и 1 мг/мл. Если ранее стерильные, Пипетка это решение через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
Примечание: Этот белок является биохимическая сигнал, который будет рисунком на поверхность гидрогеля. Кроме того, хотя концентрации белка может варьироваться, более высокие концентрации идеальны для сильнее белка шаблонов.
- Сделать буфер реакции, отрегулируйте PBS до pH 8 и добавление 5 мм ЭДТА. Буфер реакции пипеткой, в 0,22 мкм фильтром шприц для стерилизации.
- Реагируют белка с 2-iminothiolane, смешивая оба акций решения вместе; используйте Таблица 1B для расчета коэффициента правильный объем. Как правило, используют молярное соотношение 8:1-2-iminothiolane белком.
Примечание: Для крупных белков или более разбавлять концентрации, использовать выше молярное соотношение 2-iminothiolane. Обратитесь к производителю ' s протокол 15. - Инкубировать реакции на 1 ч при комнатной температуре. Опреснительной спин микро столбец использовать для удаления thiolated белковый продукт из оставшихся реактивы, после производитель ' s протокол 16.
Примечание: Исключение этой смолы ограничено 5 кДа. - Использование Эллман ' s Assay количественно измерить количество свободного тиолы за белка. Следуйте производитель ' s протокол assay 17.
3. Гидрогель образования
- создать решения гелем прекурсоров на основе значений вычисляется из таблицы 1 c. Смешайте PEGDA, фибронектин и коленях томов. Пипетка решение энергично обеспечить однородный раствор, но не создавать пузыри. Держите решение, защищенном от света.
- Пипетка решение прекурсоров гель тщательно между двух стеклянных скольжениях гель плесени. Как правило добавьте тома между 800 и 1000 мкл на плесень. Разоблачить гель решение в форме УФ света (длина волны: 365 Нм, мощность: 3-4 МВт/см 2) для 1-2 мин сформировать гидрогеля.
Примечание: Не подвергайте Гидрогель для длительного УФ-излучения, как он будет ограничивать поверхности белка, кучность возможности. - Снимать зажимы и аккуратно удалить слайд верхнего стекла, применяя напротив давления для двух боковых распорок.
- Использование подходящего размера биопсии удара вырезать образцы гидрогеля. Выбивать несколько гидрогели из прямоугольника гель служить реплицирует и контролировать образцы.
4. Гидрогель жесткость измерения
- удар, гидрогели с 8 мм в диаметре биопсии пуансон для параллельных пластины Реометр 8 мм. Загрузить один образец Гидрогель в Реометр (см. Таблицу материалы).
- Нижней параллельной пластине геометрии это 8 мм в диаметре до изготовления контакт с поверхностью геля. Сохранить зазор расстояние 0,5 мм для образца 0,5 мм толстой гидрогеля.
- Выполнение время зачисток за 5 мин при 0,1% деформации, частотой 0,1 Гц и 37 ° C. среднем G ' значения через каждый раз развертки. Запуск независимых гидрогели для реплицирует каждой композиции.
Примечание: G ' значения должны быть стабильными во времени точки; Если они не являются, % напряжения и частоты зачисток должно выполняться для выбора соответствующего значения 14.
5. Кучность белка
- подготовить требуемый шаблон для фотошаблонов, с помощью программы автоматизированного проектирования (САПР). Печатайте photomask на прозрачный лист с помощью принтере с высоким разрешением. Замочите photomask в этанол 70% за 10 мин до использования. Дайте высохнуть в капюшоне культуры клеток перед использованием photomask воздуха.
- Добавить решение белка thiolated, подготовленный на шаге 2 на поверхности Гидрогель для поверхности патронирования. Пипетка 1-2 мкл/см 2 thiolated раствора белка на поверхности каждого вырежьте из геля.
Примечание: Важно свести к минимуму объем белка; добавить только достаточно, чтобы равномерно покрыть всю поверхность образца гидрогеля. - Тщательно место photomask на поверхности гидрогеля. Не позволяйте пузырьки воздуха между photomask и поверхностью гидрогеля. Аккуратно надавите на маску, чтобы удалить любые пузыри формы.
- Предоставляют гидрогеля на второй раунд Ультрафиолета (длина волны: 365 Нм, мощность: 3-4 МВт/см 2) за 30-60 s.
Примечание: Важно для воздействия шаблон достаточно УФ света для создания сильной шаблона не вызывая потери функции протеина. - Мыть гидрогели с PBS для удаления непрореагировавшего видов и место каждой Гидрогель в рамках хорошо пластины. Будьте внимательны при размещении гели в каждой скважине; Убедитесь, что узорной поверхность является лицом вверх. Вымойте гели в PBS на 4 ° C; гели являются стабильными для по крайней мере две недели на 4 ° C.
6. Подготовка гидрогели для заполнения ячейки
- инкубировать гели в базальной среднего за 5-10 мин при 37 ° C до посева. Для человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) используйте ЭГМ-2 средних без факторов роста. Минимизировать объем среднего добавлен к каждому хорошо для предотвращения плавающей гидрогеля. Для 48-ну плиты, используйте объемом 250 мкл среднего. G
- спин вниз пластину на 300 x 3 мин для обеспечения что гидрогели расположены в нижней части скважины и не плавают. Сделать это немедленно, до заполнения ячеек.
7. Сотовый посев на гидрогели
- использования стандартных стерильные mammalian клетки культуры процедуры для заполнения ячейки и экспериментальной процедуры. Удалите HUVECs из фляги культуры ткани, с использованием стандартной ячейки отряд протоколов. Вымойте тканевой культуры блюдо с стерильных PBS и инкубировать трипсином для 3-5 мин на 37 ° C.
- Утолить подвеска trypsinized ячейки среднего или трипсина раствором избыток клеток нейтрализатор.
- Спина вниз суспензию клеток в центрифуге на 300 x g 5 мин тщательно удалить супернатант и сохранить клетки Пелле.
- Ресуспензируйте Пелле клеток базальной ЭГМ-2 с без факторов роста. Используйте Горяева для подсчета клеток.
- Добавить 75000 клеток/см 2 для каждого гидрогеля поверхности медленно дозирование в центр каждого хорошо так, чтобы не нарушить гели. Место хорошо пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C. За несколько дней, периодически удалять блюдо для наблюдения в.
8. Оценка отпорности
- культуры е. coli на ночь в виде суспензии в LB отвара в орбитальной подвеска при 37 ° C и 200 об/мин. Спин вниз культуры е. coli, декантируют и воссоздать ячейку Пелле в минимальный объем PBS. Весят, лизоцима и воссоздания на 1 мг/мл для Стоковый раствор.
- Пипетка небольшой объем (25 мкл) акций решения лизоцима в microcentrifuge трубы. Добавить различные уровни LAP фотоинициатора (0-12 мм) и подвергать образцы в 1 мин УФ света. В отдельную группу, добавить такое же количество круг (2 мм) лизоцима решение и предоставить образцы для различной УФ света раз (0-4 мин). Включать репликация для каждого лечения.
- Добавить одинаковый объем концентрированной E. coli решение каждого лизоцима образца для окончательного лизоцима белка концентрацию 0,5 мг/мл. Инкубировать смешанные растворы для 4 ч при комнатной температуре.
Примечание: Это позволяет время для функциональных лизоцима лизируют клеточной стенки бактерий и выпустить протеины в раствор. - Использовать необработанные лизоцима, инкубировали с кишечной палочки для позитивного управления; считайте, что это 100% биологически активные измерения. Используйте решение лизоцима, инкубировали с PBS только как отрицательный контроль.
- Спин вниз образцы удалить ячейки мусор и держать супернатант. Запуск assay Брадфорд количественно оценить общую концентрацию белка в надосадке измерить количество бактериальных lysate.
- Запуск assay Брадфорд после производитель ' s протокол 18. Рассчитать раз изменения концентрации белка по сравнению с отрицательного контроля в.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол для создания биоактивных структур на поверхности PEG гидрогели иллюстрируется на рисунке 1. Таблица была разработана для расчета объема и концентрации для каждого штока решения (Таблица 1а). Белки, чтобы быть иммобилизованным на поверхность гидрогеля изменяются с 2-iminothiolane (рис. 1Б). Эта реакция осуществляется с помощью томов из таблицы 1В. Прекурсоров гидрогеля раствор готовится с 10% вес/объем PEGDA с круг (рис. 1А). Различных прекурсоров PEGDA концентрации может использоваться для получения желаемого субстрата жесткость (рисA). Фибронектин включен в это решение прекурсоров для целей вложения клеток. После тщательного перемешивания, это решение является накапаны в подготовленную форму и воздействию ультрафиолета (рис. 1C). Под действием ультрафиолетовых лучей должны быть сведены к минимуму; воздействие должно быть достаточно для получения гидрогеля. Гидрогель образцы являются кулаком соответствующего диаметра для желаемого хорошо пластины (рис. 1C). Для структурирования поверхности, изменение белка раствор накапаны на поверхность гидрогеля и равномерно. Минимальный объем должны использоваться; объем белка должно быть просто достаточно, чтобы покрыть всю поверхность гидрогеля. Готовых фотошаблонов находится непосредственно на поверхность гидрогеля; следует избегать пузырьки воздуха между маской и гидрогеля. Второй раунд ультрафиолетовый свет используется для ковалентно конъюгат УФ воздействию белки гидрогеля. Гидрогель образцы промывают для удаления непрореагировавшего белков и свидетельствуют подвижности белков (рис. 1D).
Важно свести к минимуму фотоинициатора концентрация и время воздействия УФ когда белки присутствуют. Используя лизоцима отпорности как индикатор, мы обнаружили, что концентрация фотоинициатора круг должен быть меньше 2 мм (рис. 2B) и время воздействия УФ должны составлять менее 2 мин (рис. 2C) сохранить белок биологическую более чем на 80%.
Время экспозиции УФ во время формирования гидрогеля и кучность белка являются как важными параметрами для разработки успешных протокола (рис. 3). Во-первых свести к минимуму воздействие УФ лучей во время Гидрогель образования имеет решающее значение для поддержания функциональных групп бесплатно акрилата для последующих белка иммобилизации реакций (рисA). Гидрогели, воздействию УФ-излучения для больше чем 2 мин неспособны создать шаблоны подвижности белков. Кроме того как воздействие УФ лучей к структуре белка увеличивается, больше белков реагируют на поверхности (рис. 3B).
Наконец, клетки могут быть культивировали на эти узорной гидрогеля субстратов для манипулирования поведение клеток. Чтобы показать потенциал иммобилизованных форм на гидрогели, мы узорной VEGF, фактор роста, важно для эндотелиальных клеток и культивировали HUVECs на поверхности с помощью базальной ЭГМ-2 средних (рис. 4). HUVECs равномерно были посеяны на поверхность VEGF-узорные PEG гидрогели(Рисунок 4). Через два дня после посева, HUVECs были замечены мигрировать к пространственной регионах гидрогеля, содержащий иммобилизованных VEGF (Рисунок 4B, C). Это один из примеров шаблона биоактивные белка на PEG гидрогели используется влиять на поведение клеток.
Рисунок 1: Схема формирования гидрогеля и белка патронирования. (A) приготовляют раствор прекурсоров гидрогеля с PEGDA мономеров, фотоинициатор и внеклеточный протеин клеток вложения. (B) изменить белки с бесплатным тиоловых групп, реагируя с 2-iminothiolane. (C) Пипетка решение прекурсоров в подготовленную форму и подвергать УФ света сформировать гидрогеля. Выбивать гидрогеля образцы желаемого размера. Пипетки (D) решения изменение белка на поверхности гидрогеля, место photomask на поверхности и подвергнуть его второй раунд УФ-излучения. Промойте гель для удаления непрореагировавшего видов до изображений и заполнения ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Модулирующая жесткость и белками биологическую. (A) изменения в концентрации мономеров PEGDA в рамках решения гелем прекурсоров изменить жесткость гидрогеля. (B) повышение концентрации LAP фотоинициатора понижает функцию белка после 1 мин УФ облучения. (C) увеличение УФ Выдержка понижает функцию белка с 2 мм круг. Все планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение реплицирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Шаблон и гидрогелевые УФ облучения раз оптимизирован для патронирования белка. (A) УФ минимизация воздействия раз Гидрогель образования позволяет для поверхности патронирования. (Б) увеличение УФ облучения раз для поверхности патронирования увеличивает прочность шаблон. Масштаб баров = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Эндотелиальных клеток, отвечая на шаблон VEGF. (A) форма HUVECs посеяны на гидрогели. (B и C) HUVECs смысл VEGF шаблон и мигрировать иммобилизованных VEGF. Изображения были взяты два дня после посева в (B), 4 X и (C) 10 крат. Масштаб баров = 500 мкм. HUVEC-ОПП (красный) и шаблон VEGF-488 (зеленый) были захвачены с фильтрами возбуждения и выбросов в 528/553 и 465/495, соответственно.
Таблица 1: расчеты для акций и гель решения прекурсоров. Красный флажок указывает, что определяемые пользователем значения, такие как молекулярный вес, желаемых запасов концентрации и весил из массы. Синие ящики представляют значения, которые были рассчитаны на основе определяемых пользователем значений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предоставляет метод для создания шаблонов биоактивные белка для биологических приложений. Есть несколько изменений, которые могут быть сделаны адаптировать этот протокол для различных экспериментов. Во-первых требования вложение ячейки будет варьироваться для различных типов клеток. Если изначально наблюдается плохой клеток привязанность к гели, повышение концентрации белка ECM в рамках решения прекурсоров рекомендуется. Другие белки ECM может использоваться вместо фибронектин, включая различные типы коллагена, Ламинин или их комбинации. Для каждого нового типа клеток клеток вложения должны быть оптимизированы до гидрогеля кучность. Этот протокол также обеспечивает фотошаблонов, созданных пользователем. Основываясь на требуемое приложение, фотошаблонов могут выпускаться с различными располагают, размеров, форм и общей структуры. Равномерное иммобилизации может быть достигнуто в отсутствие фотошаблонов.
Этот протокол имеет определенные ограничения. Как подчеркивается в Представитель результатыэтот метод чувствителен к количество УФ света на каждом шагу. Длительное воздействие на этапе формирования гидрогеля ограничивает доступные акрилата группы для последующего поверхности bioconjugation. Таким образом ключевым шагом в этот протокол является хорошо управляемых УФ лучей раз для каждого шага. Кроме того этот протокол требует высокой концентрации белка запас для успешного патронирования. Низкие концентрации белка приведет к плохой поверхности модели. Кроме того фотошаблонов также ограничения в том, что они могут производить только дискретных моделей. Более сложные шаблоны может быть достигнуто с аналогичные подходы, но требуют более продвинутые методологии.
Этот протокол имеет важное значение для существующих методов, как он обеспечивает простой способ для регулировки жесткости субстрата и белка кучность. С помощью акрилата химии для Гидрогель образования позволяет масштабы, спектр субстрата жесткость в физиологических пределах. Просто корректировки концентрации PEGDA в рамках решения прекурсоров дает контроль над жесткость гидрогеля. Кроме того, использование нажмите химии для патронирования белка позволяет для быстрого сопряжения между гидрогеля субстрата и thiolated изменение белка. Это ключевой особенностью, как это позволяет этот протокол быть применимым к любой белка или пептида интерес.
PEG гидрогели являются перспективными биоматериалов, которые могут использоваться для изучения новых платформ для отображения биохимических подсказки для биологических систем. Ли форма поверхности иммобилизации или пространственно определенных шаблонов, эти методы предоставляют новые способы управления поведением ячеек. Продвигаясь вперед, улучшению биоматериала технологии обеспечит новый взгляд на поведение клеток и далее нашей способности пилки в vivo сигнализации мотивы в рамках систем в пробирке . Это может быть полезно для дифференцировки стволовых клеток и моделирования развития сигнализации в пределах контролируемой экспериментальной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было главным образом при поддержке грантов от Американской ассоциации сердца ученый развития Грант (12SDG12050083 г.д.), национальные институты здравоохранения (R21HL102773, R01HL118245 к г.д.) и Национальный научный фонд (CBET-1263455 и CBET-1350240 г.д.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
