Summary
Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .
Abstract
Existem muitos estímulos biológicos que podem influenciar a diferenciação celular de comportamento e células-tronco. Abordagens de cultura celular geral dependem de fatores solúveis dentro o meio para controlar o comportamento de célula. No entanto, adições solúveis não podem imitar determinados motivos, tais como fatores de crescimento ligados a matriz de sinalização, sinalização celular e espaciais pistas bioquímicas, que são influências comuns em células. Além disso, as propriedades biofísicas da matriz, tais como a rigidez do substrato, desempenham importantes funções no destino da célula, que não é facilmente manipulado usando celular convencional, as práticas de cultivo. Neste método, descrevemos um protocolo simples para fornecer proteínas bioativas estampadas em hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) usando fotoquímica. Esta plataforma permite o controle independente de tacos de bioquímicos espaciais e rigidez do substrato. Estes hidrogel pode alcançar uma grande gama de valores de rigidez fisiologicamente relevantes. Além disso, as superfícies destes hidrogel podem ser photopatterned com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Esses métodos foram otimizados para manter a função da proteína após imobilização de superfície. Este é um protocolo versátil que pode ser aplicado a qualquer proteína ou peptídeo de interesse para criar uma variedade de padrões. Finalmente, células semeadas nas superfícies destes hidrogel bioativos podem ser monitoradas ao longo do tempo como eles respondem aos sinais espacialmente específicos.
Introduction
Existem muitos estímulos que influenciam o comportamento da célula. Geralmente, as técnicas de cultivo de célula típica dependem de fatores solúveis para eliciar respostas celulares; no entanto, existem limitações para esta abordagem. Esses métodos não são capazes de exibir com precisão todos os motivos de sinalização comumente encontrados in vivo. Tais mecanismos de sinalização incluem sequestrados e fatores de crescimento, sinalização celular, sinais bioquímicos espacialmente específicas. Além disso, a rigidez do substrato pode desempenhar um papel importante na diferenciação de comportamento e células-tronco de células e não é facilmente manipulado usando celular comum cultivo práticas1,2. Abordagens de biomaterial para oferecer uma nova plataforma para começar a explorar esses mecanismos de sinalização. Em particular, o hidrogel é excelentes candidatos para ajuste de substrato rigidez3,4, imobilização de proteínas e peptídeos5,6e criando padrões específicos espacialmente7, 8.
Hidrogel é comumente usados como andaimes em engenharia de tecidos devido a suas semelhanças bioquímicas e biofísicas com a matriz extracelular (ECM)9,10. Polímeros naturais são opções comuns para andaimes, que são biocompatíveis e são encontrados em muitos tecidos do corpo. A limitação do uso de polímeros naturais como substratos é que faltam partes químicos facilmente manipulados para bioconjugation. Por outro lado, o hidrogel sintético, como tal como PEG, é excelentes plataformas para químicos alvo11,12. Além disso, PEG hidrogel não eliciar uma resposta celular e, portanto, é usados como backbones de inertes para a criação de andaimes bioativos.
Para criar o hidrogel bioativos, tanto fotopolimerização e tiol-ene clique química reações são empregadas. Estes photoreactions requerem um fotoiniciador e uma fonte de luz UV. Quando Fotoiniciadores são introduzidas à luz UV, laços quebrar a radicais de formulário. Radicais de teses são necessários para iniciar a reação, mas podem afetar negativamente a proteína Bioatividade12,13. Portanto, é fundamental otimizar o fotoiniciador e tempos de exposição UV para manter a bioatividade de proteína.
Neste método, o hidrogel é sintetizados através de acrilato-acrilato fotopolimerização de crescimento de cadeia. Monômeros de PEG-diacrylate (PEGDA) reagem uns com os outros para formar redes de polímero ramificado responsável pela estrutura do hidrogel. A concentração de monómeros PEGDA dentro da solução de precursor de gel controlará a rigidez do substrato. Devido o pequeno pore tamanho do hidrogel, proteínas de ECM como fibronectina podem ser facilmente incorporadas dentro o hidrogel para efeitos de fixação da célula. Finalmente, estes hidrogel pode ser superfície-estampados com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Aqui, não tenha reagidos acrilatos livre dentro do sistema de hidrogel reagirá com tióis livre localizados na proteína ou peptídeo quando exposto à luz UV. Depois que as proteínas ou peptídeos são imobilizados na superfície de hidrogel, o hidrogel pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas sem perder a bioatividade. Isto oferece conveniência, planejamento experimental flexíveis e a possibilidade de colaboração entre laboratórios. Em geral, esta plataforma permite biomecânica e espacial controle bioquímico, independente uns dos outros, pela oportunidade de influenciar o comportamento celular.
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Protocol
1. preparação de materiais para a síntese do Hydrogel
- preparar soluções estoque de PEGDA lítio fenil-2.4.6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina em condições estéreis e com base em cálculos (tabela 1A).
- Pesar e dissolver compostos em tampão fosfato salino (PBS). Normalmente, manter PEGDA trabalhando as concentrações de solução entre 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Adicionar a solução de PEGDA através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
Nota: Manter as soluções PEGDA cobertas com uma folha de embrulho para protegê-los da luz. Preparar uma solução fresca de PEGDA (recomendado) para cada experimento. - Reconstituir fibronectina proteína em pó baseia o fabricante ' recomendação de s. Manter a solução estoque de fibronectina em 1 mg/mL, alíquota, em alíquotas de 60 a 100 µ l e armazená-los a-20 º C até o uso. Descongelar as alíquotas a 4 ° C por várias horas ou durante a noite antes de usar. Se o estoque de proteína não é fornecido já em condições estéreis, use um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
Nota: Fibronectina é usada para ligação de celular. Outras proteínas de ECM podem ser substituídas. - Pesar LAP para a solução e dissolvê-lo em PBS; uma concentração típica de estoque é 25 mg/mL. Proceda à sonicação, se houver algum problema com a dissolução. Passe a solução através de um filtro de 0,22 µm para a esterilização. Cobrir o colo com um embrulho de papel alumínio e mantê-lo em 4 ° C por até diversos meses.
Nota: O colo é o fotoiniciador utilizado para a fotoquímica.
- Pesar e dissolver compostos em tampão fosfato salino (PBS). Normalmente, manter PEGDA trabalhando as concentrações de solução entre 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Adicionar a solução de PEGDA através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
- Preparar moldes de slide de vidro estéril para formação de hidrogel.
Folha de
- autoclave um poliéster; uma é necessária para cada molde de gel. Embeba duas lâminas de vidro e três espaçadores de plástico (0,5 mm de espessura) para cada molde gel em etanol a 70% pelo menos 2h, mas geralmente deixe de molho durante a noite. Mergulhe cinco grampos da pasta para cada molde gel em etanol a 70% por 10 min antes de usar.
- Coloque as lâminas de vidro, espaçadores e clips de fichário para uma pequena folha autoclavada do capuz de cultura celular de deixe-os secar ao ar durante várias horas.
- Preparar moldes de hidrogel, colocando espaçadores de plástico ao redor da borda de uma lâmina de vidro. Coloque a segunda lâmina de vidro na parte superior. Fixar os espaçadores firmemente ao lado do outro com grampos da pasta, dois de cada lado longo e por cima.
Nota: Se isto não está montado corretamente, a solução de gel vai vazar para fora. - Superfície-esterilizar o molde com cultura celular capa UV luz durante 30 min antes de usar. No meio, virar o molde para expor as duas superfícies.
2. Modificando as proteínas com um tiol livre
- preparar soluções estoque usando cálculos de folha de cálculo para conversão de amina em thiol em proteínas (tabela 1A).
- Tornar o amortecedor da reação, ajustar a PBS pH 8 e adicionar 5 mM EDTA. Amortecedor da reação pipeta em um filtro de 0,22 µm seringa para esterilização.
Nota: EDTA é importante, pois protege tióis formando ligações de bissulfeto. Grupos tiol devem permanecer em sua forma reduzida para a reação ocorrer.
Pesar 2-iminothiolane - (Traut ' s reagente) e dissolvê-lo no buffer de reação para uma concentração de solução-mãe de 2 mg/mL (14 mM). Passe a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização. Armazenar a solução a 4 ° C por até diversos meses.
Nota: 2-iminothiolane é a molécula que reage com aminas livre expostas ao solvente sobre as proteínas e converte-os em livre tióis. - Reconstituir a proteína no amortecedor da reação em concentrações entre 0,1 e 1 mg/mL. A menos que previamente estéril, pipetar esta solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para a esterilização.
Nota: Esta proteína é o sinal de bioquímico que irá ser modelado para a superfície de hidrogel. Também, enquanto as concentrações de proteína podem variar, concentrações mais altas são ideais para padrões de proteína mais fortes.
- Tornar o amortecedor da reação, ajustar a PBS pH 8 e adicionar 5 mM EDTA. Amortecedor da reação pipeta em um filtro de 0,22 µm seringa para esterilização.
- Reagir a proteína com 2-iminothiolane pela mistura de ambas as soluções estoque; use tabela 1B para calcular a proporção do volume correto. Normalmente, usar uma razão molar de 8:1-2-iminothiolane a proteína.
Nota: Para maiores proteínas ou mais diluir concentrações, use uma maior taxa de molar de 2-iminothiolane. Consulte o fabricante ' s protocolo 15. - Incubar a reação por 1h à temperatura ambiente. Usar uma rotação do desalting microcoluna para remover o produto da proteína thiolated de reagentes remanescentes, seguindo o fabricante ' s protocolo 16.
Nota: O limite de exclusão de resina é KDa 5. - Uso Ellman ' s do ensaio para medir quantitativamente o número de tióis livre por proteína. Siga o fabricante ' protocolo de s para o ensaio 17.
3. Formação de hidrogel
- criar a solução de precursor de gel com base nos valores calculados da tabela 1. Misture o PEGDA, fibronectina e volumes de colo. Adicionar a solução vigorosamente para garantir uma solução homogénea, mas evitar a criação de bolhas. Manter a solução protegida da luz.
- Adicionar o precursor de solução de gel cuidadosamente entre as lâminas de dois vidro do gel de molde. Normalmente, adicione um volume entre 800 e 1.000 µ l para o molde. Expor a solução de gel no molde à luz UV (comprimento de onda: 365 nm, potência: 3-4 mW/cm 2) para 1-2 min formar o hidrogel.
Nota: Não exponha o hidrogel à prolongada luz UV, como que vai limitar a proteína de superfície padronização capacidades. - Tire os grampos da pasta e remover suavemente a lâmina de vidro superior aplicando-se em frente à pressão para os espaçadores de dois lado.
- Use um soco biópsia apropriadamente dimensionados para cortar as amostras de hidrogel. Um soco hidrogel múltiplos do retângulo para servir como repetições e amostras de controlo de gel de.
4. Medições de rigidez de hidrogel
soco de biópsia- soco para fora hidrogel com 8 mm de diâmetro para um rheometer placa paralela de 8 mm. Carregar um hidrogel de amostra para o rheometer (consulte a Tabela de materiais).
- Inferior a geometria da placa paralela que é de 8 mm de diâmetro até fazer contato com a superfície do gel. Manter uma distância de 0,5 mm para uma amostra de 0,5 mm de espessura de hidrogel.
- Executar varreduras de tempo por 5 min à estirpe de 0,1%, 0,1 Hz de frequência e 37 ° C. média a G ' valores entre cada varredura de tempo. Executar o hidrogel independente para repetições de cada composição.
Nota: A G ' valores devem ser estáveis em pontos de tempo; Se eles não são, por cento Coe e varreduras de frequência devem ser realizadas para selecionar o apropriado valores 14.
5. Padronização de proteína
- preparar o padrão desejado para a Fotomáscara usando um programa de desenho (CAD) auxiliado por computador. Imprima a Fotomáscara em uma folha transparente usando uma impressora de alta resolução. Embeba a Fotomáscara em etanol a 70% por 10 min antes de usar. Permitir a Fotomáscara para o ar seco em uma capa de cultura celular antes do uso.
- Adicionar a solução de proteína thiolated preparada na etapa 2 para a superfície do hidrogel de patrocínio de superfície. Pipetar 1-2 µ l/cm 2 de thiolated solução de proteína para a superfície de cada gel recortada.
Nota: É importante minimizar o volume de proteína; Adicione apenas o suficiente para cobrir uniformemente toda a superfície da amostra hidrogel. - Coloque cuidadosamente a Fotomáscara sobre a superfície do hidrogel. Não permita que as bolhas de ar entre a Fotomáscara e a superfície de hidrogel. Pressione suavemente para baixo a máscara para remover quaisquer bolhas que se formam.
- Expor o hidrogel para uma segunda rodada de luz UV (comprimento de onda: 365 nm, potência: 3-4 mW/cm 2) para 30-60 s.
Nota: É importante para o padrão de exposição a suficiente luz UV para criar um padrão forte sem causar a perda da função da proteína. - Lavar o hidrogel com PBS para remover espécies não tenha reagidos e coloque cada hidrogel dentro a placa bem. Tenha cuidado ao colocar o gel em cada poço; Certifique-se que a superfície padronizada é cara acima. Lave os géis em PBS a 4 ° C; géis são estáveis pelo menos duas semanas em 4 ° C.
6. Preparando o hidrogel para a propagação da célula
- incubar os géis em meio basal por 5-10 min a 37 ° C, antes da semeadura. Para a veia umbilical humano em células endoteliais (HX), use EGM-2 meio sem fatores de crescimento. Minimizar o volume de meio adicionado a cada um para impedir hidrogel flutuante. Para uma placa de 48, usar um volume de 250 µ l de meio.
- Spin para baixo a placa no x 300 g por 3 min garantir que o hidrogel está localizados no fundo do poço e não está flutuando. Faça isso imediatamente antes da semeadura de celular.
7. A semeadura em hidrogel de célula
- uso padrão estéril pilha mamífera cultura para a propagação de células e experimental nos procedimentos. Remova HX de frascos de cultura de tecidos, usando protocolos de desprendimento de pilha padrão. Lave o prato de cultura de tecidos com PBS estéril e incubar com tripsina para 3-5 min a 37 ° C.
- Saciar a suspensão de células trypsinized com solução de células em excesso médio ou tripsina neutralizador.
- Spin para baixo a suspensão de eritrócitos na centrífuga a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter o centrifugado.
- Resuspenda o pellet de células basais EGM-2 sem fatores de crescimento. Use um hemocytometer para a contagem celular. Superfície de
- Adicionar 75.000 células/cm 2 para cada hidrogel pipetando lentamente para o centro de cada bem para não perturbar os géis. Coloque a placa bem em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C. Por vários dias, periodicamente, remover o prato para observação.
8. Avaliação da Bioatividade
- cultura Escherichia coli durante a noite em suspensão no caldo LB em uma suspensão orbital a 37 ° C e 200 rpm. Spin para baixo a cultura de Escherichia coli, decantar e reconstituir o centrifugado em volume mínimo de PBS. Pesar a lisozima e reconstituir a 1 mg/mL da solução estoque.
- Pipetar um volume pequeno (25 µ l) de solução-mãe de lisozima para tubos microcentrifuga. Adicionar níveis variados de fotoiniciador de colo (0-12 mM) e expor as amostras a 1min da luz UV. Em um grupo separado, adicionar a mesma quantidade de colo (2 mM) à solução de lisozima e expor amostras a diferentes tempos de luz UV (0-4 min). Incluem repetições para cada tratamento. Solução de
- Adicionar igual volume de concentrado de Escherichia coli para cada amostra de lisozima para uma concentração de proteína lisozima final de 0,5 mg/mL. Incubar as soluções mistas para 4 h à temperatura ambiente.
Nota: Isso permite que tempo para lisozima funcional de lisar a parede celular bacteriana e liberar proteínas na solução. - Use não tratada lisozima incubada com e. coli para um controlo positivo; considere isto uma medição de bioativos de 100%. Use a solução de lisozima incubada com PBS sozinho como um controle negativo.
- Spin para baixo as amostras para remover detritos celulares e manter o sobrenadante. Executar um ensaio de Bradford para quantificar a concentração total de proteína dentro do sobrenadante para medir a quantidade de lisado bacteriano.
- Executar um ensaio de Bradford seguindo o fabricante ' s protocolo 18. Calcular a dobra mudança na concentração de proteína, comparada com o controle negativo.
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Representative Results
O protocolo para criar padrões de bioativos na superfície do PEG hidrogel é ilustrado na Figura 1. Uma folha de cálculo foi desenvolvida para calcular o volume e a concentração de cada solução estoque (quadro 1A). Proteínas para ser imobilizado na superfície do hidrogel são modificadas com 2-iminothiolane (Figura 1B). Esta reação é realizada usando os volumes da tabela 1B. A solução de hidrogel precursor é preparada com 10% peso/volume de PEGDA com colo (Figura 1A). Várias concentrações de PEGDA precursor podem ser usadas para produzir a rigidez de substrato desejado(Figura 2). Fibronectina é incluída dentro desta solução de precursor para fins de fixação da célula. Após a mistura completa, esta solução é pipetada no molde preparado e exposta à luz UV (Figura 1C). Exposição a luz UV deve ser minimizada; exposição deve ser suficiente para produzir um hidrogel. Amostras de hidrogel são perfuradas para fora para o diâmetro adequado para a placa bem desejado (Figura 1C). De superfície patrocínio, solução de proteína modificada é pipetada para a superfície de um hidrogel e espalhe uniformemente. Volume mínimo deve ser usado; volume de proteína... deve ser suficiente para cobrir toda a superfície do hidrogel. A Fotomáscara preconcebida é colocada diretamente sobre a superfície de hidrogel; bolhas de ar entre a máscara e o hidrogel devem ser evitadas. Uma segunda rodada de luz UV é usada para o conjugado covalentemente proteínas expostas ao UV para o hidrogel. Amostras de hidrogel são lavadas para remover as proteínas não tenha reagidas e revelar o padrão de proteína imobilizado (Figura 1D).
É importante minimizar o fotoiniciador concentração e tempo de exposição UV quando as proteínas estão presentes. Usando a bioatividade de lisozima como um indicador, descobrimos que a concentração de fotoiniciador do colo deve ser inferior a 2 mM (Figura 2B) e o tempo de exposição UV deve total menos de 2 min (Figura 2C) para reter uma proteína maior que 80% de Bioatividade.
Tempo de exposição UV durante formação de hidrogel e padronização de proteína são dois parâmetros importantes para o desenvolvimento de um protocolo bem sucedido (Figura 3). Em primeiro lugar, minimizando a exposição aos raios UV durante formação de hidrogel é fundamental para manter grupos funcionais de acrilato gratuito para reações de imobilização de proteínas subsequentes(Figura 3). Hidrogel expostos à luz por mais de 2 min UV é incapazes de criar padrões de proteínas imobilizadas. Além disso, à medida que aumenta a exposição aos raios UV para o padrão de proteína, mais proteínas reagem à superfície (Figura 3B).
Finalmente, as células podem ser cultivadas para estas estampados hidrogel substratos para manipular o comportamento da célula. Para mostrar o potencial de imobilizado padrões de hidrogel, nós padronizado VEGF, um fator de crescimento importante para células endoteliais e culta HX na superfície usando meio basal da EGM-2 (Figura 4). HX foram semeadas uniformemente sobre a superfície da PEG com estampas VEGF hidrogel(Figura 4). Dois dias após a semeadura, HX foram observados para migrar para as regiões espaciais de hidrogel que continha imobilizado VEGF (Figura 4B, C). Este é um exemplo de um padrão de proteína bioativos em hidrogel de PEG, sendo usado para influenciar o comportamento da célula.
Figura 1: Esquemática da formação de hidrogel e padronização de proteína. (A) preparar a solução de hidrogel precursor com PEGDA monômeros, fotoiniciador e proteína extracelular para o acessório de celular. (B) modificar as proteínas com livre grupos tiol por reacção com 2-iminothiolane. (C) adicionar a solução de precursor no molde preparado e expô-lo à luz UV para formar o hidrogel. Um soco hidrogel amostras do tamanho desejado. Pipeta (D) a solução de proteínas modificadas na superfície do hidrogel, colocar uma Fotomáscara na superfície e expô-la a uma segunda rodada de luz UV. Lave o gel para remover espécies não tenha reagidos antes da imagem latente e propagação de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Modulando a rigidez e a bioatividade proteína. (A) alterações na concentração de monômeros PEGDA dentro da solução de gel de precursor alterar rigidez de hidrogel. (B) aumentar a concentração de colo fotoiniciador reduz a função da proteína após 1 min de exposição aos raios UV. Tempo de exposição (C) aumento UV reduz a função da proteína com colo de 2 milímetros. Todas as barras de erro representam o desvio padrão de repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Padrão e hidrogel tempos de exposição de UV otimizados para padronização de proteína. (A), minimizando UV exposição vezes para formação de hidrogel permite padronização de superfície. Tempos de exposição (B) aumento UV de superfície patrocínio aumenta a força do padrão. Escala de barras = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Células endoteliais, respondendo a um padrão VEGF. (A) uniforme HX semeado no hidrogel. (B e C) HX detetar o padrão VEGF e migrar para o VEGF imobilizado. Imagens foram feitas dois dias após a semeadura em (B) 4 X e (C) 10 X ampliação. Escala de barras = 500 µm. HUVEC-RFPs (vermelho) e VEGF-488 padrão (verde) foram capturados com filtros de excitação e emissão em 528/553 e 465/495, respectivamente.
Tabela 1: cálculos para estoque e gel soluções precursor. A caixa vermelha indica valores definidos pelo usuário, tais como o peso molecular, desejado concentrações estoque e massas pesadas-para fora. Caixas azuis representam valores que foram calculados com base nos valores definidos pelo usuário.
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Discussion
Este protocolo fornece um método para criar padrões de proteína bioativos para aplicações biológicas. Existem várias modificações que podem ser feitas para se adaptar a este protocolo para experiências diferentes. Primeiro, requisitos de ligação de celular pode variar para diferentes tipos de células. Se acessório celular pobre para os géis é observado inicialmente, aumentando a concentração da proteína dentro da solução de precursor do ECM é aconselhada. Outras proteínas de ECM podem ser usadas em vez de fibronectina, incluindo diferentes tipos de colágeno, laminina ou uma combinação destes. Para cada novo tipo de célula, acessório de celular deve ser otimizado antes da padronização de hidrogel. Este protocolo permite também máscaras de usuário-projetado. Baseado no aplicativo desejado, máscaras podem ser produzidas com dispõem de vários tamanhos, formas e padrões gerais. Imobilização de uniforme pode ser alcançada na ausência de uma Fotomáscara.
Este protocolo tem certas limitações. Como destacado nos Resultados do representante, este método é sensível à quantidade de luz UV a cada passo. Superexposição durante a etapa de formação de hidrogel limita os grupos de acrilato disponíveis para subsequente bioconjugation superfície. Portanto, um passo fundamental neste protocolo é bem geridos tempos de exposição à luz UV para cada etapa. Também, este protocolo requer um estoque de proteína de alta concentração de patrocínio bem-sucedido. Baixas concentrações de proteína irão resultar em testes padrões de superfície pobres. Além disso, máscaras também estão limitando em que só podem produzir padrões discretos. Padrões mais complexos podem ser alcançados com abordagens semelhantes, mas exigem uma metodologia mais avançada.
Este protocolo é significativo para os métodos existentes como fornece um método simples para ajustar a rigidez do substrato e padronização de proteína. Usar química acrilato para a formação de hidrogel permite uma escala de magnitude de rigidez de substrato dentro da faixa fisiológica. Simplesmente ajustando a concentração de PEGDA dentro da solução de precursor dá controle sobre a rigidez de hidrogel. Além disso, o uso da química clique para padronização de proteína permite rápida conjugação entre o substrato de hidrogel e thiolated modificados da proteína. Esta é uma característica de projeto-chave, que permite que este protocolo para ser aplicável a qualquer proteína ou peptídeo de interesse.
Hidrogel PEG é biomateriais promissoras que podem ser usados para explorar novas plataformas para a exibição de sinais bioquímicos de sistemas biológicos. Se imobilização superfície uniforme ou padrões específicos espacialmente, estas técnicas fornecem novas maneiras para controlar o comportamento da célula. Avançando, o avanço da tecnologia de biomateriais proporcionará novos insights sobre o comportamento da célula e ainda mais as nossas capacidades para recapitular vivo em sinalização motivos dentro de sistemas em vitro . Isso pode ser benéfico para a sinalização do desenvolvimento dentro de um sistema experimental controlado de modelagem e diferenciação de células-tronco.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado principalmente por concessões do coração americano Associação cientista desenvolvimento concessão (12SDG12050083 a G.D.), o National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 a G.D.) e o National Science Foundation (CBET-1263455 e CBET-1350240 a G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
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