Summary
في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم فوتوبوليميريزيشن وتقنيات الكيمياء انقر لإنشاء أنماط البروتين أو الببتيد على السطح من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) الهلاميات المائية، توفير معطلة إشارات النشطة بيولوجيا لدراسة الاستجابات الخلوية في المختبر .
Abstract
وهناك العديد من المحفزات البيولوجية التي يمكن أن تؤثر على التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية. خلية عامة الثقافة نهج الاعتماد على العوامل القابلة للذوبان داخل وسيلة للتحكم في سلوك الخلية. ومع ذلك، لا يمكن تقليد الإضافات القابلة للذوبان بعض إشارات زخارف، مثل ربط مصفوفة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والرموز البيوكيميائية المكانية، التي تعد شائعة التأثيرات على الخلايا. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية للمصفوفة، مثل صلابة الركازة، دوراً هاما في مصير الخلية، الذي هو عدم التلاعب بسهولة باستخدام الخلية التقليدية استزراع الممارسات. في هذا الأسلوب، يصف لنا بروتوكولا مباشرة لتوفير البروتينات النشطة بيولوجيا منقوشة في الهلاميات المائية الاصطناعية البولي إثيلين غليكول (الربط) باستخدام الكيمياء الضوئية. يسمح هذا البرنامج لمراقبة مستقلة الركازة صلابة والإشارات البيوكيميائية المكانية. يمكن تحقيق هذه الهلاميات المائية طائفة كبيرة من قيم صلابة فسيولوجيا ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، أسطح هذه الهلاميات المائية يمكن أن تكون فوتوباتيرنيد مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عبر شرق ثيول انقر الكيمياء ردود الفعل. لقد تم تحسين هذه الأساليب الاحتفاظ بوظيفة البروتين بعد التثبيت السطحي. هذا هو بروتوكول تنوعاً التي يمكن تطبيقها على أي بروتين أو ببتيد من اهتمام لإنشاء مجموعة متنوعة من أنماط. وأخيراً، يمكن رصد خلايا المصنف على أسطح هذه الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا مع مرور الوقت كما أنها تستجيب لإشارات محددة مكانياً.
Introduction
وهناك العديد من المنبهات التي تؤثر على سلوك الخلية. وبصفة عامة، تقنيات تثقيف الخلية النموذجية تعتمد على العوامل القابلة للذوبان الحصول على ردود الخلوية؛ ومع ذلك، هناك قيود على هذا النهج. هذه الأساليب غير قادر على دقة عرض جميع زخارف الإشارات شيوعاً وجدت المجراة في. وتشمل هذه الآليات مما يشير إلى المنحاة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والإشارات البيوكيميائية محددة مكانياً. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دوراً مهما في التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية صلابة الركيزة وهو عدم التلاعب بسهولة باستخدام المشتركة خلية تثقيف الممارسات1،2. النهج مادة بيولوجية توفر منصة جديدة البدء في استكشاف آليات هذه الإشارات. على وجه الخصوص، هي الهلاميات المائية المرشحين ممتازة لضبط الركازة صلابة3،4، شل البروتينات والببتيدات5،6، وخلق أنماط محددة مكانياً7، 8.
الهلاميات المائية تستخدم عادة السقالات في هندسة الأنسجة بسبب تلك القواسم المشتركة الفيزيائية والكيميائية الحيوية مع9،المصفوفة خارج الخلية (ECM)10. البوليميرات الطبيعية هي الخيارات الشائعة للسقالات، كما أنها متوافق حيويا وتوجد في العديد من أنسجة الجسم. الحد من استخدام البوليميرات الطبيعية كركائز أنها تفتقر إلى مويتيس الكيميائية بسهولة التلاعب بها بيوكونجوجيشن. من ناحية أخرى، الهلاميات المائية الاصطناعية، على هذا النحو، ربط، منصات ممتازة لكيمياء المستهدفة11،12. بالإضافة إلى ذلك، عدم الحصول على رد خلوية شماعة الهلاميات المائية ولذلك تستخدم كالعمود الفقري خاملة لإنشاء السقالات النشطة بيولوجيا.
لإنشاء الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا، انقر فوتوبوليميريزيشن وشرق ثيول الكيمياء يعملون من ردود الفعل. وتتطلب هذه فوتوريكشنز فوتوينيتياتور ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. عندما يتم عرض فوتوينيتياتورس للأشعة فوق البنفسجية، كسر السندات بشكل الجذور. الجذور أطروحات اللازمة للشروع في رد فعل ولكن يمكن أن يؤثر سلبا على بروتين بيواكتيفيتي12،13. ولذلك، من الأهمية بمكان لتحسين فوتوينيتياتور ومرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على بيواكتيفيتي البروتين.
في هذا الأسلوب، يتم توليفها الهلاميات المائية عن طريق أكريلاتي-أكريلاتي سلسلة فوتوبوليميريزيشن النمو. مونومرات شماعة-دياكريلاتي (بيجدا) تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل البوليمر تشعبت الشبكات المسؤولة عن هيكل المائية. سوف تحكم تركيز بيجدا مونومرات داخل الحل السلائف جل صلابة الركازة. سبب الصغيرة المساحة المائية المسام، وبروتينات ECM مثل فيبرونيكتين يمكن إدراجها بسهولة داخل المائية غرض مرفق خلية. أخيرا، يمكن أن تكون هذه الهلاميات المائية السطحية منقوشة مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عن طريق ثيول-شرق انقر فوق الكيمياء ردود الفعل. هنا، سترد الممتص ثيوريا مجاناً داخل المنظومة المائية مع ثيولس الحرة الموجودة على بروتين أو ببتيد عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية. بعد هي معطلة بالبروتينات أو الببتيدات على سطح المائية، يمكن تخزين المائية عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع دون أن تفقد بيواكتيفيتي. وهذا يوفر راحة ومرونة التخطيط التجريبية، وإمكانية التعاون بين مختبرات. عموما، هذا النظام الأساسي يسمح للنشاط الحيوي والمكانية البيوكيميائية السيطرة، مستقلة عن بعضها البعض، لإتاحة الفرصة للتأثير على سلوك الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"إعداد مواد" لتوليف Hydrogel
- تحضير حلول الأسهم بيجدا والليثيوم فينيل-2,4,6-تريميثيلبينزويلفوسفيناتي (LAP) فيبرونيكتين تحت ظروف معقمة واستنادا إلى العمليات الحسابية (الجدول 1A).
- تزن وتذوب المركبات في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). بشكل عام، الحفاظ على بيجدا العامل تركيزات الحل بين 50 و 200 مغ/مل (5-20% وزن/حجم). "الماصة؛" الحل بيجدا من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
ملاحظة: تبقى الحلول بيجدا مغطاة بإحباط التفاف لحمايتهم من الضوء. إعداد حل بيجدا (مستحسن) لكل تجربة جديدة-
مسحوق - إعادة فيبرونيكتين البروتين استناداً إلى الشركة المصنعة ' التوصية s. الحفاظ على الحل فيبرونيكتين الأسهم في 1 ملغ/مل، اليكووت إلى 60 إلى 100 ميليلتر مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تذويب مختبرين في 4 درجات مئوية لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها قبل استخدامها. إذا لم يتم توفير مخزون البروتين فعلا في ظروف معقمة، استخدم عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
ملاحظة: يتم استخدام فيبرونيكتين لمرفق خلية. يمكن أن يكون محل أخرى بروتينات ECM. - تزن باللفة لحل الأسهم وحله في برنامج تلفزيوني؛ وتركز أسهم نموذجي 25 ملغ/مل. Sonicate إذا كان هناك أي مشكلة مع حل. تمرير الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر للتعقيم. تغطية اللفة مع التفاف إحباط وإبقائه عند 4 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.
ملاحظة: اللفة هو فوتوينيتياتور تستخدم في الكيمياء الضوئية-
- تزن وتذوب المركبات في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). بشكل عام، الحفاظ على بيجدا العامل تركيزات الحل بين 50 و 200 مغ/مل (5-20% وزن/حجم). "الماصة؛" الحل بيجدا من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
- إعداد قوالب الشرائح الزجاجية عقيمة لتشكيل هيدروجيل.
ورقة
- اﻷوتوكﻻف بوليستر؛ واحد مطلوب لكل جل العفن. نقع شريحتين من الزجاج والفواصل البلاستيكية الثلاثة (0.5 مم) لكل العفن جل في الإيثانول 70% على الأقل من 2 ح، ولكن عموما تسمح لهم بنقع بين عشية وضحاها. ينقع خمس مقاطع الموثق لكل العفن جل في الإيثانول 70% قبل 10 دقيقة لاستخدام-
- وضع الشرائح الزجاجية، والفواصل، ومقاطع الموثق في ورقة يعقم صغيرة في هود ثقافة الخلية السماح لهم بالهواء الجاف لعدة ساعات-
- تحضير قوالب المائية عن طريق وضع الفواصل البلاستيكية حول حافة شريحة الزجاج. مكان الشريحة الزجاجية الثانية في الأعلى. تأمين الفواصل محكم بجوار بعضها البعض مع مقاطع الموثق، اثنان على كل جانب طويل وواحد في الأعلى-
ملاحظة: إذا كان هذا لا تجمع بشكل صحيح، حل جل سوف يتسرب. - تعقيم سطح القالب مع خلية ثقافة هود ضوء قبل 30 دقيقة استخدام الأشعة فوق البنفسجية. في منتصف الطريق من خلال، الوجه العفن لفضح كل الأسطح.
2. تعديل البروتينات مع "ثيول الحر"
- إعداد حلول الأسهم باستخدام حسابات من جدول البيانات لتحويل أمين ثيول على بروتينات (الجدول 1A).
ضبط برنامج تلفزيوني على درجة الحموضة 8
- لجعل رد فعل المخزن المؤقت، وإضافة 5 مم يدتا. ماصة رد فعل المخزن المؤقت عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
ملاحظة: يدتا الهامة، كما أنه يحمي ثيولس من تشكيل ثنائي كبريتيد السندات. جماعات ثيول يجب أن تظل في شكلها مخفضة لرد فعل يحدث. - تزن من 2-إيمينوثيولاني (تراوت ' s الكاشف) وحل ذلك في رد فعل المخزن المؤقت لتركيز حل أسهم 2 مغ/مل (14 مم). تمرير الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم. تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.
ملاحظة: 2-إيمينوثيولاني هو الجزيء الذي يتفاعل مع الأمينات الحرة المعرضة للمذيبات في البروتينات وتحويلها إلى ثيولس الحرة- - تشكيل البروتين في رد فعل المخزن المؤقت بتركيز بين 0.1 و 1 ملغ/مل. ما لم تكن عقيمة سابقا، "الماصة؛" هذا الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
ملاحظة: هذا البروتين هو الإشارات البيوكيميائية التي سوف تكون منقوشة على سطح المائية. أيضا، في حين يمكن أن تتباين تركيزات البروتين، تركيزات أعلى تعتبر مثالية لأنماط البروتين أقوى.
- لجعل رد فعل المخزن المؤقت، وإضافة 5 مم يدتا. ماصة رد فعل المخزن المؤقت عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
- رد فعل البروتين مع 2-إيمينوثيولاني بخلط كل الحلول الأسهم معا؛ واستخدام الجدول 1 باء لحساب نسبة حجم الصحيح. عادة، تستخدم نسبة مولى من 8:1 2-إيمينوثيولاني للبروتين-
ملاحظة: للبروتينات أكبر أو أكثر تمييع التركيزات، استخدام نسبة مولى أعلى من 2-إيمينوثيولاني. أرجع إلى الشركة المصنعة ' s البروتوكول 15- - احتضان رد فعل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. استخدام desalting تدور الصغرى-عمود لإزالة المنتج البروتين ثيولاتيد من كواشف مختبر المتبقية، عقب الشركة المصنعة ' s بروتوكول 16-
ملاحظة: هو حد استبعاد هذا الراتنج كاتشين 5. - استخدام Ellman ' s الاعتداء إلى قياس كمي عدد ثيولس مجاناً للبروتين. تتبع الشركة المصنعة ' بروتوكول s ل المقايسة 17-
3. تشكيل هيدروجيل
- إنشاء الحل السلائف جل استناداً إلى القيم المحسوبة من الجدول 1. مزيج معا بيجدا، فيبرونيكتين، وأحجام اللفة. "الماصة؛" الحل بقوة لضمان حل متجانسة، ولكن تجنب خلق الفقاعات. يبقى الحل محمية من الضوء.
- "الماصة؛" حل جل السلائف بعناية بين الشرائح الزجاجية اثنين من العفن هلام. عادة، بإضافة وحدة تخزين بين 800 و 1000 ميليلتر للعفن. يعرض حل جل في القالب للأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 365 نانومتر، السلطة: 3-4 ميغاواط/سم 2) لمدة 1-2 دقيقة لتشكيل المائية.
ملاحظة: لا تعرض المائية لفترة طويلة على ضوء الأشعة فوق البنفسجية، كما أنه سيحد من البروتين السطحي الزخرفة قدرات. - تقلع مقاطع الموثق وإزالة الشرائح الزجاجية أعلى بلطف بتطبيق مقابل الضغط على الفواصل الجانب الثاني- استخدام
- لكمه خزعة حجم مناسب لقطع العينات المائية. لكمه من أصل الهلاميات المائية متعددة من المستطيل جل لتكون بمثابة replicates والتحكم في عينات-
4. القياسات المائية صلابة
- لكمه من الهلاميات المائية مع 8 مم خزعة لكمه رهيوميتير لوحة موازية 8 مم. تحميل عينة المائية واحدة في رهيوميتير (انظر الجدول للمواد)-
- السفلي هندسة اللوحة مواز هو 8 ملم في القطر حتى صنع اتصال مع سطح الهلام. الاحتفاظ بمسافة 0.5 مم لنموذج 0.5 mm سميكة المائية فجوة.
- الاحتلالات وقت تنفيذ لمدة 5 دقائق في سلالة 0.1% و 0.1 هرتز التردد، و 37 ° متوسط جيم ز ' القيم عبر اكتساح كل الوقت. تشغيل الهلاميات المائية المستقلة ل replicates لكل تشكيل.
ملاحظة: ز ' يجب أن تكون القيم ثابتة عبر النقاط الزمنية؛ إذا فليست، يجهد في المئة وينبغي أن يقوم تواتر عمليات التمشيط لتحديد المناسبة قيم 14-
5. الزخرفة البروتين
- تحضير النمط المطلوب النبائط باستخدام برنامج تصميم (CAD) الحاسوب. طباعة النبائط على ورقة شفافة باستخدام طابعة ذات دقة عالية. نقع النبائط في الإيثانول 70% عن 10 دقيقة قبل الاستخدام. تسمح النبائط الهواء الجاف في غطاء ثقافة خلية قبل استخدام.
- إضافة حل البروتين ثيولاتيد إعدادها في الخطوة 2 إلى السطح للمائية للزخرفة السطحية. "الماصة؛" 1-2 ميليلتر/سم 2 ثيولاتيد حل البروتين على سطح كل جل خفض التدريجي.
ملاحظة: من المهم للتقليل من حجم البروتين؛ إضافة فقط ما يكفي لتغطية كامل سطح العينة المائية بالتساوي. - بعناية مكان النبائط على سطح المائية. عدم السماح بفقاعات الهواء بين النبائط والسطح المائية. اضغط برفق على القناع لإزالة أي فقاعات هذا الشكل.
- فضح المائية إلى جولة ثانية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 365 نانومتر، السلطة: 3-4 ميغاواط/سم 2) على 30-60 س.
ملاحظة: من المهم أن تعرض النمط لضوء الأشعة فوق البنفسجية ما يكفي لخلق نمط قوية دون التسبب في فقدان وظيفة البروتين.
أغسل - الهلاميات المائية مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأنواع الممتص ومكان كل المائية داخل اللوحة جيدا. كن حذراً عند وضع المواد الهلامية في كل بئر؛ تأكد من أن السطح منقوشة على الوجه حتى. غسل المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية؛ المواد الهلامية مستقرة لمدة أسبوعين على الأقل في 4 ° C.
6. تحضير الهلاميات المائية "بذر خلية"
- احتضان المواد الهلامية في متوسطة القاعدية لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل البذر. للخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس)، استخدم المتوسطة EGM-2 دون عوامل النمو. التقليل من حجم المتوسط إضافة إلى كل جيدا لمنع المائية العائمة. لوحة 48، حسنا، استخدام وحدة تخزين 250 ميليلتر من المتوسطة. ز
- تدور أسفل اللوحة في 300 x لمدة 3 دقيقة لضمان أن الهلاميات المائية تقع في الجزء السفلي من البئر ولا تطفو. القيام بذلك قبل البذر الخلية مباشرة.
7. خلية استمطار في الهلاميات المائية
- استخدام خلايا الثدييات العقيمة القياسية الثقافة إجراءات خلية البذر وإجراءات تجريبية. إزالة هوفيكس من قوارير زراعة الأنسجة باستخدام البروتوكولات القياسية خلية مفرزة. أغسل طبق استنبات الأنسجة مع PBS العقيمة واحتضان مع التربسين لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إخماد تعليق خلية تريبسينيزيد مع الخلايا الزائدة المتوسطة أو التربسين حل التعادل.
- معين باستمرار تعليق خلية في أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز 5 كحد أدنى بعناية إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في EGM القاعدية-2 مع أية عوامل النمو. استخدام هيموسيتوميتير لخلية العد.
- 75,000 إضافة خلايا/سم 2 لكل المائية السطحية التي بيبيتينج ببطء إلى مركز كل جيدا حتى لا يؤدي إلى الإخلال بالمواد الهلامية. ضع لوحة جيدا إلى حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية. لعدة أيام، بشكل دوري إزالة الطبق للمراقبة-
8. تقييم بيواكتيفيتي
- الثقافة كولاي بين عشية وضحاها في تعليق في مرق رطل في وقف مداري في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة. تدور أسفل ثقافة كولاي وصب وتشكيل خلية بيليه في حجم الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني. تزن بها lysozyme وإعادة تشكيل في 1 ملغ/مل لحل الأسهم.
- "الماصة؛" كمية صغيرة (25 ميليلتر) الحل lysozyme المخزون في أنابيب ميكروسينتريفوجي. إضافة مستويات متفاوتة من اللفة فوتوينيتياتور (0-12 ملم) وعرض العينات إلى 1 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية. في مجموعة منفصلة، بإضافة نفس الكمية من اللفة (2 مم) إلى الحل lysozyme وفضح عينات في أوقات متباينة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية (0-4 دقيقة). وتشمل replicates لكل معاملة.
- حجم مركزة كولاي متساوية إضافة إلى حل لكل عينة lysozyme لتركيز بروتين lysozyme نهائي من 0.5 ملغ/مل. تبني الحلول المختلطة بشأن ح 4 في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: يسمح هذا الوقت ل lysozyme الوظيفية جدار الخلية البكتيرية والإفراج عن البروتينات في الحل- - استخدام غير المعالجة lysozyme المحتضنة مع كولاي لعنصر تحكم إيجابية؛ والنظر في هذا قياس النشطة بيولوجيا 100%. استخدم الحل lysozyme المحتضنة مع برنامج تلفزيوني وحدها كعنصر سلبي.
- تدور أسفل العينات لإزالة الحطام خلية وإبقاء المادة طافية. تشغيل مقايسة برادفورد لقياس التركيز الكلي للبروتين داخل المادة طافية قياس كمية البكتيريا ليساتي. تشغيل
- مقايسة برادفورد بعد الشركة المصنعة ' s البروتوكول 18. حساب إضعاف التغيير في تركيز البروتين مقارنة بمراقبة سلبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول لإنشاء أنماط النشطة بيولوجيا على سطح الوتد الهلاميات المائية يتضح في الشكل 1. ووضع جدول لحساب حجم وتركيز لكل حل الأسهم (الجدول 1 ألف). يتم تعديل البروتينات تكون معطلة على السطح المائية مع 2-إيمينوثيولاني (الشكل 1ب). رد الفعل هذا يتم استخدام وحدات التخزين من الجدول 1 باء. الحل المائية السلائف مستعدة مع 10% وزن/حجم بيجدا مع اللفة (الشكل 1أ). يمكن استخدام مختلف التركيزات بيجدا السلائف تسفر عن تصلب الركيزة المرغوبة (الشكل 2أ). فيبرونيكتين يندرج في إطار هذا الحل السلائف لأغراض مرفق الخلية. بعد خلط دقيق، بيبيتيد إلى العفن استعداد هذا الحل وتتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1ج). وينبغي تقليل التعرض للضوء للأشعة فوق البنفسجية؛ ينبغي أن يكون التعرض ما يكفي لإنتاج المائية. هي لكمات العينات المائية إلى القطر المناسب للوحة جيدا المطلوب (الشكل 1ج). للزخرفة السطحية، بيبيتيد على السطح من المائية حل البروتين المعدل وتنتشر بشكل متساو. يجب استخدام حجم الحد الأدنى؛ يجب أن يكون حجم البروتين فقط ما يكفي لتغطية كامل سطح المائية. النبائط المعرفة مسبقاً ويوضع مباشرة على سطح المائية؛ وينبغي تجنب فقاعات الهواء بين القناع والمائية. يتم استخدام جولة ثانية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية تساهمي متزاوجة البروتينات المعرضة للأشعة فوق البنفسجية للمائية. هي تشطف العينات المائية لإزالة البروتينات الممتص وتكشف عن نمط البروتين المعطل تداولها (الشكل 1د).
من المهم تقليل تركيز فوتوينيتياتور ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية عندما تكون البروتينات موجودة. استخدام بيواكتيفيتي lysozyme كمؤشر، وجدنا أن تركيز فوتوينيتياتور اللفة ينبغي أن يكون أقل من 2 مم (الشكل 2ب) ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية أن مجموع أقل من 2 دقيقة (الشكل 2ج) الإبقاء على البروتين بيواكتيفيتي أكبر من 80%.
وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية أثناء تشكيل المائية والزخرفة البروتين معلمتي الهام لوضع بروتوكول ناجحة (الشكل 3). أولاً وقبل كل شيء، تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية أثناء تشكيل المائية أمر حاسم للحفاظ على المجموعات الوظيفية أكريلاتي الحرة لردود الفعل تجميد البروتين اللاحقة (الشكل 3أ). الهلاميات المائية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة أطول من 2 دقيقة غير قادر على خلق أنماط البروتين المعطل تداولها. بالإضافة إلى ذلك، كما يزيد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في نمط البروتين، تتفاعل البروتينات أكثر إلى السطح (الشكل 3ب).
وأخيراً، يمكن استزراع الخلايا على هذه منقوشة ركائز المائية التعامل مع سلوك الخلية. لإظهار إمكانيات أنماط المعطل تداولها في الهلاميات المائية، نحن منقوشة VEGF، عامل نمو هام لخلايا بطانية، ومثقف هوفيكس على السطح باستخدام القاعدية EGM-2 المتوسطة (الشكل 4). كانت صورة موحدة المصنف هوفيكس على السطح من شماعة منقوشة VEGF الهلاميات المائية(الشكل 4). ولوحظت يومين بعد البذر، هوفيكس إلى الهجرة نحو المناطق المكانية من المائية التي تتضمن VEGF المعطل تداولها (الشكل 4ب، ج). وهذا مثال واحد من نمط البروتين النشطة بيولوجيا على شماعة الهلاميات المائية المستخدمة للتأثير على سلوك الخلية.
رقم 1: التخطيطي لتشكيل المائية والزخرفة البروتين. (أ) إعداد السلائف المائية الحل مع مونومرات بيجدا وفوتوينيتياتور والبروتين خارج الخلية للخلية مرفق. (ب) تعديل الحرة البروتينات مع جماعات ثيول نتيجة للتفاعل مع 2-إيمينوثيولاني. (ج) "الماصة؛" الحل السلائف إلى استعداد العفن وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية لتشكيل المائية. لكمه من أصل العينات المائية من الحجم المطلوب. ماصة (د) محلول البروتين المعدلة على سطح المائية، وضع النبائط على السطح، وتعريضها لجولة ثانية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية. شطف الجل لإزالة الأنواع الممتص قبل التصوير وبذر الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحوير وصلابة والبروتين بيواكتيفيتي. (أ) التغييرات في تركيز بيجدا مونومرات داخل حل جل السلائف تغيير صلابة المائية. (ب) زيادة تركيز فوتوينيتياتور اللفة يخفض وظيفة البروتين بعد 1 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. زمن التعرض للضوء (ج) زيادة الأشعة فوق البنفسجية يقلل من وظيفة البروتين مع 2 مم اللفة. وتمثل كافة أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ل replicates. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نمط والمائية مرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأمثل للبروتين الزخرفة. مرات التعرض (أ) تقليل الأشعة فوق البنفسجية لتشكيل المائية يسمح للزخرفة السطحية. (ب) زيادة الأشعة فوق البنفسجية مرات التعرض للزخرفة السطحية يزيد قوة نمط. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: خلايا بطانية ردا على نمط VEGF. (أ) "موحدة هوفيكس" المصنفة في الهلاميات المائية. (ب وج) هوفيكس بمعنى أن نمط VEGF وترحيل نحو VEGF المعطل تداولها. وأخذت صور يومين بعد البذر في (ب) 4 X والتكبير X (ج) 10. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. هوفيك-طلبات تقديم العروض (أحمر) ونمط VEGF-488 (الأخضر) ألقي القبض على مع عوامل الإثارة والانبعاثات في 528/553 و 465/495، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: العمليات الحسابية لحلول السلائف الأسهم وجل. المربع الأحمر يشير إلى القيم المعرفة من قبل المستخدم، مثل الوزن الجزيئي، رغبت في تركيزات الأسهم، والجماهير من وزنه. مربعات زرقاء تمثل القيم التي تم حسابها على أساس القيم المعرفة من قبل المستخدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنماط البروتينات النشطة بيولوجيا للتطبيقات البيولوجية. وهناك عدة التعديلات التي يمكن إجراؤها على التكيف مع هذا البروتوكول لتجارب مختلفة. أولاً، سوف تختلف متطلبات مرفق الخليوي لأنواع مختلفة من الخلايا. إذا كان من الملاحظ في البداية مرفق خلية الفقيرة إلى المواد الهلامية، ينصح زيادة تركيز البروتين ECM داخل الحل السلائف. يمكن أن تستخدم بروتينات ECM الأخرى بدلاً من فيبرونيكتين، بما في ذلك أنواع مختلفة من الكولاجين، لامينين، أو مزيج منها. لكل نوع من الخلايا الجديدة، ينبغي أن يكون الأمثل مرفق خلية قبل الزخرفة المائية. كما يسمح هذا البروتوكول فوتوماسكس المصممة من قبل المستخدم. استناداً إلى التطبيق المطلوب، يمكن أن تنتج فوتوماسكس مع ميزة مختلفة الأحجام والأشكال والأنماط العامة. يمكن تجميد موحدة في غياب النبائط.
هذا البروتوكول له قيود معينة. كما أبرز في نتائج الممثل، هذا الأسلوب حساسة لكمية الأشعة فوق البنفسجية في كل خطوة. حدود التعرض المفرط أثناء الخطوة تشكيل المائية مجموعات acrylate المتوفرة لبيوكونجوجيشن السطحية اللاحقة. ولذلك، خطوة أساسية في هذا البروتوكول مرات التعرض للضوء للأشعة فوق البنفسجية المدارة جيدا لكل خطوة. أيضا، يتطلب هذا البروتوكول بمخزون بروتين تركيز عال للزخرفة ناجحة. سيؤدي إلى تركيزات منخفضة من البروتين في أنماط السطح الفقراء. بالإضافة إلى ذلك، هي أيضا تحد فوتوماسكس في ذلك إلا أنها يمكن أن تنتج أنماط منفصلة. أنماط أكثر تعقيداً يمكن أن يتحقق مع نهج مماثلة ولكن تتطلب منهجية أكثر تقدما.
هذا البروتوكول كبير للأساليب القائمة حيث أنه يوفر طريقة بسيطة لتعديل الركازة صلابة والزخرفة البروتين. استخدام الكيمياء أكريلاتي لتشكيل المائية يسمح لمجموعة قوته من صلابة الركيزة داخل نطاق الفسيولوجية. ببساطة تعديل تركيز بيجدا داخل الحل السلائف يعطي السيطرة على صلابة المائية. بالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام الكيمياء انقر للزخرفة البروتين للتصريف السريع بين الركيزة المائية وثيولاتيد تعديل للبروتين. هذه ميزة تصميم رئيسية، كما أنه يتيح هذا البروتوكول تنطبق على أي بروتين أو ببتيد للفائدة.
هي شماعة الهلاميات المائية الحيوية الواعدة التي يمكن استخدامها لاستكشاف مناهج جديدة لعرض الإشارات البيوكيميائية للنظم البيولوجية. ما إذا كان التثبيت السطحية موحدة أو أنماط محددة مكانياً، هذه التقنيات توفير طرق جديدة التحكم في سلوك الخلية. تتحرك إلى الأمام، النهوض بالتكنولوجيا مادة بيولوجية سوف يقدم رؤى جديدة في سلوك الخلية وزيادة قدراتنا على الخص زخارف فيفو في إرسال الإشارات داخل النظم في المختبر . يمكن أن يكون هذا مفيداً لتمايز الخلايا الجذعية، ونمذجة إشارات التنموية داخل نظام تجريبي الخاضعة للرقابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كانت هذه الدراسة أساسا بدعم من المنح المقدمة من "جمعية القلب الأمريكية عالم التنمية المنحة" (12SDG12050083 إلى G.D.)، المعاهد الوطنية للصحة (R21HL102773، R01HL118245 إلى G.D.) والمؤسسة الوطنية للعلوم (كبة-1263455 و CBET-1350240 إلى G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
